一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊及其制備方法，首先將含生物酶的緩沖溶液與含改性二氧化硅納米粒子的有機(jī)溶劑乳化，形成由納米粒子在兩相界面穩(wěn)定的水/油乳濁液；然后加入硅烷，硅烷水解將納米粒子粘結(jié)固定，即制備出包封生物酶的水芯全硅殼膠體體微膠囊。本發(fā)明制備條件溫和，實(shí)現(xiàn)了生物酶在有機(jī)溶劑中的活性穩(wěn)定性。本發(fā)明制備的全硅結(jié)構(gòu)膠體體微膠囊具有良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，解決了生物酶在有機(jī)介質(zhì)中的分散問題，大大提高了生物酶在有機(jī)溶劑中的活性；并且是具有一定通透性的可調(diào)控殼壁結(jié)構(gòu)，可實(shí)現(xiàn)生物酶在有機(jī)介質(zhì)中的可控活性釋放和可重復(fù)利用。該發(fā)明對(duì)生物酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化反應(yīng)有著廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊及其制備方法，特別是涉及一種通過硅烷水解粘結(jié)一層或一層以上二氧化硅納米粒子形成的可調(diào)控殼壁結(jié)構(gòu)的包封生物酶的全硅水芯膠體體微膠囊及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膠體體是一種新穎的具有半通透性殼壁結(jié)構(gòu)的新型微膠囊，其殼壁由自組裝分散在皮克林乳液油-水界面的膠體粒子間相互作用而固化形成。膠體體包封芯材已受到醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域的高度關(guān)注，但僅處于起步階段。目前，已報(bào)道的可用于制備膠體體微膠囊的膠體粒子有高分子微球(PS膠體粒子、PMMA膠體粒子、PNiPAAm膠體粒子、P(NiPAAm-C0-AAC)膠體粒子、環(huán)氧樹脂微棒、納米纖維素微棒、CPMV粒子等)和無(wú)機(jī)粒子(SiO2納米粒子、TiO2納米粒子、Fe3O4納米粒子、粘土納米粒子等)。
[0003]生物酶是具有生物催化功能的蛋白質(zhì)大分子，酶催化具有催化效率高、專一性強(qiáng)等顯著特點(diǎn)。生物酶催化已成為目前關(guān)注的和研究的熱點(diǎn)，但研究過程中發(fā)現(xiàn)生物酶的許多重要底物水溶性較差；并且部分生物酶的催化作用在水系條件下存在主反應(yīng)與水解反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)等問題，因此需要使用有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)來(lái)解決上述問題。但同時(shí)也面臨著生物酶在有機(jī)介質(zhì)中穩(wěn)定性差、易變性、活性低，并且不易分散于有機(jī)介質(zhì)中。諸多問題限制了生物酶在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，尤其是在有機(jī)介質(zhì)體系中的催化應(yīng)用。
[0004]膠體體包封生物酶是防止外界不良環(huán)境對(duì)生物酶構(gòu)象的破壞、提高生物酶穩(wěn)定性和可回收重復(fù)利用性能的具有潛力和可行性的方法。目前膠體體的制備主要通過自粘法(利用粒子溶脹性、玻璃化轉(zhuǎn)變等)、物理凝膠法(凝膠化水相將膠體粒子固定)、聚合法和光交聯(lián)等方法固結(jié)在兩相界面自組裝的膠體粒子形成具有一定通透性的有機(jī)、有機(jī)/無(wú)機(jī)雜化膠體體微膠囊。上述制備方法條件劇烈(高溫、紫外光照射)，易導(dǎo)致生物酶失去活性；制備的膠體體大多為有機(jī)、有機(jī)/無(wú)機(jī)雜化結(jié)構(gòu)，其物理和化學(xué)穩(wěn)定性較低，在運(yùn)載、存儲(chǔ)芯材的過程中容易破裂，從而失去對(duì)芯材的包封保護(hù)和運(yùn)載作用，更不適用于實(shí)現(xiàn)包封生物酶有機(jī)介質(zhì)中催化。
[0005]硅烷水解粘結(jié)自組裝于油-水界面的二氧化硅納米粒子形成的全硅結(jié)構(gòu)膠體體具有良好的生物相容性，并且具有良好力學(xué)性能和化學(xué)穩(wěn)定性，可長(zhǎng)時(shí)分散于有機(jī)介質(zhì)而保持良好形貌特征。以此全硅膠體體包封生物酶在有機(jī)介質(zhì)中催化具有廣泛的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊及其制備方法，提出了一種以硅烷水解粘結(jié)自組裝于油-水界面的二氧化硅納米粒子而形成包封生物酶的全硅膠體體及其制備方法，本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單、條件溫和，適用于包封具有生物活性的生物酶。采用該制備方法制備出的可調(diào)控殼壁結(jié)構(gòu)為一層或一層以上二氧化硅納米粒子殼壁的包封生物酶的全硅膠體體，可實(shí)現(xiàn)生物酶在有機(jī)溶劑中的可控活性釋放和重復(fù)利用。[0007]本發(fā)明的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊，所述膠體體微膠囊為具有一層或一層以上二氧化硅納米粒子經(jīng)硅烷水解粘結(jié)形成的殼壁結(jié)構(gòu)并包封生物酶的球形核-殼結(jié)構(gòu)微膠囊。改性二氧化硅納米粒子在超聲乳化作用下自組裝排列于水(含生物酶的緩沖溶液)-油(有機(jī)溶劑)兩相界面處，形成由二氧化硅納米粒子穩(wěn)定的油包水皮克林乳液，隨后加入作為粘結(jié)劑的硅烷，在水解作用下將二氧化硅納米粒子粘結(jié)固定，形成穩(wěn)定的包封生物酶的全硅膠體體微膠囊。由于該膠體體微膠囊殼壁由二氧化硅納米粒子排列組成，因此該膠體體為膠囊具有一定的半通透性，并且該殼壁半通透性可與形成殼壁的二氧化硅納米粒子層的厚度相關(guān)。該膠體體為膠囊殼壁的半通透性賦予了包封于膠體體內(nèi)部的生物酶可與外界物質(zhì)接觸的可能，從而可實(shí)現(xiàn)包封于膠體體內(nèi)部的生物酶對(duì)外界物質(zhì)的催化，并且包封的生物酶的催化活性可通過調(diào)整殼壁結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)可控。同時(shí)該膠體體為全硅殼壁結(jié)構(gòu)，具有良好的物理及化學(xué)穩(wěn)定性，可長(zhǎng)時(shí)間分散于有機(jī)溶劑而保持良好的形貌特征和性能。膠體體微膠囊內(nèi)部的微水環(huán)境大大提高了生物酶在有機(jī)溶劑中的活性，并且包封于膠體體內(nèi)部的生物酶，在膠體體微膠囊殼壁的屏蔽保護(hù)下，長(zhǎng)時(shí)間分散于有機(jī)溶劑以讓能保持較高的活性穩(wěn)定性，并利于從有機(jī)溶劑分離，實(shí)現(xiàn)循環(huán)利用。
[0008]作為優(yōu)選的技術(shù)方案:
[0009]如上所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊，所述硅烷是指以正硅酸乙酯或正硅酸甲酯為原料與醋酸酐縮聚反應(yīng)形成的超支化硅烷。超支化硅烷具有更多的活性基團(tuán)，有利于水解粘結(jié)二氧化硅納米粒子，形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。
[0010]如上所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊，所述生物酶為漆酶、脂肪酶或蛋白酶；所述的生物酶分散于緩沖溶液中，生物酶的濃度范圍為0.5?50mg/mL ;所述緩沖溶液為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液或Tris-鹽酸緩沖溶液，所述緩沖溶液的PH值為2?10。
[0011]如上所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊，所述膠體體微膠囊粒徑分布介于0.5?2 μ m ;所述膠體體微膠囊殼壁具有半通透性，其半通透性與膠體體微膠囊殼壁的厚度及密度相關(guān)。
[0012]本發(fā)明還提供了一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊的制備方法，包括以下步驟:
[0013]A)將有機(jī)硅源溶于醇溶液中，控制溶液pH值為8?12 ;
[0014]B)在上述步驟A)所得溶液中加入改性劑，并繼續(xù)攪拌，得到含有改性納米二氧化硅粒子的醇分散液；
[0015]C)將所述含改性納米二氧化硅粒子的醇分散液，在室溫條件下離心處理，移除上層清液后，對(duì)沉淀二氧化硅進(jìn)行溶劑交換處理；重復(fù)離心處理并移除上層清液后進(jìn)行溶劑交換處理的操作3?5次，最終將沉淀的改性二氧化硅分散于有機(jī)溶劑中，配制成濃度為I?10wt%的改性二氧化硅納米粒子有機(jī)溶劑待用液；
[0016]D)將所述改性二氧化硅納米粒子有機(jī)溶劑待用液與含生物酶的緩沖溶液混合，兩者質(zhì)量比為5?15:1，經(jīng)超聲乳化制備得改性二氧化硅納米粒子穩(wěn)定的油包水乳濁液；
[0017]E)向所述乳濁液中，加入硅烷，加入量與改性二氧化硅納米粒子有機(jī)溶劑待用液的質(zhì)量比為1:50?100，室溫下攪拌水解24?120h，即得到分散于有機(jī)溶劑的包封生物酶的全硅膠體體微膠囊。[0018]如上所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊的制備方法，步驟A)中:有機(jī)硅源與醇溶液質(zhì)量比為1:10?100 ;有機(jī)硅源溶于醇溶液時(shí)，在室溫下攪拌3?48h ;所述的有機(jī)硅源為正硅酸乙酯或正硅酸甲酯；所述的醇為甲醇或乙醇；控制溶液PH值采用氫氧化鈉溶液、碳酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液或氨水。
[0019]如上所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊的制備方法，步驟B)中:所述改性劑的分子式為CnH2n-Si (0CmH2m+1)3，其中η為5?18，m為I?4 ;所述改性劑加入量與有機(jī)硅源間質(zhì)量比為1:50?100 ;所述繼續(xù)攪拌的時(shí)間為24?120h。
[0020]如上所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊的制備方法，步驟C)中:所述離心處理時(shí)間為15?60min。
[0021]如上所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊的制備方法，所述的溶劑交換處理是指實(shí)現(xiàn)改性二氧化硅納米粒子分散體系由醇溶液完全置換為有機(jī)溶劑的過程:首先，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子首先分散于醇與有機(jī)溶劑體積比為7:3的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；其次，將上述離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子分散于醇與有機(jī)溶劑體積比為3:7的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；再次，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子完全置換分散于有機(jī)溶劑中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；最后，將改性二氧化硅納米粒子完全置換分散于有機(jī)溶劑中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物，形成改性二氧化硅納米粒子有機(jī)溶劑待用液；所述有機(jī)溶劑為四氯化碳、四氫呋喃、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯。
[0022]如上所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊的制備方法，進(jìn)一步地，將所述步驟E)得到的包封生物酶的全硅膠體體微膠囊進(jìn)行抽濾處理或離心處理；
[0023]所述抽濾處理是將所述步驟E)得到的包封生物酶的全硅膠體體微膠囊有機(jī)溶劑分散體系，室溫下抽濾處理，收集沉積于濾膜上包封生物酶的全硅膠體體，并分散于有機(jī)溶劑中；如此重復(fù)3?5次抽濾和分散，以去除未被包封的生物酶；
[0024]所述離心處理是將所述步驟E)得到的包封生物酶的全硅膠體體微膠囊有機(jī)溶劑分散體系，在3000?5000rpm轉(zhuǎn)速下離心5?30min,取沉淀的包封生物酶的全娃膠體體微膠囊再次分散于有機(jī)溶劑；如此重復(fù)離心和分散3?5次，以去除未被包封的生物酶。
[0025]有益效果:
[0026]本發(fā)明首次提出通過硅烷水解粘結(jié)方式制備包封生物酶的基于二氧化硅納米粒子的全娃膠體體方法；
[0027]本發(fā)明制備工藝簡(jiǎn)單、制備條件溫和，包封生物酶的全硅結(jié)構(gòu)膠體體具有良好的力學(xué)性能和化學(xué)穩(wěn)定性，可長(zhǎng)時(shí)間分散于有機(jī)介質(zhì)；
[0028]本發(fā)明以硅烷水解固結(jié)二氧化硅納米粒子制備包封生物酶的全硅膠體體可實(shí)現(xiàn)生物酶在有機(jī)介質(zhì)中的重復(fù)利用性，并且本發(fā)明的制備方法可調(diào)控殼壁為一層及一層以上二氧化硅納米粒子層殼壁，可實(shí)現(xiàn)生物酶在在有機(jī)介質(zhì)中的可控活性釋放。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0030]本發(fā)明的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊，所述膠體體微膠囊為具有一層或一層以上二氧化硅納米粒子經(jīng)硅烷水解粘結(jié)形成的殼壁結(jié)構(gòu)并包封生物酶的球形核-殼結(jié)構(gòu)微I父囊。
[0031]如上所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊，所述硅烷是指以正硅酸乙酯或正硅酸甲酯為原料與醋酸酐縮聚反應(yīng)形成的超支化硅烷。
[0032]如上所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊，所述生物酶為漆酶、脂肪酶或蛋白酶；所述的生物酶分散于緩沖溶液中，生物酶的濃度范圍為0.5?50mg/mL ;所述緩沖溶液為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液或Tris-鹽酸緩沖溶液，所述緩沖溶液的PH值為2?10。
[0033]如上所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊，所述膠體體微膠囊粒徑分布介于0.5?2 μ m ;所述膠體體微膠囊殼壁具有半通透性，其半通透性與膠體體微膠囊殼壁的厚度相關(guān)。
[0034]實(shí)施例1
[0035]A)正硅酸乙酯與甲醇以1:10的比例混合，并加入氨水調(diào)節(jié)該混合溶液pH值至12，室溫下攪拌3h ；
[0036]B)在上述步驟A)所得溶液中加入改性劑CltlH2tl-Si (OC4H9) 3，改性劑加入量與有機(jī)硅源間質(zhì)量比為1:50，繼續(xù)攪拌24h，即得到含有改性納米二氧化硅粒子的甲醇分散液；
[0037]C)將所述含改性納米二氧化硅粒子的甲醇分散液，在室溫條件下5000rpm離心處理60min，移除上層清液后，對(duì)沉淀二氧化硅進(jìn)行溶劑交換處理:首先，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子首先分散于甲醇與氯仿體積比為7:3的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；其次，將上述離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子分散于甲醇與氯仿體積比為3:7的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；再次，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子完全置換分散于氯仿中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；最后，將改性二氧化硅納米粒子分散于氯仿中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物，配制成濃度為lwt%的改性二氧化硅納米粒子氯仿待用液；
[0038]D)將C)步驟配制的改性二氧化娃納米粒子氯仿待用液與含0.5mg/ml酸性蛋白酶的PH2磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液混合，經(jīng)超聲乳化制備得改性二氧化硅納米粒子穩(wěn)定的油包水乳濁液，其中兩者質(zhì)量比為15:1 ;
[0039]E)向步驟D)制備的乳濁液中，加入與改性二氧化硅納米粒子氯仿待用液的質(zhì)量比為1:50的硅烷，室溫下攪拌水解120h，即制備出分散于氯仿的包封酸性蛋白酶的全硅膠體體微膠囊；為進(jìn)一步純化，去除未被包封的酸性蛋白酶，在3000rpm條件下離心30min,去除上清液后，再次分散于氯仿中，如此重復(fù)上述操作3次，即得平均粒徑為2 μ m的由一層二氧化硅納米粒子構(gòu)成殼壁的包封酸性蛋白酶的全硅膠體體微膠囊。
[0040]實(shí)施例2
[0041]A)正硅酸乙酯與乙醇以1:100的比例混合，并加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)該混合溶液pH值至8,室溫下攪拌36h ；[0042]B)在上述步驟A)所得溶液中加入改性劑C5Hltl-Si (OCH3) 3，改性劑加入量與有機(jī)硅源間質(zhì)量比為1:100，繼續(xù)攪拌48h，即得到含有改性納米二氧化硅粒子的乙醇分散液；
[0043]C)將所述含改性納米二氧化硅粒子的乙醇分散液，在室溫條件下7000rpm離心處理30min，移除上層清液后，對(duì)沉淀二氧化硅進(jìn)行溶劑交換處理:首先，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子首先分散于乙醇與甲苯體積比為7:3的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；其次，將上述離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子分散于乙醇與甲苯體積比為3:7的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；再次，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子完全置換分散于甲苯中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；最后，將改性二氧化硅納米粒子分散于甲苯中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物，配制成濃度為3wt%的改性二氧化硅納米粒子甲苯待用液；
[0044]D)將C)步驟配制的改性二氧化娃納米粒子甲苯待用液與含50mg/ml漆酶的pH5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液混合，經(jīng)超聲乳化制備得改性二氧化硅納米粒子穩(wěn)定的油包水乳濁液，其中兩者質(zhì)量比為10:1 ;
[0045]E)向步驟D)制備的乳濁液中，加入與改性二氧化硅納米粒子甲苯待用液的質(zhì)量比為1:100的硅烷，室溫下攪拌水解48h，即制備出分散于甲苯的包封漆酶的全硅膠體體微膠囊；為進(jìn)一步純化，去除未被包封的漆酶，在5000rpm條件下離心lOmin，去除上清液后，再次分散于甲苯中，如此重復(fù)上述操作5次，即得平均粒徑為I μ m的由一層二氧化硅納米粒子構(gòu)成殼壁的包封漆酶的全硅膠體體微膠囊。
[0046]實(shí)施例3
[0047]A)正硅酸甲酯與乙醇以1:50的比例混合，并加入氨水調(diào)節(jié)該混合溶液pH值至11，室溫下攪拌IOh ；
[0048]B)在上述步驟A)所得溶液中加入改性劑C18H36_Si(0C2H5)3，改性劑加入量與有機(jī)硅源間質(zhì)量比為1:60，繼續(xù)攪拌120h，即得到含有改性納米二氧化硅粒子的乙醇分散液；
[0049]C)將所述含改性納米二氧化硅粒子的乙醇分散液，在室溫條件下13000rpm離心處理15min，移除上層清液后，對(duì)沉淀二氧化硅進(jìn)行溶劑交換處理:首先，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子首先分散于乙醇與四氫呋喃體積比為7:3的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；其次，將上述離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子分散于乙醇醇與四氫呋喃體積比為3:7的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；再次，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子完全置換分散于四氫呋喃中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；最后，將改性二氧化硅納米粒子分散于四氫呋喃中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物，配制成濃度為5wt%的改性二氧化硅納米粒子四氫呋喃待用液；
[0050]D)將C)步驟配制的改性二氧化硅納米粒子四氫呋喃待用液與含30mg/ml脂肪酶的pH7.5磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液混合，經(jīng)超聲乳化制備得改性二氧化硅納米粒子穩(wěn)定的油包水乳濁液，其中兩者質(zhì)量比為10:1 ;
[0051]E)向步驟D)制備的乳濁液中，加入與改性二氧化硅納米粒子四氫呋喃待用液的質(zhì)量比為1:60的硅烷，室溫下攪拌水解96h，即制備出分散于四氫呋喃的包封脂肪酶的全娃膠體體微膠囊；為進(jìn)一步純化，去除未被包封的脂肪酶，在4000rpm條件下離心20min,去除上清液后，再次分散于四氫呋喃中，如此重復(fù)上述操作3次，即得平均粒徑為0.7 μ m的由二層二氧化硅納米粒子構(gòu)成殼壁的包封脂肪酶的全硅膠體體微膠囊。
[0052]實(shí)施例4
[0053]A)正硅酸乙酯與甲醇以1:30的比例混合，并加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)該混合溶液pH值至12，室溫下攪拌24h ；
[0054]B)在上述步驟A)所得溶液中加入改性劑CltlH2tl-Si (OCH3) 3，改性劑加入量與有機(jī)硅源間質(zhì)量比為1:70，繼續(xù)攪拌96h，即得到含有改性納米二氧化硅粒子的甲醇分散液；
[0055]C)將所述含改性納米二氧化硅粒子的甲醇分散液，在室溫條件下IOOOOrpm離心處理20min，移除上層清液后，對(duì)沉淀二氧化硅進(jìn)行溶劑交換處理:首先，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子首先分散于甲醇與苯體積比為7:3的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；其次，將上述離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子分散于甲醇與苯體積比為3:7的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；再次，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子完全置換分散于苯中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；最后，將改性二氧化硅納米粒子分散于苯中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物，配制成濃度為8wt%的改性二氧化硅納米粒子苯待用液；
[0056]D)將C)步驟配制的改性二氧化娃納米粒子苯待用液與含40mg/ml蛋白酶的PHlOTrish-鹽酸緩沖溶液混合，經(jīng)超聲乳化制備得改性二氧化硅納米粒子穩(wěn)定的油包水乳濁液，其中兩者質(zhì)量比為5:1 ；
[0057]E)向步驟D)制備的乳濁液中，加入與改性二氧化硅納米粒子苯待用液的質(zhì)量比為1:70的硅烷，室溫下攪拌水解72h，即制備出分散于苯的包封蛋白酶的全硅膠體體微膠囊；為進(jìn)一步純化，去除未被包封的蛋白酶，室溫條件下抽濾分散于苯的包封生物酶的全硅膠體體微膠囊后，收集沉積于濾膜上的包封蛋白酶的全硅膠體體，再次分散于苯中，如此重復(fù)上述操作3次，即得平均粒徑為0.8 μ m的由二層二氧化硅納米粒子構(gòu)成殼壁的包封蛋白酶的全硅膠體體微膠囊。
[0058]實(shí)施例5
[0059]A)正硅酸甲酯與甲醇以1:70的比例混合，并加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)該混合溶液pH值至12，室溫下攪拌48h ；
[0060]B)在上述步驟A)所得溶液中加入改性劑CltlH2tl-Si (OC2H5) 3，改性劑加入量與有機(jī)硅源間質(zhì)量比為1:70，繼續(xù)攪拌96h，即得到含有改性納米二氧化硅粒子的甲醇分散液；
[0061]C)將所述含改性納米二氧化硅粒子的甲醇分散液，在室溫條件下IOOOOrpm離心處理60min，移除上層清液后，對(duì)沉淀二氧化硅進(jìn)行溶劑交換處理:首先，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子首先分散于甲醇與乙酸乙酯體積比為7:3的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；其次，將上述離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子分散于甲醇與乙酸乙酯體積比為3:7的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；再次，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子完全置換分散于乙酸乙酯中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；最后，將改性二氧化硅納米粒子分散于乙酸乙酯中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物，配制成濃度為10wt%的改性二氧化硅納米粒子乙酸乙酯待用液；
[0062]D)將C)步驟配制的改性二氧化硅納米粒子乙酸乙酯待用液與含10mg/ml蛋白酶的PH5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液混合，經(jīng)超聲乳化制備得改性二氧化硅納米粒子穩(wěn)定的油包水乳濁液，其中兩者質(zhì)量比為6:1
[0063]E)向步驟D)制備的乳濁液中，加入與改性二氧化硅納米粒子乙酸乙酯待用液的質(zhì)量比為1:70的硅烷，室溫下攪拌水解72h，即制備出分散于乙酸乙酯的包封蛋白酶的全硅膠體體微膠囊；為進(jìn)一步純化，去除未被包封的蛋白酶，室溫條件下抽濾分散于苯的包封生物酶的全硅膠體體微膠囊后，收集沉積于濾膜上的包封蛋白酶的全硅膠體體，再次分散于乙酸乙酯中，如此重復(fù)上述操作5次，即得平均粒徑為0.5 μ m的由三層層二氧化硅納米粒子構(gòu)成殼壁的包封蛋白酶的全硅膠體體微膠囊。
[0064]實(shí)施例6
[0065]A)正硅酸乙酯與乙醇以1:80的比例混合，并加入氨水調(diào)節(jié)該混合溶液pH值至10，室溫下攪拌12h ；
[0066]B)在上述步驟A)所得溶液中加入改性劑C18H36-Si (OCH3) 3，改性劑加入量與有機(jī)硅源間質(zhì)量比為1:80，繼續(xù)攪拌100h，即得到含有改性納米二氧化硅粒子的乙醇分散液；
[0067]C)將所述含改性納米二氧化硅粒子的乙醇分散液，在室溫條件下9000rpm離心處理30min，移除上層清液后，對(duì)沉淀二氧化硅進(jìn)行溶劑交換處理:首先，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子首先分散于乙醇與甲苯體積比為7:3的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；其次，將上述離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子分散于乙醇與甲苯體積比為3:7的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；再次，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子完全置換分散于甲苯中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；最后，將改性二氧化硅納米粒子分散于甲苯中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物，配制成濃度為2wt%的改性二氧化硅納米粒子甲苯待用液；
[0068]D)將C)步驟配制的改性二氧化娃納米粒子甲苯待用液與含10mg/ml漆酶的pH5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液混合，經(jīng)超聲乳化制備得改性二氧化硅納米粒子穩(wěn)定的油包水乳濁液，其中兩者質(zhì)量比為10:1 ;
[0069]E)向步驟D)制備的乳濁液中，加入與改性二氧化硅納米粒子甲苯待用液的質(zhì)量比為1:80的硅烷，室溫下攪拌水解120h，即制備出分散于甲苯的包封漆酶的全硅膠體體微膠囊；為進(jìn)一步純化，去除未被包封的漆酶，室溫條件下抽濾分散于甲苯的包封漆酶的全硅膠體體微膠囊后，收集沉積于濾膜上的包封蛋白酶的全硅膠體體，再次分散于甲苯中，如此重復(fù)上述操作3次，即得平均粒徑為1.5 μ m的由一層二氧化硅納米粒子構(gòu)成殼壁的包封漆的全硅膠體體微膠囊。
[0070]實(shí)施例7
[0071]A)正硅酸甲酯與乙醇以1:90的比例混合，并加入氨水調(diào)節(jié)該混合溶液pH值至11，室溫下攪拌IOh ；
[0072]B)在上述步驟A)所得溶液中加入改性劑C12H24_Si(0C2H5)3，改性劑加入量與有機(jī)硅源間質(zhì)量比為1:60，繼續(xù)攪拌120h，即得到含有改性納米二氧化硅粒子的乙醇分散液；[0073]C)將所述含改性納米二氧化硅粒子的乙醇分散液，在室溫條件下13000rpm離心處理15min，移除上層清液后，對(duì)沉淀二氧化硅進(jìn)行溶劑交換處理:首先，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子首先分散于乙醇與四氯化碳體積比為7:3的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；其次，將上述離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子分散于乙醇醇與四氯化碳體積比為3:7的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；再次，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子完全置換分散于四氯化碳中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；最后，將改性二氧化硅納米粒子分散于四氫呋喃中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物，配制成濃度為4wt%的改性二氧化硅納米粒子四氯化碳待用液；
[0074]D)將C)步驟配制的改性二氧化硅納米粒子四氯化碳待用液與含10mg/ml脂肪酶的pH7.5磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液混合，經(jīng)超聲乳化制備得改性二氧化硅納米粒子穩(wěn)定的油包水乳濁液，其中兩者質(zhì)量比為10:1 ;
[0075]E)向步驟D)制備的乳濁液中，加入與改性二氧化硅納米粒子四氯化碳待用液的質(zhì)量比為1:100的硅烷，室溫下攪拌水解100h，即制備出分散于四氯化碳的包封脂肪酶的全娃膠體體微膠囊，平均粒徑0.8 μ m,殼壁由二層二氧化娃納米粒子構(gòu)成。
[0076]實(shí)施例8
[0077]A)正硅酸甲酯與乙醇以1:30的比例混合，并加入氨水調(diào)節(jié)該混合溶液pH值至11，室溫下攪拌IOh ；
[0078]B)在上述步驟A)所得溶液中加入改性劑C12H24-Si (OC2H5) 3，改性劑加入量與有機(jī)硅源間質(zhì)量比為1:70，繼續(xù)攪拌24h，即得到含有改性納米二氧化硅粒子的乙醇分散液；
[0079]C)將所述含改性納米二氧化硅粒子的乙醇分散液，在室溫條件下13000rpm離心處理15min，移除上層清液后，對(duì)沉淀二氧化硅進(jìn)行溶劑交換處理:首先，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子首先分散于乙醇與甲苯體積比為7:3的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；其次，將上述離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子分散于乙醇醇與甲苯體積比為3:7的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；再次，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子完全置換分散于甲苯中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；最后，將改性二氧化硅納米粒子分散于甲苯中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物，配制成濃度為5wt%的改性二氧化硅納米粒子甲苯待用液；
[0080]D)將C)步驟配制的改性二氧化硅納米粒子甲苯待用液與含50mg/ml脂肪酶的PH7.5磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液混合，經(jīng)超聲乳化制備得改性二氧化硅納米粒子穩(wěn)定的油包水乳濁液，其中兩者質(zhì)量比為10:1 ;
[0081]E)向步驟D)制備的乳濁液中，加入與改性二氧化硅納米粒子甲苯待用液的質(zhì)量比為1:100的硅烷，室溫下攪拌水解100h，即制備出分散于甲苯的包封脂肪酶的全硅膠體體微膠囊，平均粒徑0.6 μ m,殼壁由二層二氧化娃納米粒子構(gòu)成。
[0082]實(shí)施例9
[0083]A)正硅酸乙酯與乙醇以1:30的比例混合，并加入氨水調(diào)節(jié)該混合溶液pH值至11，室溫下攪拌24h;
[0084]B)在上述步驟A)所得溶液中加入改性劑C12H24-Si (OCH3) 3，改性劑加入量與有機(jī)硅源間質(zhì)量比為1:70，繼續(xù)攪拌24h，即得到含有改性納米二氧化硅粒子的乙醇分散液；
[0085]C)將所述含改性納米二氧化硅粒子的乙醇分散液，在室溫條件下13000rpm離心處理15min，移除上層清液后，對(duì)沉淀二氧化硅進(jìn)行溶劑交換處理:首先，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子首先分散于乙醇與甲苯體積比為7:3的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；其次，將上述離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子分散于乙醇醇與甲苯體積比為3:7的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；再次，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子完全置換分散于甲苯中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；最后，將改性二氧化硅納米粒子分散于甲苯中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物，配制成濃度為3wt%的改性二氧化硅納米粒子甲苯待用液；
[0086]D)將C)步驟配制的改性二氧化娃納米粒子甲苯待用液與含10mg/ml蛋白酶的PHlOTris-鹽酸緩沖溶液混合，經(jīng)超聲乳化制備得改性二氧化硅納米粒子穩(wěn)定的油包水乳濁液，其中兩者質(zhì)量比為10:1 ；
[0087]E)向步驟D)制備的乳濁液中，加入與改性二氧化硅納米粒子甲苯待用液的質(zhì)量比為1:80的硅烷，室溫下攪拌水解72h，即制備出分散于甲苯的包封蛋白酶的全硅膠體體微膠囊；平均粒徑I μ m,殼壁由一層二氧化娃納米粒子構(gòu)成
[0088]實(shí)施例10
[0089]A)正硅酸甲酯與甲醇以1:70的比例混合，并加入氨水調(diào)節(jié)該混合溶液pH值至11，室溫下攪拌3h;
[0090]B)在上述步驟A)所得溶液中加入改性劑CltlH2tl-Si (OCH3) 3，改性劑加入量與有機(jī)硅源間質(zhì)量比為1:70，繼續(xù)攪拌24h，即得到含有改性納米二氧化硅粒子的乙醇分散液；
[0091]C)將所述含改性納米二氧化硅粒子的甲醇分散液，在室溫條件下13000rpm離心處理15min，移除上層清液后，對(duì)沉淀二氧化硅進(jìn)行溶劑交換處理:首先，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子首先分散于甲醇與甲苯體積比為7:3的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；其次，將上述離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子分散于甲醇與甲苯體積比為3:7的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；再次，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子完全置換分散于甲苯中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；最后，將改性二氧化硅納米粒子分散于甲苯中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物，配制成濃度為7wt%的改性二氧化硅納米粒子甲苯待用液；
[0092]D)將C)步驟配制的改性二氧化娃納米粒子甲苯待用液與含20mg/ml蛋白酶的PHlOTris-鹽酸緩沖溶液混合，經(jīng)超聲乳化制備得改性二氧化硅納米粒子穩(wěn)定的油包水乳濁液，其中兩者質(zhì)量比為10:1 ；
[0093]E)向步驟D)制備的乳濁液中，加入與改性二氧化硅納米粒子甲苯待用液的質(zhì)量比為1:80的硅烷，室溫下攪拌水解72h，即制備出分散于甲苯的包封生物酶的全硅膠體體微膠囊；平均粒徑0.5 μ m,殼壁由三層二氧化娃納米粒子構(gòu)成。
【權(quán)利要求】
1.一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊，其特征是:所述膠體體微膠囊為具有一層或一層以上二氧化硅納米粒子經(jīng)硅烷水解粘結(jié)形成的殼壁結(jié)構(gòu)并包封生物酶的球形核-殼結(jié)構(gòu)微I父囊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊，其特征在于，所述硅烷是指以正硅酸乙酯或正硅酸甲酯為原料與醋酸酐縮聚反應(yīng)形成的超支化硅烷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊，其特征在于，所述生物酶為漆酶、脂肪酶或蛋白酶；所述的生物酶分散于緩沖溶液中，生物酶的濃度范圍為0.5~50mg/mL ;所述緩沖溶液為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、磷酸氫二鈉_磷酸二氫鈉緩沖溶液或Tris-鹽酸緩沖溶液，所述緩沖溶液的pH值為2~10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊，其特征在于，所述膠體體微膠囊粒徑分布介于0.5~2 μ m ;所述膠體體微膠囊殼壁具有半通透性，其半通透性與膠體體微膠囊殼壁的厚度相關(guān)。
5.如權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊的制備方法，其特征是包括以下步驟: A)將有機(jī)硅源溶于醇溶液中，控制溶液pH值為8~12; B)在上述步驟A)所得溶液中加入改性劑，并繼續(xù)攪拌，得到含有改性納米二氧化硅粒子的醇分散液； C)將所述含改性納米二氧化硅粒 子的醇分散液，在室溫條件下離心處理，移除上層清液后，對(duì)沉淀二氧化硅進(jìn)行溶劑交換處理；重復(fù)離心處理并移除上層清液后進(jìn)行溶劑交換處理的操作3~5次，最終將沉淀的改性二氧化硅分散于有機(jī)溶劑中，配制成濃度為I~10wt%的改性二氧化硅納米粒子有機(jī)溶劑待用液； D)將所述改性二氧化硅納米粒子有機(jī)溶劑待用液與含生物酶的緩沖溶液混合，兩者質(zhì)量比為5~15:1，經(jīng)超聲乳化制備得改性二氧化硅納米粒子穩(wěn)定的油包水乳濁液； E)向所述乳濁液中，加入硅烷，加入量與改性二氧化硅納米粒子有機(jī)溶劑待用液的質(zhì)量比為1:50~100，室溫下攪拌水解24~120h，即得到分散于有機(jī)溶劑的包封生物酶的全硅膠體體微膠囊。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊的制備方法，其特征在于，步驟A)中:有機(jī)硅源與醇溶液質(zhì)量比為1:10~100 ;有機(jī)硅源溶于醇溶液時(shí)，在室溫下攪拌3~48h ;所述的有機(jī)硅源為正硅酸乙酯或正硅酸甲酯；所述的醇為甲醇或乙醇；控制溶液pH值采用氫氧化鈉溶液、碳酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液或氨水。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊的制備方法，其特征在于，步驟B)中:所述改性劑的分子式為CnH2n-Si (OCmH2m+1) 3，其中η為5~18，m為I~4 ;所述改性劑加入量與有機(jī)硅源間質(zhì)量比為1:50~100 ;所述繼續(xù)攪拌的時(shí)間為24~120h。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊的制備方法，其特征在于，步驟C)中:所述離心處理時(shí)間為15~60min,離心轉(zhuǎn)述為5000~13000rpm。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊的制備方法，其特征在于，所述的溶劑交換處理是指實(shí)現(xiàn)改性二氧化硅納米粒子分散體系由醇溶液完全交換為有機(jī)溶劑的過程:首先，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子首先分散于醇與有機(jī)溶劑體積比為7:3的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；其次，將上述離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子分散于醇與有機(jī)溶劑體積比為3:7的混合溶液中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；再次，將離心沉淀的改性二氧化硅納米粒子完全置換分散于有機(jī)溶劑中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物存在后，離心處理并移除上層清液；最后，將改性二氧化硅納米粒子完全置換分散于有機(jī)溶劑中至肉眼觀測(cè)無(wú)大顆粒團(tuán)聚物，形成改性二氧化硅納米粒子有機(jī)溶劑待用液；所述有機(jī)溶劑為四氯化碳、四氫呋喃、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種包封生物酶的全硅膠體體微膠囊的制備方法，其特征在于，進(jìn)一步地，將所述步驟E)得到的包封生物酶的全硅膠體體微膠囊進(jìn)行抽濾處理或離心處理； 所述抽濾處理是將所述步驟E)得到的包封生物酶的全硅膠體體微膠囊有機(jī)溶劑分散體系，室溫下抽濾處理，收集沉積于濾膜上包封生物酶的全硅膠體體，并分散于有機(jī)溶劑中；如此重復(fù)3~5次抽濾和分散，以去除未被包封的生物酶； 所述離心處理是將所述步驟E)得到的包封生物酶的全硅膠體體微膠囊有機(jī)溶劑分散體系，在3000~5000rpm轉(zhuǎn)速下離心5~30min,取沉淀的包封生物酶的全硅膠體體微膠囊再次分散于有機(jī)溶劑； 如此重復(fù)離心和分散3~5次，以去除未被包封的生物酶。
【文檔編號(hào)】B01J13/02GK103464062SQ201310401109
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】閻克路, 張弛, 胡春艷 申請(qǐng)人:東華大學(xué)