生產(chǎn)葡聚糖的新方法、獲得的葡聚糖溶液及用途
【專利摘要】生產(chǎn)一種葡聚糖溶液的微生物學(xué)方法，根據(jù)該方法，用能夠生產(chǎn)葡聚糖的一種細(xì)菌菌株的預(yù)培養(yǎng)物對(duì)一種包含蔗糖的培養(yǎng)基進(jìn)行接種，然后直接回收在發(fā)酵結(jié)束時(shí)獲得的葡聚糖溶液，且無(wú)需隨后的濃縮步驟，其特征在于：-在接種之前，該培養(yǎng)基包含至少10wt.%的蔗糖，-在接種之后，在使得該培養(yǎng)基中的包括在接種之前存在的蔗糖的蔗糖總量是至少16wt.%的條件下，再次添加蔗糖，-獲得的葡聚糖溶液包含至少10wt.%的葡聚糖。獲得的葡聚糖的原溶液以及這種溶液作為絮凝劑的用途。
【專利說(shuō)明】生產(chǎn)葡聚糖的新方法、獲得的葡聚糖溶液及用途
[0001]本發(fā)明的【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及用微生物學(xué)方法獲得的多糖、更具體地為葡聚糖的領(lǐng)域。更精確地，它涉及后者的生產(chǎn)方式及其作為固體顆粒的水性懸浮液的絮凝劑以及作為水性介質(zhì)的增稠劑的用途。
[0003]葡聚糖是將蔗糖通過(guò)稱為葡聚糖蔗糖酶的酶作用轉(zhuǎn)化而得到的長(zhǎng)的復(fù)雜分子，該酶是由細(xì)菌(例如像腸膜明串珠菌，Leuconostoc mesenteroides)分泌的。因此,可以在一種特定的培養(yǎng)基中從上述類型的細(xì)菌培養(yǎng)物中生產(chǎn)葡聚糖。
現(xiàn)有技術(shù)
[0004]已知可以將某些微生物以使得它們產(chǎn)生能夠?qū)⑻寝D(zhuǎn)化為微生物多糖的胞外酶的這樣一種方式進(jìn)行培養(yǎng)。所述多糖包括例如，黃原膠、硬葡聚糖、裂褶菌素、迪特膠、果聚糖、膠凝糖、蘭膠、普魯蘭多糖以及葡聚糖。
[0005]葡聚糖尤其是從培養(yǎng)在補(bǔ)充蔗糖的培養(yǎng)基中的細(xì)菌(例如像腸膜明串珠菌)產(chǎn)生。在實(shí)踐中，葡聚糖是通過(guò)細(xì)菌的葡聚糖蔗糖酶將蔗糖的葡萄糖單體聚合為葡聚糖(多聚葡萄糖)來(lái)獲得的。除了蔗糖之外，培養(yǎng)液通常非窮盡性地還包含:營(yíng)養(yǎng)元素，例如氮源，像銨鹽、尿素、乳和肉蛋白的水解產(chǎn)物(像酪蛋白)、酵母提取物；連同緩沖鹽，例如磷酸鉀或磷酸鈉；礦物質(zhì)，例如鐵、鎂 、鈣、以及錳；維生素以及消泡劑。如已經(jīng)指出的，這種液體培養(yǎng)基構(gòu)成了發(fā)酵培養(yǎng)基，其中細(xì)菌將產(chǎn)生酶并且其中蔗糖將被轉(zhuǎn)化為葡聚糖。
[0006]例如，文獻(xiàn)Karthikeyan (卡菲基恩)等人(用于葡聚糖生產(chǎn)的分批發(fā)酵條件的優(yōu)化)披露了一種用于從蔗糖的腸膜明串珠菌細(xì)菌培養(yǎng)物發(fā)酵中生產(chǎn)葡聚糖的工藝。最終溶液中的葡聚糖的濃度是約13.5wt%。
[0007]文獻(xiàn)SK 286 070披露了一種類似工藝，產(chǎn)生了一種包含約5.3wt%的葡聚糖的溶液。
[0008]文獻(xiàn)DD 226 015披露了一種類似工藝，其中葡聚糖的終濃度約為6.2wt%至
6.3wt%0
[0009]細(xì)菌培養(yǎng)物生產(chǎn)葡聚糖之后通常為將在發(fā)酵后獲得的葡聚糖進(jìn)行純化的至少一個(gè)步驟。純化通常通過(guò)用醇(例如乙醇或異丙醇)沉淀來(lái)進(jìn)行。在這種純化中，可以將細(xì)胞、可降解聚合物的水解酶、以及培養(yǎng)基從葡聚糖中去除。因此它使得獲得具有更好性能(特別是用作礦中的絮凝劑的應(yīng)用)的葡聚糖成為可能。
[0010]因此，文章Production of Dextran by newly isolated strains of Leuconostocmesenteroides PCSIR-4 and PCSIR-9 (通過(guò)新分離的腸膜明串珠菌的菌株P(guān)CSIR-4和PCSIR-9生產(chǎn)葡聚糖)(Turkish Journal of Biochemistry (《生物化學(xué)的土耳其雜志》)-2005; 31(1) ; 21-26)描述了一種利用沉淀和純化的步驟來(lái)生產(chǎn)葡聚糖的方法。描述的純化步驟包括若干子步驟:沉淀、沉淀物的離心或過(guò)濾、洗滌、干燥以及溶解，這使得生產(chǎn)工藝復(fù)雜、漫長(zhǎng)且昂貴。
[0011]這篇文章還傳授了最佳的總蔗糖濃度是10%，并且規(guī)定僅添加一次蔗糖。當(dāng)蔗糖濃度較高時(shí)，觀察到葡聚糖合成受抑制。在這篇文章中，在利用的蔗糖的量為30%時(shí)獲得的葡聚糖濃度是至多約9%。通常，發(fā)酵之后，用微生物學(xué)方法獲得的葡聚糖濃度是大約Iwt.%至7wt.%，最經(jīng)常是 2wt.% 與 5wt.% 之間[Behravan (比和拉文)等人 2003 Biotechnol ApplBiochem (《生物技術(shù)與應(yīng)用生物化學(xué)》)38:267-269]?，F(xiàn)在，采礦業(yè)(包括氧化鋁采礦業(yè))通常利用15wt.%的葡聚糖溶液。因此，這需要對(duì)葡聚糖溶液進(jìn)行濃縮的至少一個(gè)步驟。
[0012]產(chǎn)生的葡聚糖的分子量也是重要的。葡聚糖作為血液中的轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)被廣泛用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在這種情況下，它具有一個(gè)低分子量，在1000g/mol與70000g/mol之間。它還用于增強(qiáng)的油回收、化妝品以及食品領(lǐng)域，其中它充當(dāng)增稠劑。它還用于造紙、鉆井和采礦中，例如應(yīng)用于氧化鋁礦中，其中它充當(dāng)絮凝劑(例如，參見(jiàn)文獻(xiàn)US 3，085，853)。為了達(dá)到作為絮凝劑的良好效率，通常需要高的分子量，通常高于100 OOOg/moL.[0013]有待解決的技術(shù)問(wèn)題 [0014]因此，顯現(xiàn)出葡聚糖的微生物生產(chǎn)是受限的，這是因?yàn)樵诎l(fā)酵之后，在沒(méi)有濃縮步驟的情況下，它不能生產(chǎn)出具有高于10%的葡聚糖濃度的溶液。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有必要對(duì)作為發(fā)酵結(jié)果而產(chǎn)生的葡聚糖進(jìn)行純化，從而獲得在絮凝或稠化中的良好性能。當(dāng)然，純化步驟趨向于增加成品的成本。
[0015]換言之，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是開(kāi)發(fā)一種使得無(wú)需隨后的濃縮步驟來(lái)增加生產(chǎn)濃度成為可能的葡聚糖微生物生產(chǎn)方法。另一個(gè)目的是開(kāi)發(fā)這樣一種生產(chǎn)葡聚糖的方法:該方法不需要隨后的純化步驟，獲得的葡聚糖剛好與純化的葡聚糖一樣有效，尤其是當(dāng)它用作絮凝劑或增稠劑時(shí)。
[0016]本發(fā)明的說(shuō)明
[0017]本發(fā)明目的在于克服前面提及的問(wèn)題。
[0018]因此，本 申請(qǐng)人:已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用微生物學(xué)方法獲得的高濃度的新的葡聚糖溶液，SP，在發(fā)酵之后無(wú)需濃縮步驟的情況下，該葡聚糖溶液的葡聚糖濃度高于IOwt.%，也就是說(shuō)，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程中的聚合參數(shù)實(shí)現(xiàn)。
[0019]具體地講，本 申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)在細(xì)菌的接種之前，在培養(yǎng)基中摻入某個(gè)量的蔗糖，并且在接種之后添加蔗糖來(lái)實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的。
[0020]更精確地講，本發(fā)明涉及生產(chǎn)葡聚糖溶液的微生物學(xué)方法，根據(jù)該方法，用能夠生產(chǎn)葡聚糖的細(xì)菌菌株的預(yù)培養(yǎng)物對(duì)一種包含蔗糖的培養(yǎng)基進(jìn)行接種，然后直接回收在發(fā)酵結(jié)束時(shí)獲得的葡聚糖溶液，且無(wú)需隨后的濃縮步驟。
[0021]該方法的特征在于:
[0022]-接種之前，該培養(yǎng)基包含至少IOwt.%的蔗糖，
[0023]-接種之后，在使得向該培養(yǎng)基中添加的蔗糖(包括在接種之前存在的蔗糖)的總量是至少16wt.%的條件下,再次添加鹿糖，
[0024]-該葡聚糖溶液包含至少IOwt.%的葡聚糖。
[0025]因此，本 申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)至少添加兩次蔗糖使得有可能避免細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制以及酶葡聚糖蔗糖酶的活性的抑制的現(xiàn)象。
[0026]而且，在接種之后，在使得蔗糖(包括在接種之前存在的蔗糖)的總量是至少16wt.%的條件下,再次添加鹿糖。
[0027]根據(jù)本發(fā)明，接種之后，蔗糖的添加可以是連續(xù)的或不連續(xù)的。[0028]當(dāng)接種之后，進(jìn)行若干次蔗糖的添加時(shí)，有利地為至少兩次。
[0029]至少兩次的添加有必要是分開(kāi)的添加。然而，每次添加可以瞬時(shí)地或連續(xù)地進(jìn)行，直到已經(jīng)引入了所希望的量。將這兩種可能性結(jié)合也是可能的。
[0030]換言之，每次添加是瞬時(shí)地或連續(xù)地進(jìn)行，或第一次添加是連續(xù)地進(jìn)行而第二次添加是瞬時(shí)地進(jìn)行，或反之亦然，直到已經(jīng)引入了所希望的量。
[0031]為了進(jìn)一步改進(jìn)該葡聚糖溶液的終濃度，添加的蔗糖(包括存在于補(bǔ)加培養(yǎng)基中的鹿糖)的總量是至少20wt.%,優(yōu)選25wt.%。
[0032]該葡聚糖溶液優(yōu)選包含至少14wt.%的葡聚糖，并且更優(yōu)選地至少18wt.%的葡聚糖。
[0033]根據(jù)本發(fā)明，能夠產(chǎn)生葡聚糖的菌株是明串珠菌屬(Leuconostoc)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)或醋酸桿菌屬(Acetobacter)的菌株。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，它是腸膜明串珠菌的菌株，具體是菌株NRRL B 1299,NRRL B 742,NRRLB-512 F、NRRL B 523、V_2317 D、KCTC 3505、ZDRAVLJE SR.P0
[0034]因此，本發(fā)明的方法使得有可能在無(wú)需濃縮步驟的情況下，即，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)直接地獲得具有高于IOwt.%、非常優(yōu)選是高于14wt.%并且甚至更優(yōu)選是高于18wt.%的濃度的葡聚糖溶液。
[0035]獲得的葡聚糖溶液基本上不需進(jìn)行純化，包括直到使用的時(shí)候。換一種表達(dá)方式，在這種情況下，細(xì)胞材料和/或發(fā)酵培養(yǎng)基未與該葡聚糖溶液分離。換言之，它可以包含一些或所有的細(xì)胞材料和發(fā)酵培養(yǎng)基。具體地講，該溶液可以包含細(xì)菌、酶、連同培養(yǎng)液的鹽和元素。
[0036]為了促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，增加培養(yǎng)基的充氧量的水平。在實(shí)踐中，在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)的充氧量(oxygenation)大約為0.25vvm,發(fā)酵開(kāi)始時(shí)是希望微生物在其期間進(jìn)行增殖的一個(gè)步驟。其次，減少充氧量以促進(jìn)酶的形成及其活性，并且因此促進(jìn)蔗糖到葡聚糖的生物聚合反應(yīng)。在實(shí)踐中，例如將充氧量降低至大約0.1vvm的值。
[0037]單位vvm對(duì)應(yīng)于:相對(duì)于在其中進(jìn)行葡聚糖生產(chǎn)的反應(yīng)器的填充體積而言向培養(yǎng)基中引入的空氣的體積。
[0038]如稍后將看到的，生產(chǎn)的葡聚糖具有高的分子量。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基是相當(dāng)粘稠的。發(fā)酵培養(yǎng)基的攪拌必須是充分的，以確保酶葡聚糖蔗糖酶與蔗糖之間的質(zhì)量傳遞，并且因此促進(jìn)整個(gè)發(fā)酵罐的發(fā)酵的同質(zhì)性。在實(shí)踐中，將發(fā)酵培養(yǎng)基在100rev/min與1000rev/min之間進(jìn)行攪拌,優(yōu)選在200rev/min與500rev/min之間。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠結(jié)合微生物的生長(zhǎng)、由攪拌產(chǎn)生的氧濃度以及蔗糖消耗來(lái)完美地調(diào)節(jié)這個(gè)參數(shù)。
[0039]從現(xiàn)有技術(shù)已知，發(fā)酵將一定比例的蔗糖轉(zhuǎn)化為酸，這導(dǎo)致pH的下降，通常從7.2下降至4.3。觀察到三個(gè)階段:
[0040]-第一階段，在此期間將pH調(diào)節(jié)至7.2，微生物生長(zhǎng)的最佳條件；
[0041]-第二階段，在此期間將pH調(diào)節(jié)至6.6，酶形成的最佳條件；
[0042]-第三階段，在此期間將pH調(diào)節(jié)至5.2，葡聚糖形成的最佳條件。
[0043]為了優(yōu)化這3個(gè)階段，常規(guī)地通過(guò)氫氧化鈉或氨的受控連續(xù)添加來(lái)調(diào)節(jié)pH，從而將PH控制至7.2、或6.6或5.2的恒定值。這個(gè)操作需要昂貴的專用設(shè)備。
[0044]本 申請(qǐng)人:出人意料地發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)添加比通常所用量大得多的一定量的緩沖液來(lái)控制pH，不受限制并且無(wú)需額外的設(shè)備。
[0045]更精確地，將初始pH升高至高于7.5的值，優(yōu)選高于8。然后，根據(jù)本發(fā)明，借助大量的一種或多種緩沖鹽來(lái)控制PH的下降。具體而言，在發(fā)酵過(guò)程中，通常利用0.1wt.%的量的緩沖鹽(例如磷酸氫二鈉或磷酸氫二鉀)，然而根據(jù)本發(fā)明，添加的至少一種緩沖鹽的量為至少0.5wt.%，有利地為至少Iwt.%，優(yōu)選至少2wt.%。這使得有可能控制pH的下降并且優(yōu)化微生物的生長(zhǎng)(最佳pH為7.2)和酶的形成(最佳pH為6.6)、以及葡聚糖的形成(最佳pH為5.2)的階段的持續(xù)時(shí)間，同時(shí)不受通過(guò)添加氫氧化鈉或氨型的堿的溶液來(lái)對(duì)三種不同PH值進(jìn)行設(shè)計(jì)并調(diào)節(jié)的限制。
[0046]也可以使用其他緩沖鹽，例如磷酸銨、硼酸鈉或檸檬酸鈉。
[0047]盡管最佳生長(zhǎng)在pH7.2處，但是如已經(jīng)提及的，發(fā)現(xiàn)以pH8.0的起始pH獲得了令人滿意的生長(zhǎng)率。在這個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在PH8.0處開(kāi)始發(fā)酵。它允許從發(fā)酵一開(kāi)始就積累葡聚糖，因此獲得高于IOwt.%、優(yōu)選高于14wt.%、并且更優(yōu)選高于18wt.%的最終的葡聚糖濃度。
[0048]有利的是，在pH高于5、優(yōu)選5.4、任選5.3處停止發(fā)酵，這高于常規(guī)的4.5-4.8的值。本 申請(qǐng)人:出人意料地發(fā)現(xiàn)，在pH5.4、任選5.3處停止發(fā)酵使得改進(jìn)由此生產(chǎn)的葡聚糖溶液的絮凝和稠化性能成為可能。而且，以在PH5.4、任選5.3處停止發(fā)酵形成并獲得的葡聚糖對(duì)應(yīng)于最大粘度的葡聚糖。
[0049]在實(shí)踐中，進(jìn)行培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化的溫度在15°C與35°C之間。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，初始溫度是在25°C 與35°C之間，持續(xù)4h與8h之間的時(shí)期，這使得優(yōu)化微生物的生長(zhǎng)成為可能。然后，降低溫度并且在18°C與24°C之間，持續(xù)發(fā)酵的剩余時(shí)間，即，持續(xù)10小時(shí)與30小時(shí)之間的時(shí)期，以用于優(yōu)化酶和葡聚糖的形成。
[0050]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，并且與通常的技術(shù)相反，包括細(xì)菌菌株的生產(chǎn)、酶的生產(chǎn)以及葡聚糖的生產(chǎn)的步驟在內(nèi)的發(fā)酵是在同一反應(yīng)器中進(jìn)行，這簡(jiǎn)化了生產(chǎn)。
[0051]相當(dāng)出人意料地，并且與常規(guī)實(shí)踐相反，該方法可以在基本上未滅菌的反應(yīng)器中進(jìn)行。
[0052]有利的是:
[0053]-在使用之前，用具有低于Iμ m、優(yōu)選小于或等于0.3μπι的直徑的過(guò)濾器將水預(yù)過(guò)濾；
[0054]-在使用之前，用具有低于0.5 μ m、優(yōu)選小于或等于0.3 μ m的直徑的過(guò)濾器將空氣預(yù)過(guò)濾；
[0055]-接種物比例是在0.5與30之間，優(yōu)選在I與20之間，非常優(yōu)選在5與10之間。接種物比例對(duì)應(yīng)于向發(fā)酵罐中添加的預(yù)培養(yǎng)溶液占發(fā)酵罐中總體積的體積百分比。
[0056]根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的葡聚糖的分子量在100 000g/mol與5億g/mol之間變化。優(yōu)選地，它高于500 000g/mol并且非常優(yōu)選在I百萬(wàn)g/mol與5千萬(wàn)g/mol之間。
[0057]因此，本發(fā)明還涉及可以通過(guò)以上所述的方法獲得的以下基本上未純化的葡聚糖原溶液，該原溶液包含至少IOwt.%、有利地為至少14wt.%、優(yōu)選至少18wt.%的具有在100000g/mol與5億g/mol之間的分子量的葡聚糖。
[0058]表述“葡聚糖原溶液”指代在補(bǔ)加有蔗糖的情況下對(duì)以上所說(shuō)明的種類的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行發(fā)酵時(shí)在結(jié)束時(shí)獲得的葡聚糖溶液，該溶液在發(fā)酵結(jié)束時(shí)既沒(méi)有基本上被純化，也沒(méi)有被濃縮。所以，該葡聚糖溶液像現(xiàn)在這樣在該溶液中有雜質(zhì)的存在下來(lái)使用。這些雜質(zhì)具體是細(xì)菌細(xì)胞、溶解的細(xì)胞的組分(包括脂類、蛋白以及核酸)、酶、培養(yǎng)基的鹽、未轉(zhuǎn)化的蔗糖、其他糖(例如單糖，像果糖、二糖以及寡糖)、緩沖鹽、寡肽、有機(jī)酸(例如乳酸或氨基酸)、連同培養(yǎng)基的其他成分。
[0059]根據(jù)本發(fā)明，該葡聚糖原溶液包含至少2wt.%、優(yōu)選至少5wt.%、有利地為至少8wt.%的雜質(zhì)，尤其是以上說(shuō)明的一些或全部的雜質(zhì)。雜質(zhì)的濃度通過(guò)從該原溶液的干物質(zhì)的總濃度中減去葡聚糖濃度來(lái)測(cè)量。
[0060]在用3體積的甲醇對(duì)該原溶液進(jìn)行沉淀并且將沉淀物在105°C下過(guò)夜干燥之后，通過(guò)重量分析法測(cè)量葡聚糖濃度。將葡聚糖原溶液在105 °C下過(guò)夜干燥之后，通過(guò)重量分析法測(cè)量總的干物質(zhì)。
[0061]本發(fā)明還涉及以上所定義的葡聚糖原溶液作為固體顆粒的水性懸浮液的絮凝劑、凝結(jié)劑、沉淀劑、沉降劑或傾析劑，亦或作為水性介質(zhì)的增稠劑的用途。
[0062]更精確地講，根據(jù)本發(fā)明的葡聚糖溶液可以在需要將水與固體顆粒分離的許多工藝中使用，這些固體顆?？梢允巧镌础⒂袡C(jī)源或礦物源的。例如，我們可以提及，用于處理城市廢水和工業(yè)廢水的工藝，用于顆粒的絮凝、凝結(jié)和沉淀的工藝，以及用于礦業(yè)流出物的流變學(xué)修飾和抗塵操作的工藝。這里的例子尤其是用于從通過(guò)拜爾法(Bayer process)提取氧化鋁而得到的水合氧化鋁的絮凝，或用于從浙青砂的開(kāi)采而得到的流出物的絮凝。該葡聚糖溶液還可以用作礦物晶體的生長(zhǎng)修飾劑。
[0063]拜爾法用于通過(guò)將鋁礬土溶解于極端堿性的水性溶液中而從鋁礬土中提取氧化鋁。在溶解結(jié)束時(shí)，獲得由水和礦物顆粒(包括水合氧化鋁)組成的泥、或消解物。
[0064]如已經(jīng)提及的，根據(jù)本發(fā)明的葡聚糖原溶液還可以用作水性介質(zhì)的增稠劑并且尤其用于增強(qiáng)的油回收和化妝品領(lǐng)域中。
[0065]取決于懸浮液的性質(zhì)和葡聚糖的分子量，用于這些應(yīng)用的葡聚糖的濃度可以不同。通常，所述量在Ig/噸的總固體至1000g/噸之間變化。優(yōu)選地，使用的量在5g/噸與500g/噸的總固體之間變化。
[0066]對(duì)于這些應(yīng)用，葡聚糖的分子量是相對(duì)高的。根據(jù)本發(fā)明的具有高于100 OOOg/mol的分子量的葡聚糖給出了良好的結(jié)果。然而,具有至少500 000g/mol、優(yōu)選I百萬(wàn)g/mol與5千萬(wàn)g/mol之間的分子量的那些是優(yōu)選的。在實(shí)踐中，分子量將不超過(guò)5億g/mol。
[0067]還相當(dāng)出人意料的是，用基本上未純化的葡聚糖在固體顆粒的水性懸浮液的絮凝中獲得了極好的結(jié)果。實(shí)際上，通常認(rèn)為培養(yǎng)基的雜質(zhì)和有機(jī)材料(例如細(xì)菌、酶、鹽以及發(fā)酵培養(yǎng)基的有機(jī)組分)對(duì)于此類型的應(yīng)用是不希望的，因?yàn)樗鼈兘档托跄阅?。但是出人意料地，即使它基本上是未純化的，但是本發(fā)明的葡聚糖溶液是有效的。
[0068]在此類型的應(yīng)用中，可以將葡聚糖溶液與任何其他常規(guī)使用的添加劑進(jìn)行組合，這些添加劑例如水溶性聚合物，并且尤其是基于丙烯酰胺、丙烯酸酯、異羥肟酸、多胺、或二烯丙基二甲基氯化銨的那些。
[0069]本發(fā)明以及來(lái)源于它的優(yōu)點(diǎn)將從以下實(shí)例中變得清楚。
[0070]在這些實(shí)例和在本說(shuō)明書中，使用的術(shù)語(yǔ)具有以下定義。
[0071]術(shù)語(yǔ)接種意指將一定量的微生物水性懸浮液轉(zhuǎn)移至大量的水性介質(zhì)中以允許這些微生物更大量地發(fā)育并且增殖。[0072]術(shù)語(yǔ)瓊脂指代通常用于皮氏培養(yǎng)皿(Petri dish)中的液體培養(yǎng)基的膠凝并且充當(dāng)用于微生物發(fā)育的基質(zhì)的化合物。
[0073]術(shù)語(yǔ)MRS培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)于一種常規(guī)使用的培養(yǎng)基，其構(gòu)成如下(/升水性制品):
[0074]-蛋白胨10.0g
[0075]-肉膏8.0g
[0076]-酵母提取物4.0g
[0077]-葡萄糖20.0g
[0078]-三水合乙酸鈉5.0g
[0079]-檸檬酸銨2.0g
[0080]-吐溫80 lml
[0081]-磷酸氫鉀2.0g
[0082]-七水合硫酸鎂0.2g
[0083]-四水合硫酸錳0.05g
[0084]實(shí)例1:無(wú)需濃縮步驟并且無(wú)需純化的高濃度的葡聚糖溶液的生產(chǎn)
[0085]將短于一周的腸膜明串珠菌B512的新鮮培養(yǎng)物接種于MRS培養(yǎng)基中，其中20g的葡萄糖已經(jīng)被20g的蔗糖替換，補(bǔ)加有20g/L的瓊脂、100ml的沒(méi)有瓊脂的相同的培養(yǎng)基，預(yù)先在121°C下滅菌20min。在伴隨150rpm的攪拌下，將此培養(yǎng)物在30°C下培育24h。然后，將此預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至5L的沒(méi)有瓊脂的相同的已滅菌培養(yǎng)基中。將它以同樣的方式進(jìn)行培育，并且然后將其轉(zhuǎn)移至100L的沒(méi)有瓊脂的相同的已滅菌培養(yǎng)基中。在2000L的已滅菌培養(yǎng)基中進(jìn)行同樣的操作。將這個(gè)最后的預(yù)培養(yǎng)物接種于14000L的水中，該水包含沒(méi)有瓊脂、補(bǔ)加有16wt.%蔗糖、2.25%磷酸氫二鉀以及0.05%Rhodorsil481消泡劑的相同的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基未滅菌但是將水事先在0.22 μ m下進(jìn)行過(guò)濾。在30°C下發(fā)酵5h并且連續(xù)添加0.25vvm的在0.22 μ m下進(jìn)行過(guò)濾的空氣之后，將溫度降至22°C。發(fā)酵1Oh之后，將它降至
0.1vvm的空氣并且添加6%的蔗糖，并且在14h之后，再次添加6%的蔗糖。發(fā)酵15h之后，停止通氣。18h之后，在發(fā)酵液中獲得18.6%的葡聚糖干物質(zhì)，該發(fā)酵液包含生物質(zhì)以及其他雜質(zhì)。
[0086]實(shí)例2:葡聚糖的純化
[0087]將50kg的從根據(jù)實(shí)例1的發(fā)酵獲得的葡聚糖原溶液進(jìn)行稀釋，并且與200kg的去離子水混合。將此混合物在具有500kD的截止值的中空聚砜纖維類型的超濾膜上通過(guò)透析進(jìn)行切線過(guò)濾，從而去除來(lái)自該培養(yǎng)基的所有鹽類以及其他雜質(zhì)。穿過(guò)膜的發(fā)酵培養(yǎng)基的鹽被包含在濾液(穿過(guò)過(guò)濾器的那些)中。經(jīng)由滲余物(沒(méi)有穿過(guò)過(guò)濾器的那些)的再循環(huán)將葡聚糖濃縮直至葡聚糖的初始體積。
[0088]再次將50kg的滲余物用200kg的去離子水進(jìn)行稀釋，并且再次通過(guò)透析過(guò)濾和再循環(huán)進(jìn)行濃縮，直到以69.2%的產(chǎn)率獲得44kg的被純化至14.7%濃度的葡聚糖。
[0089]實(shí)例3:未純化的葡聚糖相對(duì)于純化的葡聚糖的效力
[0090]將參照品純化的葡聚糖以及來(lái)自實(shí)例1和2的那些在500ml的去離子水中稀釋至
0.1%的活性物質(zhì)的濃度。使用磁棒將它們?cè)跀嚢璋迳蟿×覕嚢?0min。
[0091]平行地，為了去除由拜爾法獲得的消解物中的水合氧化鋁的濃縮物中的變化，進(jìn)行以下操作。將80g的從氧化鋁礦或消解物(直接取自氧化鋁采礦工廠)中獲得的干燥的水合氧化鋁混合于I升的拜爾液(Bayer liquor)中，然后過(guò)濾以去除水合氧化鋁。
[0092]使用放置于加熱至65°C的浴中的1000-ml刻度量筒進(jìn)行測(cè)試。相對(duì)于水合氧化鋁的量，以從2g/t至20g/t活性物質(zhì)的比率添加葡聚糖。因?yàn)橐粋€(gè)礦井與另一個(gè)礦井、并且在同一個(gè)礦井中某天與第二天的水合氧化鋁的濃度會(huì)變化，因此這個(gè)裝置被廣泛地用于工業(yè)中。所以，相對(duì)于水合氧化鋁的量來(lái)調(diào)節(jié)葡聚糖的量是必要的。
[0093]在從1000ml至700ml的范圍內(nèi)，以m/s來(lái)測(cè)量沉降速率。這是澄清的上清液與濃縮的懸浮液之間的分離的水平面從1000ml刻度到700ml所用的時(shí)間。
[0094]在沉降15min之后，通過(guò)確定獲得的上清液的干物質(zhì)的量來(lái)評(píng)估上清液的澄清度:從刻度量筒中取出100ml的上清液，然后過(guò)濾、干燥(在105°C下2小時(shí))，并且對(duì)上清液稱重。
[0095]通過(guò)觀察量筒底部的沉積物對(duì)壓實(shí)度進(jìn)行評(píng)估，并且10分鐘之后借助刻度量筒進(jìn)行測(cè)量。所有的測(cè)試進(jìn)行三次并且得到平均值。
[0096]結(jié)果:
[0097]A.中國(guó)廬山的氧化鋁礦
【權(quán)利要求】
1.生產(chǎn)一種葡聚糖溶液的微生物學(xué)方法，根據(jù)該方法，用能夠生產(chǎn)葡聚糖的一種細(xì)菌菌株的預(yù)培養(yǎng)物對(duì)一種包含蔗糖的培養(yǎng)基進(jìn)行接種，然后直接回收在發(fā)酵結(jié)束時(shí)獲得的葡聚糖溶液，無(wú)需隨后的濃縮步驟，其特征在于: -在接種之前，該培養(yǎng)基包含至少IOwt.%的鹿糖， -在接種之后，在使得該培養(yǎng)基中的包括在接種之前存在的蔗糖的蔗糖總量是至少16wt.%的條件下,再次添加鹿糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于接種之后，向該培養(yǎng)基中連續(xù)地或不連續(xù)地添加蔗糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于接種之后，至少添加兩次蔗糖。
4.根據(jù)以上權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于添加的包括存在于補(bǔ)加培養(yǎng)基中的鹿糖的鹿糖總量是至少20wt.%,優(yōu)選至少25wt.%。
5.根據(jù)以上權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)將pH固定在值8處，然后在高于5的值處停止反應(yīng)。
6.根據(jù)以上權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于在發(fā)酵過(guò)程中，添加至少0.5wt.%的至少一種緩沖鹽，有利地為至少Iwt.%、優(yōu)選至少2wt.%的鹽。
7.根據(jù)以上權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于該細(xì)菌菌株是腸膜明串珠菌B512的菌株。
8.根據(jù)以上權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行包括該細(xì)菌菌株的生產(chǎn)、酶的生產(chǎn)以及葡聚糖的生產(chǎn)的步驟在內(nèi)的發(fā)酵。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于該反應(yīng)器基本上是未滅菌的。
10.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1至9之一所述的過(guò)程可獲得的包含至少14wt.%、有利地為至少18wt.%的葡聚糖的基本上未純化的葡聚糖原溶液。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的葡聚糖原溶液，其特征在于它包含至少2wt.%、優(yōu)選至少5wt.%、有利地為至少8wt.%的雜質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11之一所述的葡聚糖原溶液，其特征在于，該葡聚糖的分子量在100000g/mol與5億g/mol之間，有利地為500000g/mol并且優(yōu)選是在I百萬(wàn)g/mol與5千萬(wàn)g/mol之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求11至12之一所述的葡聚糖原溶液作為固體顆粒的水性懸浮液的絮凝劑、凝結(jié)劑、沉淀劑、沉降劑或傾析劑，亦或作為水性介質(zhì)的增稠劑的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求11至12之一所述的葡聚糖原溶液作為從氧化鋁提取得到的水合氧化鋁的一種絮凝劑的用途。
【文檔編號(hào)】B01D21/01GK103620048SQ201280031033
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月1日
【發(fā)明者】馬爾科·威澤 申請(qǐng)人:S.P.C.M.股份公司