低pH蛋白質純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種在含有雜質的溶液中回收和純化膽鹽刺激脂酶（BSSL）的方法，所述方法包括以下步驟：（i）施加BSSL到疏水作用層析（HIC）樹脂；（ii）通過用具有pH范圍從4到5的洗滌制品洗滌所述HIC樹脂去除雜質；以及（iii）從所述HIC樹脂回收BSSL。
【專利說明】低pH蛋白質純化方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及用于純化膽鹽刺激脂酶(BSSL)的方法，所述方法包括在低pH下使用疏水作用層析以及，任選的，在低PH下使用陰離子交換層析。
【背景技術】
[0002]人類哺乳期乳腺和胰腺生產(chǎn)脂解酶，膽鹽刺激脂酶(BSSL)，也被稱作膽鹽激活脂肪酶(BAL)或者羧酸酯脂肪酶(CEL)。BSSL是胰液的主要成分并且負責膽固醇酯以及其他各種飲食中的酯類的水解。該酶在十二指腸液中發(fā)揮它的功能，當酶與膽鹽混合時被激活，酶還在新生兒的消化乳脂中起到重要作用(綜述，參見例如Wang&Hartsuck (1993) Biochim.Biophys Actall66:1-19)。
[0003]來自人乳和人的胰腺的BSSL已經(jīng)被純化和表征，如由Wang (1980; Anal.Biochem.105:398-402) ； Blackberg &Hernell(1981;Eur J Biochem,116:221-225)；ffang&Johnson(1983;Anal.Biochem.133:457-461) ；ffang(1988;Biochem.Biophys.Res.Comm.164:1302-1309)報導。人的 BSSL 的 cDNA 序列被 Nilsson(1990;Eur JBiochem, 192:543-550)鑒定并且在 W091/15234 和 W091/18923 中被公開。
[0004]然而，以前還未公開BSSL能夠通過包括疏水作用層析和/或陰離子交換層析的方法純化，其中在低PH下洗滌層析樹脂。需要用于BSSL的純化的改進的方法，該方法能夠有效地去除雜質例如宿主細胞蛋白(HCP)和DNA，而在同時給予高的產(chǎn)品收率。
[0005]附圖簡要說明
[0006]圖1顯示分別通過純化方法A、B和C在陰離子交換層析(DEAE)之后獲得的產(chǎn)物中宿主細胞蛋白的量(ng/mg)。在圖1-6中，誤差棒顯示置信區(qū)間(95%置信水平)。
[0007]圖2顯示DEAE之后獲得的產(chǎn)物中的DNA的量(pg/mg)。
[0008]圖3顯示疏水作用層析(HIC)之后BSSL的收率(％)。
[0009]圖4顯示HIC之后獲得的產(chǎn)物中的宿主細胞蛋白的量(ng/mg)。
[0010]圖5顯示HIC之后獲得的產(chǎn)物中的DNA的量(pg/mg)。
[0011]圖6顯示DEAE和HIC組合之后BSSL的收率(％)。
[0012]圖7顯示DEAE和HIC組合之后獲得的產(chǎn)物中宿主細胞蛋白的對數(shù)減少。
[0013]圖8顯示DEAE和HIC組合之后獲得的產(chǎn)物中DNA的對數(shù)減少。
[0014]發(fā)明公開內(nèi)容
[0015]意外地發(fā)現(xiàn)，膽鹽刺激脂酶(BSSL)能夠通過疏水作用層析(HIC)甚至在低pH下被有利地純化。雜質，例如宿主細胞蛋白(HCP)和DNA，用這種方法被有效地去除并且獲得更純的產(chǎn)物，同時維持產(chǎn)品收率。尤其，本發(fā)明提供了ー種以下被稱作“方法A”的方法，該方法用于純化BSSL是有用的。方法A包括以下(a)和(b)的組合:(a)陰離子交換層析，其包括在低pH下洗滌柱和在低pH下洗脫BSSL ； (b)疏水作用層析，其包括在低pH下洗滌柱。
[0016]因此，在本發(fā)明的第一方面提供了ー種在含有雜質的溶液中回收和純化膽鹽刺激脂酶(BSSL)的方法，所述方法包括以下步驟:[0017](i)施加BSSL到疏水作用層析(HIC)樹脂；
[0018](ii)通過用具有pH范圍從3.5到5，優(yōu)選從3.5到4.5，以及更優(yōu)選約pH為4的洗滌制品洗滌所述HIC樹脂去除雜質；以及
[0019](iii)從所述HIC樹脂回收BSSL。
[0020]術語“疏水作用層析(HIC)”是本領域眾所周知的并且指的是使用疏水性的性能以分離蛋白質彼此的分離技術。在這種分離中，最初施加具有高離子強度的緩沖液到柱和樣品。緩沖液中的鹽引起蛋白質一致性變化(protein conformance change)和被吸附到介質的疏水區(qū)的暴露。洗脫蛋白質，鹽濃度降低。
[0021]術語“雜質”特指來自用于目標蛋白質的生產(chǎn)的細胞并且將存在于培養(yǎng)基中的宿主細胞蛋白和DNA。
[0022]所述BSSL優(yōu)選為人的BSSL，更優(yōu)選為重組的人的BSSL。重組的人的BSSL能夠通過現(xiàn)有技術中的已知方法生產(chǎn)，例如通過在重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表達，如下面實驗部分的描述。可選地，重組BSSL能夠在其他已知的表達系統(tǒng)中生產(chǎn)，所述其他已知的表達系統(tǒng)例如大腸桿菌(E.coli),如由通過Hansson等人.(1993)J.Biol.Chem.268:26692-26698 描述的;或者巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris),如在W096/37622中公開的。
[0023]在本發(fā)明的優(yōu)選形式中，BSSL的純化方法包括陰離子交換層析步驟，其中在低pH下例如PH4-5下洗滌和洗脫BSSL。因此，本發(fā)明提供如上所述的方法(包括HIC)并且還包括以下步驟:
[0024](i )施加BSSL到陰離子交換樹脂；
[0025](ii)通過用具有pH范圍從4到5，優(yōu)選從`約4.4到約4.6，例如pH4.4或4.5的洗滌制品洗滌所述陰離子交換樹脂去除雜質；以及
[0026](iii)通過用洗脫劑洗脫所述陰離子交換樹脂回收BSSL。優(yōu)選地，所述洗脫劑具有從4到5，優(yōu)選從約4.4到約4.6，例如pH4.4或4.5的pH范圍。
[0027]術語“陰離子交換層析”(AIEX)是本領域眾所周知的并且指的是包括將帶負電的氨基酸結合到固定的陽離子表面的分離技術。通常，通過改變緩沖液的組成，例如用氯化鈉増加離子強度，使得生物分子從陰離子交換器釋放。特別優(yōu)選陰離子交換步驟在HIC步驟之前進行，即，在BSSL被施加于HIC樹脂之前從陰離子交換樹脂中回收BSSL。
[0028]在本發(fā)明的特別優(yōu)選形式中，BSSL純化方法是在實施例中被稱作“方法A”的方法并且該方法包括以下步驟:
[0029](i )施加BSSL到陰離子交換樹脂；
[0030](ii)通過用具有pH范圍從4到5，優(yōu)選從約4.4到約4.6，例如pH4.4或4.5的洗滌制品洗滌所述陰離子交換樹脂去除雜質；
[0031](iii)通過用洗脫劑洗脫所述陰離子交換樹脂回收BSSL，優(yōu)選所述洗脫劑具有pH范圍從4到5，以及更優(yōu)選從約4.4到約4.6，例如pH4.4或4.5 ;
[0032](iv)施加在步驟(iii)中獲得的BSSL到疏水作用層析(HIC)樹脂；
[0033](V)通過用具有pH范圍從3.5到5，優(yōu)選從3.5到4.5，以及更優(yōu)選約pH4的洗滌制品洗滌所述HIC樹脂去除雜質；以及
[0034](vi)從所述HIC樹脂回收BSSL。[0035]本領域技術人員將理解，根據(jù)本發(fā)明的純化方法中能夠包括另外的步驟。例如，一個或多個另外的步驟能夠被包括在“方法A”中在AIEX之前、在AIEX和HIC之間，或者在HIC之后。這種另外步驟的例子包括病毒減少步驟、超濾和透析過濾(UF/DF)，等等。
實施例
[0036]1.重組BSSL的表達
[0037]人的BSSL能夠根據(jù)標準程序通過從含有包括編碼人的BSSL的核苷酸序列的核酸表達系統(tǒng)的重組中國倉鼠卵巣(CHO)細胞表達來制備。簡單地說，包括前導序列的編碼全*hBSSI^々2.3Kb cDNA序列(如Nilsson 等人，1990;Eur J Biochem, 192:543-550 描述的)從 pS146 (Hansson 等人，1993; J Biol Chem, 268:26692-26698)獲得并且被克隆到表達載體pAD-CMVl (Boehringer Ingelheim)-包括用于基因表達的CMV啟動子/SV40多聚腺苷酸(polyA)信號和用于篩選/擴增的dhfr基因的基于pBR的質粒-以形成pAD_CMV_BSSL。
[0038]然后pAD-CMV-BSSL 用于 DHFR-陰性 CHOss 細胞(Boehringer Ingelheim)的轉染-連同編碼新霉素抗性以篩選遺傳霉素(G418)抗性的質粒pBR3127SV/NeopA共轉染-以產(chǎn)生DHFR陽性的產(chǎn)生BSSL的CHO細胞。在條件下培養(yǎng)所得CHO細胞并放大規(guī)模以表達大量的rhBSSL。例如，將來自主細胞庫(master cell bank，MCB)的細胞解凍，使用沒有谷氨酰胺和葡萄糖的Ex-Cell302培養(yǎng)基(SAFC)在搖瓶中擴增，稍后補充谷氨酰胺和葡萄糖，接著在15和IOOL的生物反應器中生長，之后接種700L生產(chǎn)生物反應器，在那里BSSL被組成型地表達和以分批補料エ藝產(chǎn)生。來自細胞培養(yǎng)的收獲材料能夠通過使用深度和絕對過濾器的組合或者通過離心分離澄清。
[0039]2.BSSL的純化(方法A)
[0040]陰離子交換層析
[0041]用Tris 緩沖液(10mM，pH7)稀釋(約 1:1.2，從 17 到 9mS/cm)來自表達 BSSL 的 CHO細胞培養(yǎng)物的澄清的收獲物。將稀釋后的收獲物負載到DEAE瓊脂糖FF?陰離子交換柱(GEHealthcare)。在用Tris緩沖液(25mM，pH7.2)初次洗滌(“第一次洗滌”)之后，用含有25mMこ酸鈉(PH4.5)和50mM氯化鈉的緩沖液洗滌(“第二次洗滌”)柱。逐步從具有含有25mMこ酸鈉(pH4.5)和350mM NaCl的緩沖液的柱中洗脫BSSL。
[0042]病毒滅活
[0043]對于根據(jù)已知方法進行低pH病毒滅活，通過添加甘氨酸-HC1, pH2.5將DEAE池中的pH降到3.5。培養(yǎng)60分鐘后，通過添加0.5M磷酸氫二鈉，pH9將pH増加至Ij 6.3。
[0044]疏水作用層析
[0045]病毒滅活之后，通過添加4M氯化鈉/25mM磷酸鈉(pH6)使BSSL處于約140mS/cm的導電率的條件下。最終氯化鈉的濃度為約1.75M。將樣品負載到苯基瓊脂糖FF?高取代柱(GE Healthcare)。用含有25mM磷酸鈉(pH6)和1.75M氯化鈉的緩沖液洗滌(“第一次洗滌”)柱。然后用25mMこ酸鈉，pH4和1.75M氯化鈉洗滌(“第二次洗滌”)柱。最后用與“第一次洗滌”中相同的緩沖液(25mM磷酸鈉，pH6，和1.75M氯化鈉)洗滌(“第三次洗滌”)柱。然后通過降低電導率(IOmM磷酸鈉，pH6)洗脫BSSL。
[0046]3.BSSL的純化(用于比較的方法B)
[0047]通過與上述方法A —祥的“方法B”純化BSSL，除了在陰離子交換步驟和在HIC步驟中都不包括“第二次洗滌”。另外，在陰離子交換層析期間，使用Tris緩沖液在pH7.2洗脫 BSSL。
[0048]4.BSSL的純化(用于比較的方法C)
[0049]通過與上述方法A —祥的“方法C”純化BSSL，除了下述步驟:
[0050](i)在陰離子交換層析期間，使用Tris緩沖液在pH7.2進行“第二次洗滌”和洗脫步驟；以及
[0051](ii)在HIC期間，使用磷酸鈉緩沖液在pH6進行“第二次洗滌”。
[0052]下面表1和II分別總結了在陰離子交換層析和HIC期間方法A、B和C之間的區(qū)另IJ。
[0053]表1
[0054]BSSL的陰離子交換層析
[0055](CV=柱體積)
[0056]
【權利要求】
1.ー種在含有雜質的溶液中回收和純化膽鹽刺激脂酶(BSSL)的方法，所述方法包括以下步驟: (i)施加BSSL到疏水作用層析(HIC)樹脂；(ii)通過用具有pH范圍從3.5到5的洗滌制品洗滌所述HIC樹脂去除雜質；以及 (iii)從所述HIC樹脂回收BSSL。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述BSSL為人的BSSL。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述BSSL為重組的人的BSSL。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中所述重組的人的BSSL是通過從重組中國倉鼠卵巣(CHO)細胞表達而制備的。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述洗滌制品的pH為從3.5到4.5。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中所述洗滌制品的pH為4。
7.根據(jù)權利要求1-6中任一項所述的方法，所述方法還包括以下步驟: (i)施加BSSL到陰離子交換樹脂； (ii)通過用具有PH范圍從4到5的洗滌制品洗滌所述陰離子交換樹脂去除雜質；以及 (iii)回收BSSL。`
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中BSSL是通過用具有pH范圍從4到5的洗脫劑洗脫所述陰離子交換樹脂回收的。
9.根據(jù)權利要求7或8所述的方法，其中在BSSL被施加到所述HIC樹脂之前從所述陰離子交換樹脂回收BSSL。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，所述方法包括以下步驟: (i)施加BSSL到陰離子交換樹脂； (ii)通過用具有PH范圍從4到5的洗滌制品洗滌所述陰離子交換樹脂去除雜質；以及(iii)通過用具有PH范圍從4到5的洗脫劑洗脫所述陰離子交換樹脂回收BSSL； (iv)施加在步驟(iii)中獲得的BSSL到疏水作用層析(HIC)樹脂； (V)通過用具有pH范圍從3.5到5的洗滌制品洗滌所述HIC樹脂去除雜質；以及 (vi)從所述HIC樹脂回收BSSL。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中在步驟(ii)中的所述洗滌制品具有從4.4到4.6的pH范圍。
12.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中在步驟(iii)中的所述洗脫劑具有從4.4到4.6的pH范圍。
13.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中在步驟(V)中的所述洗滌制品的pH為從3.5到4.5。
14.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中在步驟(V)中的所述洗滌制品的pH為4。
【文檔編號】B01D15/32GK103562383SQ201280023021
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年5月15日 優(yōu)先權日:2011年5月18日
【發(fā)明者】托馬斯·斯特倫奎斯特, 蘇珊娜·伍德 申請人:瑞典孤兒比奧維特魯姆有限公司