專利名稱：一種分離/富集食品中痕量環(huán)丙沙星的方法
—種分離/富集食品中痕量環(huán)丙沙星的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于環(huán)境分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種分離/富集食品中痕量環(huán)丙沙星(CIP)的新方法，特指以環(huán)氧乙烷與環(huán)氧丙烷的無規(guī)共聚物(EOPO)為萃取劑，以無機(jī)鹽磷酸氫二鉀(K2HPO4)作為分相的鹽析劑，形成雙水相體系(ATPS)分離/富集食品中痕量環(huán)丙沙星的方法。
背景技術(shù)：
環(huán)丙沙星是全合成的第三代哇諾酮類抗菌藥，具有抗菌譜廣，內(nèi)在活性高，穿透力強(qiáng)，與其他抗菌藥不易產(chǎn)生交叉耐藥等特點(diǎn)，因而臨床上已廣泛應(yīng)用于各種全身感染。同時(shí)，從細(xì)菌核深處破壞了細(xì)菌的代謝和增殖，能迅速把細(xì)菌殺死，殺菌效果穩(wěn)定，也廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中疾病的治療，成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中最重要的抗感染藥物之一。但是，由于環(huán)丙沙星廣泛的使用，在水產(chǎn)動物體內(nèi)的殘留增強(qiáng)了致病菌的耐藥性，直接威脅公共衛(wèi)生安全和生物安全、污染了自然環(huán)境，對人可以引起皮膚過敏、心動過速、胃腸道反應(yīng)、光敏性皮膚病等副作用。美國等國家將其列入禁止在食品動物使用的獸藥及其化合物清單。為了消費(fèi)者健康，必須監(jiān)控各種水產(chǎn)品藥物殘留，為此需要可靠的分析方法來監(jiān)測這些藥物殘留。
樣品分析最重要的環(huán)節(jié)是樣品的前處理，它對分析方法的可靠性、準(zhǔn)確性有重要影響。由于環(huán)境樣品具有被測物濃度低、組分復(fù)雜、干擾物多，故一般都要經(jīng)過前處理才能進(jìn)行分析測定。目前，環(huán)丙沙星類抗生素殘留的前處理方法主要為液-液萃取法、固相萃取法、基質(zhì)固相分散萃取法、固相微萃取法、超臨界萃取法、加壓溶劑萃取法、超聲波提取法和雙水相萃取法。其中最常用的是固相萃取法，但是固相萃取使用有機(jī)溶劑，對環(huán)境污染較大，并且解吸附過程操作非常耗時(shí)。因此，需要建立一種高效、無毒、無污染的綠色分離/富集方法。
雙水相體系是一類新型萃取分離體系，它是由兩種聚合物或一種聚合物和一種鹽的水溶液在一定濃度下混合自發(fā)形成的兩相體系，具有無毒、無污染、萃取條件溫和、樣品易分離、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)的雙水相萃取體系相比，功能性聚合物-鹽雙水相體系使用的溫敏性聚合物成本低且易于溫度分離回收，分相時(shí)間短，萃取組分可以循環(huán)利用，達(dá)到綠色化學(xué)的目的。
1955年由Albertson首先利用雙水相技術(shù)來分離生物分子，在隨后的幾十年中，這項(xiàng)技術(shù)有了長足的發(fā)展。近幾年來，雙水相技術(shù)在動力學(xué)研究、雙水相親和分離、多級逆流層析、反應(yīng)分離耦合等方面都取得了顯著的成績。由于其操作條件溫和、有機(jī)溶劑用量少、可調(diào)節(jié)因素多及易于工業(yè)化放大和操作等，廣泛用于物質(zhì)的提取和分離富集。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明建立了一種全新的樣品前處理體系一溫敏性聚合物/鹽雙水相體系(ATPS)。該方法將溫敏性聚合物EOPO與鹽兩相混合，它利用了表面活性劑在溫度改變的情況下與水相親和度改變的性質(zhì)，結(jié)合無機(jī)鹽形成雙水相體系進(jìn)行萃取分離的一種新的分離技術(shù)。這種新型的分離體系集雙水相萃取優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)由于溫敏性聚合物的溫度分離性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了二次萃取，使得萃取效率比一次萃取更高，同時(shí)相組分的回收利用，降低了實(shí)驗(yàn)成本。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是: 功能性聚合物鹽雙水相體系分離/富集食品中環(huán)丙沙星(CIP)，是以低成本的溫敏性表面活性劑EOPO作為萃取溶劑，以磷酸氫二鉀(K2HPO4)作為鹽析劑對環(huán)丙沙星進(jìn)行分離/富集的方法。
本發(fā)明具體步驟:一種分離/富集食品中痕量環(huán)丙沙星的方法，按照下述步驟進(jìn)行:(1)在磨口離心管中，首先加入分相鹽溶液，再加入100ng/mL環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，最后加入質(zhì)星濃度為80%的EOPO溶液,其中試液體積V環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液:V分相鹽溶液:Ve()p。: V總體積=(0.5:6.5:3:10);其中V總_即雙水相體系總體積，分相鹽溶液為質(zhì)量濃度為55%K2HP04 ； (2)加入固體鹽調(diào)節(jié)溶液的離子強(qiáng)度，加入固體鹽使分相鹽溶液的濃度范圍為20%-60% (w/w);振蕩使其充分溶解；其中所述的固體鹽為(NH4) 2S04、NaH2PO4, KC1、Na2SO4,K2HPO4 或 K2CO3 ;優(yōu)選 K2HPO4, K2HPO4 的濃度為 55% (w/w)； (3)用高效液相檢測法在波 長274nm處分析測定CIP含量，反相色譜柱XDB-C18，250mmX4.6 mm，5 u m, n0.G1314B, 25 °C。流動相比例為甲醇和水(pH=3.0)27:73 流速為 1.0mL mirf1。
(4)優(yōu)選出萃取的最佳條件，EOPO (80%, w/w) 3mL，K2HPO4(55%, w/w) 7mL,pH=ll。
(5)在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下結(jié)合高效液相法對食品中痕量環(huán)丙沙星的分離/富集分析。
本方法與一次雙水相萃取技術(shù)相比具有富集倍數(shù)大，選擇性好、無毒、分離效果好、成本低，且具有設(shè)備簡單、靈敏度高、測量快速、提取物后處理簡便、相組分可以回收及循環(huán)利用等特點(diǎn)。


圖1分相鹽的選擇； 圖2 K2HPO4濃度對CIP —次萃取率的影響； 圖3 pH對CIP —次萃取率的影響； 圖4加入蒸餾水的量對CIP 二次萃取率的影響； 圖5萃取空白樣品HPLC-UV色譜圖。(mAu表示色譜峰的強(qiáng)度)； 圖6 —次萃取牛奶樣品HPLC-UV色譜圖； 圖7 二次萃取牛奶樣品HPLC-UV色譜圖； 圖8 一次萃取雞蛋樣品HPLC-UV色譜圖； 圖9 二次萃取雞蛋樣品HPLC-UV色譜圖； 圖10 —次萃取蝦樣品HPLC-UV色譜圖； 圖11 二次萃取蝦樣品HPLC-UV色譜圖。
具體實(shí)施方式
分相鹽的選擇 選擇一種合適的分相是雙水相體系的一個(gè)重要因素。功能性聚合物雙水相，以溫敏性聚合物EOPO為萃取劑，就要求一種既能與之形成雙水相體系，也要對目標(biāo)抗生素有很高萃取率的鹽。實(shí)驗(yàn)中討論了酸性鹽((NH4) 2S04、NaH2P04)、中性鹽(KC1、Na2SO4)及堿性鹽(K2HPO4, K2CO3)與EOPO形成雙水相對CIP萃取率的影響。
固定上相EOPO體積加入量為3mL，六種分相鹽濃度均接近飽和濃度(7mL)分別與之形成雙水相對目標(biāo)物進(jìn)行萃取實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，在這三種不同類型的鹽中，兩種堿性鹽的萃取率明顯高于中性鹽，最低的是酸性鹽，我們最終選擇K2HPO4作為雙水相萃取的分相鹽。
I) K2HPO4濃度對CIP —次萃取率的影響 從圖2中可以看出，當(dāng)K2HPO4的濃度小于20% (w/w)時(shí)，雙水相體系無法形成，所以在這部分我們選擇討論K2HPO4的濃度范圍為20%-60% (w/w)0結(jié)果如圖2，當(dāng)在20%_55% Cw/w)隨著K2HPO4濃度增加，CIP萃取率不斷增大，在K2HPO4濃度為55% (w/w)時(shí)CIP萃取率達(dá)到最大值82.14% ;隨后CIP萃取率隨K2HPO4濃度增加而降低。我們選擇K2HPO4的濃度為55% (w/w)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2) pH對CIP—次萃取率的影響 pH對CIP—次萃取率的影響結(jié)果見圖3。 pH是影響萃取率的重要因素，由于選擇堿性鹽作為分相鹽，PH環(huán)境就應(yīng)該處于堿性范圍內(nèi)，試驗(yàn)中我們討論的pH范圍為8.0-11.0，隨著PH值的增加，CIP的萃取率先下降在升高；當(dāng)pH值為11.0時(shí)，CIP的萃取率達(dá)到最大(97.66%)；由于堿性的增加使得環(huán)丙沙星的鹽酸鹽被中和為中性鹽,在下相接近飽和的鹽溶液環(huán)境里被排斥的幾率變大，萃取率就會隨之變大，綜上考慮，我們選擇pH為11.0進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3)加入蒸餾水的量對CIP 二次萃取率的影響 加入蒸餾水的量對CIP 二次萃取率的影響如圖4所示。在進(jìn)行第二次溫度分離實(shí)驗(yàn)，必須加入蒸餾水使之與EOPO在溫度誘導(dǎo)下形成新的兩相體系，試驗(yàn)中討論了 1.0mLU.5mL、2.0mL,2.5mL四個(gè)不同量對二次萃取率的影響，從圖4得出，萃取率先上升在下降，在蒸餾水加入量為2.0時(shí)，二次萃取率達(dá)到最大(85.62%)。故本實(shí)驗(yàn)中選擇加入蒸餾水的量為2.0mL0
4)萃取實(shí)際樣品HPLC-UV色譜圖 (A)未加標(biāo)的蒸餾水(圖5) ； (BI)加標(biāo)100 ng g_1CIP標(biāo)準(zhǔn)工作液的牛奶樣品的一次萃取(圖6) ； (B2)加標(biāo)100 ng g-'CIP標(biāo)準(zhǔn)工作液的牛奶樣品的二次萃取(圖7) ； (Cl)力口標(biāo)100 ng g^CIP標(biāo)準(zhǔn)工作液的雞蛋樣品的一次萃取(圖8) ； (C2)加標(biāo)100 ng g^CIP標(biāo)準(zhǔn)工作液的雞蛋樣品的二次萃取(圖9) ； (Dl)加標(biāo)100 ng g^CIP標(biāo)準(zhǔn)工作液的蝦肉樣品的一次萃取(圖10); (D2)加標(biāo)100 Iig^g-1CIP標(biāo)準(zhǔn)工作液的蝦肉樣品的二次萃取(圖11)。
表 I EOPO的回收及循環(huán)使用的數(shù)據(jù)及CIP在每一步里的收率。
權(quán)利要求
1.一種分離/富集食品中痕量環(huán)丙沙星的方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行: (1)在磨口離心管中，首先加入分相鹽溶液，再加入100ng/mL環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，最后加入質(zhì)星濃度為80%的EOPO溶液，其中試液體積V環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液:V分相鹽溶液:Veopo: V總體積=0.5:6.5:3:10 ;其中V總_即雙水相體系總體積，分相鹽溶液為質(zhì)量濃度為55%K2HP04 ； (2)加入固體鹽調(diào)節(jié)溶液的離子強(qiáng)度，加入固體鹽使分相鹽溶液的質(zhì)量濃度范圍為20%-60% ;振蕩使其充分溶解；其中所述的固體鹽為(NH4) 2S04、NaH2PO4, KC1、Na2SO4, K2HPO4或 K2CO3 ； (3)用高效液相檢測法在波長274nm處分析測定CIP含量，反相色譜柱XDB-C18，250mmX4.6 mm, 5 y m，n0.G1314B，25 °C ;流動相比例為體積比為27:73的甲醇和水，流速為1.0 mL mirf1 , pH=3.0 ； (4)優(yōu)選出萃取的最佳條件， (5)在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下結(jié)合高效液相法對食品中痕量環(huán)丙沙星的分離/富集分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離/富集食品中痕量環(huán)丙沙星的方法，其特征在于所述的萃取的最佳條件為加入質(zhì)量濃度為80%的EOPO溶液3mL，分相鹽溶液為質(zhì)量濃度為55%K2HP04 7mL, pH=ll。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離/富集食品中痕量環(huán)丙沙星的方法，其特征在于所述的固體鹽為K2H PO4, K2HPO4的質(zhì)量濃度為55%。
全文摘要
本發(fā)明一種分離/富集食品中痕量環(huán)丙沙星的方法，屬于環(huán)境分析技術(shù)領(lǐng)域。該方法將溫敏性聚合物EOPO與鹽兩相混合，它利用了表面活性劑在溫度改變的情況下與水相親和度改變的性質(zhì)，結(jié)合無機(jī)鹽形成雙水相體系進(jìn)行萃取分離的一種新的分離技術(shù)。這種新型的分離體系集雙水相萃取優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)由于溫敏性聚合物的溫度分離性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了二次萃取，使得萃取效率比一次萃取更高，同時(shí)相組分的回收利用，降低了實(shí)驗(yàn)成本。
文檔編號B01D11/04GK103191581SQ20131012079
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者閆永勝, 陳波, 韓娟, 逯洋, 王赟 申請人:江蘇大學(xué)