具有親水性涂層的多孔膜及其制備和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了一種包含接枝到多孔膜的聚合親水性涂層的改性多孔膜。所述接枝到多孔膜的聚合親水性涂層包含例如PEG部分，例如PEGMA、PEGDA或TMPET，其中在多孔膜上的所述聚合親水性涂層降低不期望的材料與多孔膜的非特異性結(jié)合并且在免疫測(cè)定、體外診斷測(cè)試和護(hù)理點(diǎn)測(cè)試中提高信號(hào)與噪聲比。還公開了制備這些改性多孔膜的方法。
【專利說(shuō)明】具有親水性涂層的多孔膜及其制備和使用方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用 本申請(qǐng)要求2011年12月30日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?3/340, 793和2012年1月31 日提交的13/362, 793的優(yōu)先權(quán)；它們的公開內(nèi)容通過(guò)引用而全文結(jié)合到本文中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本公開總體涉及永久接枝親水性涂層的多孔膜，使得與多孔膜的非特異性結(jié)合最 小化，該多孔膜用于在多孔膜上固定一種或多種特定的生物分子供進(jìn)一步分析。還描述了 制備和使用具有這些親水性涂層的改性多孔膜的方法。
[0003] 背景 多孔膜（例如硝化纖維素膜）常規(guī)地用于多種過(guò)程，包括需要固定一種或多種生物分 子的生物學(xué)應(yīng)用。這些生物分子包括但不限于蛋白質(zhì)（例如，抗體）和核酸（例如，脫氧核 糖核酸（DNA)和核糖核酸（RNA))。本領(lǐng)域描述了能夠既固定關(guān)注的特定生物分子又同時(shí)使 干擾性能的各種分子的非特異性結(jié)合最小化的膜，所述性能為例如免疫測(cè)定、體外診斷測(cè) 試（特別是護(hù)理點(diǎn)診斷方法）和在生物學(xué)樣品（例如，血液、尿、唾液、痰、其它身體分泌物、 細(xì)胞和組織樣品）中分析物或生物分子分離的性能。發(fā)現(xiàn)這樣的膜用于多種生物學(xué)過(guò)程和 醫(yī)療技術(shù)。
[0004] 硝化纖維素膜呈現(xiàn)硝化纖維素膜和生物分子之間基本上非特異性的相互作用。研 究人員傳統(tǒng)上依賴該被動(dòng)關(guān)聯(lián)作為在多種"捕集"類型固定方法中使用硝化纖維素膜的基 礎(chǔ)。然而，對(duì)硝化纖維素膜和關(guān)注的生物分子之間的該被動(dòng)相互作用的依賴導(dǎo)致在許多生 物學(xué)應(yīng)用中成功使用硝化纖維素膜的復(fù)雜化。該技術(shù)必然限制可在硝化纖維素膜上固定的 生物分子的量，同樣有問(wèn)題的是，還允許不期望的分子（例如，不是關(guān)注的生物分子）與硝 化纖維素膜的非特異性結(jié)合。降低非特異性結(jié)合將允許提高關(guān)注的生物分子與硝化纖維素 膜的特異性結(jié)合并且還降低信號(hào)（例如，期望的生物分子與硝化纖維素膜的期望的結(jié)合） 與噪聲（例如，不期望的材料與硝化纖維素的非特異性結(jié)合）比。降低信號(hào)與噪聲比將提 高例如免疫測(cè)定、體外診斷測(cè)試（特別是護(hù)理點(diǎn)診斷方法）和在生物學(xué)樣品（例如，血液、 淋巴、尿、唾液、痰、其它身體分泌物、細(xì)胞和組織樣品）中分析物或生物分子與其它材料的 分離方法的性能和靈敏度。本領(lǐng)域中描述了在例如免疫測(cè)定中降低信號(hào)與噪聲比。
[0005] 本領(lǐng)域需要將多孔膜改性（例如，化學(xué)改性）的新的組合物和方法，以改進(jìn)關(guān)注的 生物分子（例如，蛋白質(zhì)和核酸）與多孔膜基底的固定和結(jié)合。這樣的改性多孔膜（包括 改性的硝化纖維素膜）適用于例如免疫測(cè)定、體外診斷測(cè)試（例如，護(hù)理點(diǎn)診斷應(yīng)用）和在 生物學(xué)樣品中分離關(guān)注的生物分子的技術(shù)。本領(lǐng)域需要涂布有化合物以降低與膜的非特異 性結(jié)合的多孔膜，更特別是硝化纖維素膜。這樣的膜將改進(jìn)例如許多免疫測(cè)定的性能和靈 敏度。
[0006] 本領(lǐng)域需要將多孔膜（例如，硝化纖維素膜）改性（例如，化學(xué)改性）以降低不期 望的材料與多孔膜基底的非特異性結(jié)合的新方法。涂布有化合物以降低與膜的非特異性結(jié) 合的多孔膜（更特別是硝化纖維素膜）將是有利的。相對(duì)于在使用未改性的多孔（例如， 硝化纖維素膜）實(shí)施的免疫測(cè)定中觀察到的，通過(guò)降低與膜的非特異性結(jié)合，通過(guò)潛在地 消除對(duì)于例如在免疫測(cè)定中使用以使非特異性結(jié)合最小化的傳統(tǒng)阻斷劑的需要，和通過(guò)提 高信號(hào)與噪聲比，這樣的膜將改進(jìn)例如許多免疫測(cè)定的性能和靈敏度。
[0007] 概述 本文描述改性多孔膜，特別是硝化纖維素膜。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，硝化纖維素 膜包含與硝化纖維素膜鍵合的聚合親水性涂層。聚合親水性涂層通常與硝化纖維素膜永久 (例如，共價(jià)）鍵合。聚合親水性涂層可通過(guò)任何方法與硝化纖維素膜鍵合，包括通過(guò)使多 孔（例如，硝化纖維素）膜暴露于電子束（電子束）輻射。
[0008] 本文的組合物包括改性多孔膜，例如硝化纖維素膜，其包含通常與膜永久鍵合的 聚合親水性涂層。所述組合物適用于依賴一種或多種生物分子例如蛋白質(zhì)（例如，抗體） 和核酸（例如，DNA或RNA)與多孔膜（包括但不限于硝化纖維素膜）結(jié)合的方法。在特定 的方面，所述組合物用于免疫測(cè)定、體外診斷測(cè)試、從生物學(xué)樣品（例如，血液、尿、唾液、痰 和細(xì)胞或組織的樣品）鑒定或分離關(guān)注的生物分子的技術(shù)，和需要在多孔膜基底（如硝化 纖維素膜）上固定生物分子的各種其它生物學(xué)方法。多孔膜（特別是硝化纖維素膜）包含 與膜鍵合的聚合親水性涂層，其中所述膜降低不期望的材料與多孔膜（更特別是硝化纖維 素膜）的非特異性結(jié)合。在本文描述的硝化纖維素膜上的聚合親水性涂層可包括但不限于 聚乙二醇（PEG)部分、聚乙烯醇、羥基、帶負(fù)電荷的離子基團(tuán)、帶正電荷的離子基團(tuán)、兩性離 子基團(tuán)，或它們的任何組合。
[0009] 附圖 當(dāng)參考附圖，閱讀以下詳細(xì)說(shuō)明時(shí)，化學(xué)改性的多孔膜的這些和其它特征、方面和優(yōu)點(diǎn) 將變得更好理解，其中由始至終在附圖中，相似的符號(hào)代表相似的部件，其中： 圖1示意性表示通過(guò)電子束輻射在硝化纖維素膜上的聚合親水性涂層的機(jī)構(gòu)。
[0010] 圖2提供使用本文描述的改性多孔膜的受孕測(cè)試的結(jié)果。測(cè)定的細(xì)節(jié)和結(jié)果的解 釋在實(shí)施例4中陳述。
[0011] 詳述 本文提供包含至少一個(gè)與多孔膜（例如，硝化纖維素膜）鍵合的聚合親水性涂層的改 性多孔膜（特別是硝化纖維素膜）。多孔膜（例如硝化纖維素膜）傳統(tǒng)上用于在多孔固體 基底上固定生物分子（例如，DNA、RNA或蛋白質(zhì)）。本文使用的術(shù)語(yǔ)"改性"，特別是提及所 公開的多孔膜（例如，硝化纖維素膜）時(shí)，旨在包括對(duì)膜的任何改變，例如，對(duì)初始的未改性 的膜的化學(xué)改變。本發(fā)明的"改性"多孔膜（例如，硝化纖維素膜）可為包含通過(guò)電子束輻 射接枝到硝化纖維素膜的聚合親水性涂層的硝化纖維素膜，如以下描述。親水性涂層包含 例如聚乙二醇部分、聚乙烯醇、羥基、帶負(fù)電荷的離子基團(tuán)、帶正電荷的離子基團(tuán)、兩性離子 基團(tuán)，或它們的任何組合。在某些方面，聚合親水性涂層包含PEG部分，例如PEGMA、PEGDA 或TMPET。本公開包括所有分子量的PEG部分。
[0012] 包含聚合親水性涂層的示例性改性多孔膜的示意圖在以下提供并且在圖1中陳 述。如圖中所示，在某些方面，本公開的多孔膜具有式（I)的結(jié)構(gòu)，其包括接枝到多孔膜（例 如，硝化纖維素膜）的聚合親水性涂層，其中所述聚合物親水性涂層包含：1)電子（電子 束）反應(yīng)性部分的可變長(zhǎng)度鏈單體的聚合物（標(biāo)記為聚（A)x，其中X為存在的聚合物的數(shù) 量，并且范圍為1、2、3、4,持續(xù)到包括所有整數(shù)；2)在（聚（A)x)之間形成鍵合的鍵；和3) 標(biāo)記為B基團(tuán)的官能團(tuán)，其促進(jìn)與化學(xué)基團(tuán)（例如，在關(guān)注的生物分子上存在的胺基）的反 應(yīng)，從而促進(jìn)在多孔膜上固定生物分子。聚合親水性涂層（例如，在以下示意圖中標(biāo)記的 "聚（A)x_鍵-B"）包含數(shù)個(gè)組分（例如，聚（A)x聚合物、鍵和官能部分B)，并且接枝（例 如，共價(jià)鍵合）到多孔膜。參見(jiàn)以下和圖1關(guān)于聚合親水性涂層的組分和功能的更詳細(xì)的 描述。
[0013] 為了更清楚和簡(jiǎn)明地描述和指出要求保護(hù)的本發(fā)明的主題，對(duì)于用于以下說(shuō)明和 所附權(quán)利要求的特定術(shù)語(yǔ)提供以下定義。在整個(gè)說(shuō)明書中，特定術(shù)語(yǔ)的舉例應(yīng)看作是非限 制性實(shí)例。
[0014] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"非特異性結(jié)合"指在多孔膜（例如，硝化纖維素膜）上生物分子 的連接，其通過(guò)生物分子和膜的被動(dòng)相互作用而發(fā)生，并且獨(dú)立于生物分子和膜之間的任 何特定的主動(dòng)相互作用。"非特異性結(jié)合"還通常稱為與多孔膜（特別是硝化纖維素膜）的 "背景結(jié)合"。非特異性結(jié)合的一個(gè)實(shí)例包括僅由在溶液中隨機(jī)相遇而引起的DNA分子與硝 化纖維素膜的連接。
[0015] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"改性的"，特別是提及所公開的多孔膜（例如，硝化纖維素膜） 時(shí)，旨在包括對(duì)膜的任何改變，例如，對(duì)初始的未改性的多孔膜（例如，硝化纖維素膜）基底 的化學(xué)改變。本文陳述的"改性"多孔膜（更特別是硝化纖維素膜）可為包含與硝化纖維 素膜鍵合的聚合親水性涂層的改性（例如，化學(xué)改性）硝化纖維素膜。在具體的實(shí)施方案 中，聚合親水性涂層包含PEG部分，包括但不限于PEGMA、PEGDA或TMPET。
[0016] 還提供了用于制備具有與多孔膜（例如，硝化纖維素膜）鍵合（通常永久鍵合） 的聚合親水性涂層的多孔膜（例如，硝化纖維素膜）的方法。在一些實(shí)施方案中，如下使聚 合親水性涂層在多孔膜（例如硝化纖維素膜）上鍵合：提供未改性的多孔膜（例如，硝化纖 維素膜），在親水性化合物的含水溶液中浸沒(méi)膜，和使膜暴露于電子束輻射，從而在多孔膜 (例如，硝化纖維素膜）上使親水性涂層聚合。例如，使硝化纖維素膜浸沒(méi)在親水性化合物 (例如，PEG部分，例如PEGMA、PEGDA或TMPET)的含水溶液中，隨后經(jīng)歷電子束輻射?；蛘?， 在本發(fā)明的其它方面，如下制備改性多孔膜，首先使多孔膜（例如，硝化纖維素膜）經(jīng)歷電 子束輻射，接著在親水性化合物（例如PEGMA、PEGDA或TMPET)的含水溶液（例如，A-鍵-B 的含水溶液）中浸沒(méi)膜。本公開包括生產(chǎn)本文描述的改性多孔膜（例如，硝化纖維素膜） 基底的方法，例如，采用浸沒(méi)和電子束輻射步驟的方法步驟的順序。
[0017] 如以下更詳細(xì)描述的，當(dāng)在用于制備改性多孔膜的方法的情境中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)在 例如親水性化合物（例如PEG部分，特別是PEGMA、PEGDA或TMPET，如在權(quán)利要求書中敘述） 的含水溶液中"浸沒(méi)"多孔膜通常通過(guò)以下實(shí)現(xiàn)：在親水性化合物（例如，PEG部分，包括但 不限于PEGMA、PEGDA或TMPET)的含水溶液中浸漬整個(gè)多孔膜（更具體為硝化纖維素膜）， 隨后除去任何過(guò)量的溶液。
[0018] 雖然在整個(gè)本申請(qǐng)中敘述硝化纖維素膜，但是本公開包括各種多孔膜。僅為了示 例性目的并且無(wú)任何預(yù)期限制，未改性的多孔膜可包括纖維素膜、乙酸纖維素膜、再生纖維 素膜、硝化纖維素混合酯膜、聚醚砜膜、尼龍膜、聚烯烴膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、 聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、聚（四氟乙烯-共聚-六氟 丙烯）膜，或上述多孔膜的兩種或更多種的任何組合。
[0019] 硝化纖維素膜目前廣泛用于多種需要在固相材料上固定特定的生物分子（例如， DNA、RNA或蛋白質(zhì)例如抗體）的生物學(xué)應(yīng)用。"多孔膜"旨在不帶限制地表示任何多孔膜，包 括任何市售可得的或非市售可得的多孔膜，特別是硝化纖維素膜，更特別是市售可得的硝 化纖維素膜。在本公開的某些方面，如在圖1中陳述的，將硝化纖維素膜化學(xué)改性，以包含 PEG的聚合親水性涂層，其中所述聚合親水性涂層降低與硝化纖維素膜的非特異性結(jié)合。由 硝化纖維素聚合物制備的硝化纖維素膜對(duì)于DNA、RNA和蛋白質(zhì)具有強(qiáng)親和力，并且防止這 些生物分子變性。
[0020] 本申請(qǐng)使用的"硝化纖維素膜"包括含有任何氮濃度、多種多樣的孔尺寸和可變的 膜厚度的所有那些多孔膜產(chǎn)品。在特定的實(shí)施方案中，多孔膜的孔尺寸可在0. 01-50微米 范圍。此外，在整個(gè)多孔膜中孔直徑可為均勻的，或者，孔直徑可為不規(guī)則的。選擇具有適 當(dāng)?shù)牡俊⒖壮叽绾湍ず穸鹊南趸w維素膜以實(shí)現(xiàn)特定的期望結(jié)果，完全在本領(lǐng)域技術(shù) 人員的技術(shù)和知識(shí)以內(nèi)。此外，專業(yè)技術(shù)人員將立即理解和認(rèn)識(shí)到短語(yǔ)"硝化纖維素膜"的 含義，并且這樣的硝化纖維素膜包括例如市售可得的硝化纖維素膜，可為"無(wú)背襯"膜，或者 含有"背襯材料"或"背襯支撐"例如聚酯（PE)。關(guān)于是使用"無(wú)背襯"還是"背襯"多孔膜 (例如，硝化纖維素膜）的選擇取決于要實(shí)施的具體應(yīng)用，并且進(jìn)行這樣的選擇完全在本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員的知識(shí)以內(nèi)。
[0021] 具有任何氮濃度、孔尺寸或存在或不存在背襯支撐的硝化纖維素膜均包括在本文 使用的術(shù)語(yǔ)"硝化纖維素膜"中。硝化纖維素膜具有多種化學(xué)和物理性質(zhì)，并且常規(guī)地用于 需要例如將關(guān)注的生物分子（例如，DNA、RNA或蛋白質(zhì)例如抗體）固定到多孔膜（例如，硝 化纖維素膜），或用于在這樣的膜上收集生物分子以在待分析的生物學(xué)樣品中將它們與其 它蛋白質(zhì)、核酸和生物分子等分離的生物學(xué)技術(shù)。任何硝化纖維素膜可用于本公開。
[0022] 雖然在整個(gè)本申請(qǐng)中提及多孔膜，但組合物、制備方法和使用方法同樣適用于可 用于固定生物分子的其它固相材料，如在本文的權(quán)利要求所敘述。這樣的固相材料包括但 不限于玻璃珠、玻璃纖維、膠乳珠、結(jié)節(jié)、餅、納米顆粒、空心膜管，和上述固相材料的兩種或 更多種的任何組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能選擇適用于特定的使用方法（例如，免疫測(cè)定） 的多孔膜（特別是硝化纖維素膜）。雖然多孔膜（例如，硝化纖維素膜。在本發(fā)明的某些方 面，硝化纖維素膜的孔尺寸在〇. 01-50 Mm范圍。
[0023] 術(shù)語(yǔ)"生物學(xué)樣品"包括但不限于得自人或非人生物體的血液、血清、淋巴、唾液、 粘液、尿、其它身體分泌物、細(xì)胞和組織部分。生物學(xué)樣品可由自身經(jīng)歷診斷測(cè)試（例如，血 糖監(jiān)測(cè)）的個(gè)體或由經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的醫(yī)療專業(yè)人員通過(guò)多種技術(shù)得到，所述多種技術(shù)包括例如 用針吸出血液，或者刮或擦特定的區(qū)域，例如患者皮膚上的傷口。用于收集各種生物學(xué)樣品 的方法為本領(lǐng)域公知的。
[0024] 本文使用的"免疫測(cè)定"在其最寬的含義內(nèi)包括基于抗體及其相應(yīng)的抗原之間的 相互作用的任何技術(shù)。這樣的測(cè)定基于抗體以高特異性與一組或非常有限組的類似分子 (例如，抗原）結(jié)合的獨(dú)特能力。與抗體結(jié)合的分子稱為抗原?？墒褂每乖蚩贵w作為"捕 獲"分子來(lái)"俘獲"抗體-抗原對(duì)的其它成員，進(jìn)行免疫測(cè)定。本文使用的術(shù)語(yǔ)"免疫測(cè)定" 還包括利用抗體來(lái)檢測(cè)生物學(xué)樣品（例如，生物化學(xué)反應(yīng)的代謝物）中的非蛋白質(zhì)生物分 子的那些測(cè)定。
[0025] 免疫測(cè)定的示例性但非窮盡的列舉包括側(cè)流測(cè)定（例如，家庭受孕測(cè)試）、放射性 免疫測(cè)定（RIA)、酶免疫測(cè)定（EIA)、酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA)、熒光免疫測(cè)定和化學(xué)發(fā) 光免疫測(cè)定。該領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員具有選擇和實(shí)施適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ糜诰唧w的情況所需的技 術(shù)，以及實(shí)施這些免疫測(cè)定的技術(shù)，以及解釋結(jié)果的技術(shù)。免疫測(cè)定可產(chǎn)生定性或定量的結(jié) 果，取決于選擇的具體的檢測(cè)方法。
[0026] 側(cè)流測(cè)定為常見(jiàn)的免疫測(cè)定，主要是由于其容易使用，并且包括例如市售可得的 家庭-受孕測(cè)試和常規(guī)藥物測(cè)試的產(chǎn)品。側(cè)流測(cè)定是特別有利的，因?yàn)檠b置和方法通常簡(jiǎn) 單使用并且簡(jiǎn)單解釋測(cè)試結(jié)果，即使由沒(méi)有接受正式醫(yī)療訓(xùn)練的個(gè)體進(jìn)行。側(cè)流裝置和方 法旨在檢測(cè)在生物學(xué)樣品（例如，尿）中存在或不存在靶分析物或生物分子（例如，在側(cè)流 家庭受孕測(cè)試中的人絨膜促性腺激素（hCG))。雖然在側(cè)流裝置和測(cè)定中存在變化，但這些 測(cè)試常用于家庭測(cè)試、護(hù)理點(diǎn)測(cè)試和實(shí)驗(yàn)室使用。側(cè)流測(cè)定通常以方便的"量尺"形式呈現(xiàn)， 如在以下實(shí)施例中描述的，其中待測(cè)試的生物學(xué)樣品通過(guò)毛細(xì)作用沿著固體基底（例如， 多孔膜，通常為硝化纖維素膜）流動(dòng)。在某些形式的側(cè)流測(cè)定中，將量尺浸沒(méi)在生物學(xué)樣品 中，當(dāng)生物學(xué)樣品向上流動(dòng)到測(cè)試條紋時(shí)，其遇到事先印在量尺上的一種或多種試劑，從而 遇到已事先印有例如抗體或抗原（例如，hCG)的測(cè)試條紋上的線或區(qū)域。當(dāng)生物學(xué)樣品遇 到該試劑時(shí)，產(chǎn)生信號(hào)以指示對(duì)于分析物或關(guān)注的生物分子的存在，該測(cè)試為陽(yáng)性還是陰 性（例如，通常在家庭受孕測(cè)試中，在檢測(cè)hCG中，裸眼可見(jiàn)的線指示患者的尿中存在hCG)。
[0027] 側(cè)流裝置和方法為本領(lǐng)域公知的。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)4, 094, 647 ; 4, 313, 734 ；4, 857, 453 ；5, 073, 484 ；5, 559, 041 ；5, 571, 726 ；5, 578, 577 ；5, 591, 645 ； 6, 187, 598 ;6, 352, 862 ;和6, 485, 982 ;均通過(guò)引用而全文結(jié)合到本文中。在已知的例如側(cè) 流裝置和測(cè)定中包括本公開的改性多孔膜（例如包含親水性聚合物的聚合涂層的改性硝 化纖維素膜）將顯著改進(jìn)這樣的側(cè)流裝置和免疫測(cè)定的性能、靈敏度和特異性，降低得到 準(zhǔn)確測(cè)試結(jié)果所需的分析物或生物分子的濃度，和降低檢測(cè)存在或不存在分析物或生物分 子的時(shí)間，從而使獲得測(cè)試結(jié)果所需的時(shí)間最小化。
[0028] 所有抗體為蛋白質(zhì)，更尤其是糖蛋白，并且對(duì)關(guān)注的抗原（例如，多肽的一部分） 呈現(xiàn)結(jié)合特異性。術(shù)語(yǔ)"抗體"以最寬的含義使用，并且涵蓋完全裝配的抗體、可結(jié)合抗原的 抗體碎片（例如，F(xiàn)ab'、F'（ab)2、Fv、單鏈抗體、雙抗體）和包含前述的重組體肽。"抗體碎 片"包含完整的抗體的一部分，優(yōu)選完整的抗體的抗原-結(jié)合的或可變的區(qū)域?？贵w碎片的 實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab'）2和Fv碎片、雙抗體和線性抗體（Zapata等人（1995) Protein Eng. 8(10):1057 1062)、單鏈抗體分子和由抗體碎片形成的多-特異性抗體。任何抗體或 抗體碎片可用于本發(fā)明的實(shí)踐。
[0029] 在本發(fā)明的某些方面，需要檢測(cè)在固相材料（包括但不限于硝化纖維素膜）上結(jié) 合或固定的抗體。所公開的發(fā)明包括本領(lǐng)域已知的用于檢測(cè)與硝化纖維素膜結(jié)合的抗體 的任何方法。適當(dāng)?shù)目贵w結(jié)合檢測(cè)技術(shù)的確定和優(yōu)化為標(biāo)準(zhǔn)的，并且完全在本領(lǐng)域技術(shù)人 員的常規(guī)能力以內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)使抗體與可檢測(cè)物質(zhì)偶聯(lián)，可促進(jìn)檢測(cè)抗體結(jié) 合?？蓹z測(cè)物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、修復(fù)基團(tuán)、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射 性材料。示例性合適的酶包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或乙酰膽堿脂 酶；合適的修復(fù)基團(tuán)復(fù)合物的實(shí)例包括抗生物素蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生 物素；合適的熒光材料的實(shí)例包括傘形酮、熒光素、熒光素異硫氰酸酯（FITC)、若丹明、二 氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；可與抗體偶聯(lián)的可檢測(cè)的發(fā)光材料包括但不限 于魯米諾；生物發(fā)光材料的實(shí)例包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；而用于檢測(cè)抗體 結(jié)合的合適的放射性材料的實(shí)例包括125I、131I、35S或 3h。
[0030] 包含例如PEG的聚合物涂層的改性多孔膜可被進(jìn)一步改性，以包含在多孔膜上固 定的親水性化合物。在包含聚合涂層的改性多孔膜上引入親水性化合物可用作阻斷劑，以 降低與多孔膜（例如，硝化纖維素膜）的非特異性背景結(jié)合。使與多孔膜的非特異性背景 結(jié)合最小化改進(jìn)信號(hào)與噪聲比，例如在免疫測(cè)定中，該免疫測(cè)定基于在多孔膜上固定的抗 體的特定相互作用和樣品（正在對(duì)其分析該生物分子的存在或量）中的關(guān)注的特定生物分 子（例如，蛋白質(zhì)）。
[0031] 在本發(fā)明的某些方面，如上所述，使用親水性化合物的含水溶液制備要求保護(hù)的 改性硝化纖維素膜。親水性化合物的溶液還可包含助溶劑，以改進(jìn)親水性化合物在水中的 溶解度。例如，表面活性劑更特別是非離子表面活性劑（例如，聚氧乙烯（20)脫水山梨糖 醇單月桂酸酯（Tween-20?))可用作助溶劑，以提高例如PEG在水中的溶解度。本領(lǐng)域技術(shù) 人員將認(rèn)識(shí)到必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定和優(yōu)化提高例如PEG (例如，PEGMA、PEGDA或TMPET)的溶 解度所需的特定助溶劑（例如，非離子表面活性劑，例如聚氧乙烯（20)脫水山梨糖醇單月 桂酸酯（Tween-20?))的適當(dāng)量。
[0032] 選擇在多孔膜（特別是硝化纖維素膜）上接枝聚合物涂層的方法中使用的電子束 輻射的劑量，使得與硝化纖維素膜鍵合的聚合親水性涂層的量最大化，同時(shí)還限制已知由 電子束輻射引起的多孔膜（例如，硝化纖維素膜）的降解。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，用于 制備本發(fā)明的改性多孔膜的電子束輻射的適當(dāng)劑量需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。在具體的實(shí)施方案 中，在制備改性多孔膜的方法中使用的電子束輻射的劑量可在小于1 kGy-約50 kGy范圍。 優(yōu)化參數(shù)（例如聚合親水性涂層的量、任選的表面活性劑和適用于本發(fā)明的方法的電子束 輻射的劑量）的測(cè)定設(shè)計(jì)為標(biāo)準(zhǔn)的，并且完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)能力以內(nèi)。
[0033] 本發(fā)明的改性多孔膜適用于各種生物學(xué)應(yīng)用，其取決于在多孔膜（例如，硝化纖 維素膜）上固定生物分子，包括但不限于免疫測(cè)定、體外診斷測(cè)試和用于分離關(guān)注的生物 分子的技術(shù)。硝化纖維素膜由于它們固定核酸（例如，DNA和RNA)用于DNA印跡和RNA印 跡的獨(dú)特能力以及它們對(duì)氨基酸（例如，蛋白質(zhì)）的結(jié)合親和力而特別用于生物學(xué)技術(shù)。作 為這些性質(zhì)的結(jié)果，硝化纖維素膜在其中抗原-抗體結(jié)合提供測(cè)試結(jié)果（例如，家庭受孕測(cè) 試）的診斷測(cè)試中廣泛用作基底。
[0034] 雖然未改性的硝化纖維素膜結(jié)合生物分子（例如核酸和蛋白質(zhì)）的能力是有益 的，但這些膜的改性降低與硝化纖維素膜的非特異性結(jié)合促進(jìn)固定生物分子（例如，DNA、 RNA和蛋白質(zhì)），比起未改性的多孔膜提供顯著的優(yōu)點(diǎn)。
[0035] 因此，在本發(fā)明的某些方面，提供用于改進(jìn)使用硝化纖維素膜用于固定生物分子 的免疫測(cè)定的靈敏度的方法，其中所述用于免疫測(cè)定的硝化纖維素膜為包含與硝化纖維素 膜鍵合的聚合親水性涂層的硝化纖維素膜。雖然本文描述的方法可用于實(shí)踐任何免疫測(cè) 定，在某些實(shí)施方案中，免疫測(cè)定包括但不限于側(cè)流免疫測(cè)定、放射性免疫測(cè)定、酶免疫測(cè) 定（EIA)、酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA)、熒光免疫測(cè)定和化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定。
[0036] 本公開包括用于改進(jìn)免疫測(cè)定的性能的方法。短語(yǔ)"改進(jìn)免疫測(cè)定的性能"旨在 包括由使用本發(fā)明的改性多孔膜引起的多種有利性質(zhì)，包括但不限于：使不期望的材料與 改性多孔膜的非特異性結(jié)合最小化（或者稱為降低背景結(jié)合），消除對(duì)于使用免疫測(cè)定的 性能傳統(tǒng)所需的阻斷劑的需要，提高信號(hào)與噪聲比，和通過(guò)使非特異性結(jié)合最小化而改進(jìn) 將關(guān)注的特定生物分子固定到多孔膜。
[0037] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，用于改進(jìn)使用多孔膜用于固定生物分子的免疫測(cè)定的 性能的方法包括提供具有式（I)的結(jié)構(gòu)的多孔膜，其中式（I)為：
【權(quán)利要求】
1. 一種具有式α)的結(jié)構(gòu)的多孔膜，其中式α)為：
其中Α為電子束（電子束）反應(yīng)性部分，其中聚（Α)χ為所述電子束反應(yīng)性部分的聚合 物，X為存在于所述聚（Α)χ聚合物中的Α單體的數(shù)量；其中鍵在所述聚（Α)χ聚合物和Β基 團(tuán)之間形成鍵合，并且其中聚（Α)χ-鍵-Β為共價(jià)接枝到所述多孔膜的聚合親水性涂層。
2. 權(quán)利要求1的多孔膜，其中所述膜選自硝化纖維素膜、纖維素膜、乙酸纖維素膜、再 生纖維素膜、硝化纖維素混合酯膜、聚醚砜膜、尼龍膜、聚烯烴膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、聚 丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、聚（四氟乙烯-共 聚-六氟丙烯）膜，和上述膜中的兩種或更多種的任何組合。
3. 權(quán)利要求2的多孔膜，其中所述多孔膜為包含與硝化纖維素膜鍵合的聚合親水性涂 層的硝化纖維素膜。
4. 權(quán)利要求1的多孔膜，其中所述電子束反應(yīng)性部分Α選自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、 丙烯酰胺、乙烯基酮、苯乙烯、乙烯基醚、含乙烯基的部分、含烯丙基的部分、基于芐基的化 合物、基于叔碳（CHR3)的化合物，和上述官能部分的兩種或更多種的任何組合。
5. 權(quán)利要求1的多孔膜，其中所述鍵為酯、脂族、芳族、親水性化合物、雜芳族化合物， 或上述鍵的兩種或更多種的任何組合。
6. 權(quán)利要求1的多孔膜，其中所述B基團(tuán)為親水性化合物。
7. 權(quán)利要求6的多孔膜，其中所述親水性化合物為PEG部分，并且其中所述PEG部分選 自 PEGMA、PEGDA 和 TMPET。
8. 權(quán)利要求1的多孔膜，其中相對(duì)于與未改性的多孔膜的非特異性結(jié)合，所述聚合親 水性涂層顯示不期望的材料的非特異性結(jié)合降低。
9. 一種用于改進(jìn)使用多孔膜用于固定生物分子的免疫測(cè)定的性能的方法，所述方法 包括： a)提供具有式（I)的結(jié)構(gòu)的多孔膜，其中式（I)為：
其中A為電子束（電子束）反應(yīng)性部分，其中聚（A)x為所述電子束反應(yīng)性部分的聚合 物，X為存在于所述聚（A) x聚合物中的A單體的數(shù)量；其中鍵在所述聚（A) x聚合物和B基 團(tuán)之間形成鍵合，并且其中聚（A)x-鍵-B為共價(jià)接枝到所述多孔膜的聚合親水性涂層； b) 在所述多孔膜上固定與關(guān)注的抗原結(jié)合的第一抗體； c) 用與所述抗原結(jié)合的第二抗體培育生物學(xué)樣品，其中所述第二抗體與可檢測(cè)物質(zhì)綴 合； d) 用包含所述第二抗體的生物學(xué)樣品培育包含在其上固定的所述第一抗體的多孔膜； 和 e) 使用與所述第二抗體結(jié)合的可檢測(cè)物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)所述第二抗體是否與所述多孔膜 結(jié)合，測(cè)定在所述生物學(xué)樣品中是否存在所述抗原。
10. 權(quán)利要求9的方法，所述方法還包括在步驟（d)之后洗滌所述多孔膜，以除去未結(jié) 合的材料。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中洗滌所述多孔膜還包括使用非離子表面活性劑。
12. 權(quán)利要求9的方法，其中與所述第二抗體綴合的所述可檢測(cè)物質(zhì)選自酶、修復(fù)基 團(tuán)、熒光染料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性材料和金顆粒。
13. 權(quán)利要求9的方法，其中所述多孔膜選自其中膜選自：硝化纖維素膜、纖維素膜、乙 酸纖維素膜、再生纖維素膜、硝化纖維素混合酯膜、聚醚砜膜、尼龍膜、聚烯烴膜、聚酯膜、聚 碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、聚（四 氟乙烯-共聚-六氟丙烯）膜，和上述膜中的兩種或更多種的任何組合。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述多孔膜為硝化纖維素膜。
15. 權(quán)利要求9的方法，其中所述電子束反應(yīng)性部分A選自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、 丙烯酰胺、乙烯基酮、苯乙烯、乙烯基醚、含乙烯基的部分、含烯丙基的部分、基于芐基的化 合物、基于叔碳（CHR3)的化合物，和上述官能部分的兩種或更多種的任何組合。
16. 權(quán)利要求9的方法，其中所述鍵為酯、脂族、芳族、親水性化合物、雜芳族化合物，或 上述鍵的兩種或更多種的任何組合。
17. 權(quán)利要求9的方法，其中所述B基團(tuán)為親水性化合物。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述親水性化合物為PEG部分，并且其中所述PEG部分選 自 PEGMA、PEGDA 和 TMPET。
19. 權(quán)利要求9的方法，其中所述免疫測(cè)定選自側(cè)流免疫測(cè)定、放射性免疫測(cè)定、酶免 疫測(cè)定（EIA)、酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA)、熒光免疫測(cè)定和化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定。
20. 權(quán)利要求9的方法，其中所述生物學(xué)樣品為血液、血清、淋巴、尿、唾液、粘液、身體 分泌物、細(xì)胞或組織。
21. 權(quán)利要求9的方法，其中所述抗原選自細(xì)菌、病毒、真菌、激素和用于癌癥、心臟功 能不良、心臟病發(fā)作或炎性過(guò)程的蛋白質(zhì)標(biāo)記物。
22. 權(quán)利要求9的方法，其中步驟（a)的多孔膜使用消除在所述免疫測(cè)定中對(duì)使用阻 斷劑的需要。
23. 權(quán)利要求9的方法，其中所述方法在固體載體上實(shí)施，其中所述固體載體為微量滴 定板或載玻片。
24. 權(quán)利要求9的方法，其中所述方法允許檢測(cè)所述生物學(xué)樣品中的兩種或更多種抗 原。
25. -種用于改進(jìn)使用多孔膜用于固定生物分子的免疫測(cè)定的性能的方法，所述方法 包括： a) 提供具有式（I)的結(jié)構(gòu)的多孔膜，其中式（I)為：
其中A為電子束（電子束）反應(yīng)性部分，其中聚（A)x為所述電子束反應(yīng)性部分的聚合 物，X為存在于所述聚（A)x聚合物中的A單體的數(shù)量；其中鍵在所述聚（A)x聚合物和B基 團(tuán)之間形成鍵合，并且其中聚（A)x-鍵-B為共價(jià)接枝到所述多孔膜的聚合親水性涂層； b) 在所述多孔膜上固定與關(guān)注的抗原結(jié)合的第一抗體，其中所述第一抗體與可檢測(cè)物 質(zhì)綴合； c) 用包含在其上固定的所述第一抗體的多孔膜培育生物學(xué)樣品；和 d) 通過(guò)檢測(cè)所述可檢測(cè)物質(zhì)是否與所述多孔膜結(jié)合，測(cè)定在所述生物學(xué)樣品中是否存 在所述抗原。
26. 權(quán)利要求3的硝化纖維素膜，其中所述聚合親水性涂層包含聚乙二醇（PEG)部分、 聚乙烯醇、羥基、帶負(fù)電荷的離子基團(tuán)、帶正電荷的離子基團(tuán)、兩性離子基團(tuán)，或它們的任何 組合。
27. 權(quán)利要求26的硝化纖維素膜，其中所述聚合親水性涂層包含PEG部分。
28. 權(quán)利要求27的硝化纖維素膜，其中所述PEG部分選自PEGMA、PEGDA和TMPET。
29. 權(quán)利要求28的硝化纖維素膜，其中關(guān)注的生物分子固定在所述硝化纖維素膜上。
30. 權(quán)利要求29的硝化纖維素膜，其中所述關(guān)注的生物分子為蛋白質(zhì)或核酸。
31. 權(quán)利要求30的硝化纖維素膜，其中所述關(guān)注的生物分子為蛋白質(zhì)。
32. 權(quán)利要求31的硝化纖維素膜，其中所述蛋白質(zhì)為抗體。
33. 權(quán)利要求29的硝化纖維素膜，其中相對(duì)于與未改性的硝化纖維素膜的非特異性結(jié) 合，所述硝化纖維素膜顯示非特異性結(jié)合降低。
34. 權(quán)利要求33的硝化纖維素膜，其中所述硝化纖維素膜還顯示信號(hào)與噪聲比提高。
35. 權(quán)利要求3的硝化纖維素膜，其中所述聚合親水性涂層與所述硝化纖維素膜共價(jià) 連接。
36. 權(quán)利要求3的硝化纖維素膜，其中所述硝化纖維素膜的孔尺寸在0. 01-50微米范 圍。
37. -種用于實(shí)施免疫測(cè)定的裝置，所述裝置包含權(quán)利要求3的硝化纖維素膜。
38. 權(quán)利要求37的裝置，其中所述裝置用于側(cè)流免疫測(cè)定。
39. -種用于制備權(quán)利要求3的硝化纖維素膜的方法，所述方法包括： a) 提供未改性的硝化纖維素膜； b) 在親水性化合物的含水溶液中浸沒(méi)所述硝化纖維素膜； C)使所述多孔膜暴露于電子束（電子束）輻射；和 d)干燥所述硝化纖維素膜，從而制備包含與所述硝化纖維素膜鍵合的聚合親水性涂層 的硝化纖維素膜。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中所述親水性化合物的含水溶液還包含非離子表面活性 劑。
41. 權(quán)利要求40的方法，其中所述非離子表面活性劑為聚氧乙烯（20)脫水山梨糖醇 單月桂酸酯。
42. 權(quán)利要求25的方法，其中所述免疫測(cè)定選自側(cè)流免疫測(cè)定、放射性免疫測(cè)定、酶免 疫測(cè)定（EIA)、酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA)、熒光免疫測(cè)定和化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定。
43. 權(quán)利要求42的方法，其中所述方法允許檢測(cè)生物學(xué)樣品中的一種或多種生物分 子。
44. 權(quán)利要求43的方法，其中所述生物學(xué)樣品為血液、血清、淋巴、尿、唾液、粘液、身體 分泌物、細(xì)胞或組織。
45. 權(quán)利要求44的方法，其中所述生物分子為與疾病關(guān)聯(lián)的抗原。
46. 權(quán)利要求的45方法，其中所述疾病為細(xì)菌性疾病、病毒性疾病或真菌性疾病。
47. 用于在使用硝化纖維素膜用于固定生物分子的免疫測(cè)定中降低非特異性結(jié)合的 方法，其中所述用于免疫測(cè)定的硝化纖維素膜如在權(quán)利要求3中陳述。
48. 用于在使用硝化纖維素膜用于固定生物分子的免疫測(cè)定中降低信號(hào)與噪聲比的 方法，其中所述用于免疫測(cè)定的硝化纖維素膜如在權(quán)利要求3中陳述。
【文檔編號(hào)】B01D67/00GK104066497SQ201280065407
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月30日
【發(fā)明者】B.李, D.R.摩爾 申請(qǐng)人:通用電氣公司