通過混合模式液相色譜法分離聚糖的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的一種示例性多峰色譜介質(zhì)包括與一種或多種反相和/或親水相互作用色譜結(jié)合位點(diǎn)組合的一種或多種強(qiáng)陰離子交換、弱陰離子交換、強(qiáng)陽離子交換和/或弱陽離子交換的結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，這些位點(diǎn)與一種聚糖混合物中的一種或多種聚糖相互作用，其方式為允許分離該混合物中的聚糖并且分析該聚糖混合物。將這種介質(zhì)結(jié)合到用于色譜分析的裝置和系統(tǒng)中。還提供了使用本發(fā)明的多峰介質(zhì)來分析聚糖的方法。
【專利說明】通過混合模式液相色譜法分離聚糖
發(fā)明背景
[0001]聚糖作為糖蛋白類、糖脂類、和蛋白聚糖類的一部分以游離狀態(tài)以及共軛形式廣泛分布在生物系統(tǒng)中。它們被包括在廣泛范圍的生物和生理過程中，這些生物和生理過程包括認(rèn)知、調(diào)節(jié)功能、細(xì)胞交流、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)治療的穩(wěn)定性和活性、細(xì)胞免疫、生長(zhǎng)和發(fā)育。聚糖的生物和生理功能常常取決于附接在這些蛋白質(zhì)和脂類上的低聚糖的結(jié)構(gòu)和類型。聚糖的結(jié)構(gòu)由于轉(zhuǎn)譯后修飾和生理?xiàng)l件是相當(dāng)多樣和復(fù)雜的。因此，分析綜合的聚糖譜(profiles) (B卩，糖組)并且確定用于臨床用途的聚糖的結(jié)構(gòu)是具有高度挑戰(zhàn)性的。
[0002]HPAEC-PAD (具有脈沖安培檢測(cè)的高效陰離子交換色譜)是對(duì)于聚糖分析開發(fā)的第一種常規(guī)測(cè)定方法。該離子色譜(IC)方法可以經(jīng)由在高pH下聚糖的羥基基團(tuán)與色譜介質(zhì)的特殊相互作用來分離糖類。這些聚糖作為陰離子種類進(jìn)行色譜分析并且基于聚糖電荷、尺寸、構(gòu)成、異構(gòu)體和連接鍵與柱相互作用。該分析方法提供存在于一種產(chǎn)品上的、或在一個(gè)特定糖基化位點(diǎn)上的整體糖基化或低聚糖群體的譜，這可以用于分批比較研究。然而，聚糖的HPAEC-PAD分離的一個(gè)顯著缺點(diǎn)是需要使用相對(duì)高的鹽濃度。在此種情況下，常常使用一種脫鹽柱，以使得流動(dòng)相與質(zhì)譜法相兼容。
[0003]對(duì)于聚糖的分析已開發(fā)了不同模式的HPLC分離，包括正相或親水相互作用(HILIC)、離子交換和反相。因?yàn)榫厶鞘歉叨扔H水和極性的物質(zhì)，所以HILIC廣泛用于聚糖分析。這些分離柱典型地是酰胺、胺或基于兩性離子的填充材料。該酰胺HILIC柱主要通過氫鍵合分離聚糖，導(dǎo)致基于尺寸和構(gòu)成的分離。然而，用該方法可以實(shí)現(xiàn)不基于電荷的分離。基于胺的和兩性離子的柱均顯示了與帶電聚糖(自然的或標(biāo)記的)的相互作用，并且盡管它們基于電荷分離聚糖，它們提供了在具有相同電荷(例如，電荷的極性和/或大小)的聚糖之間的相對(duì)低的分辨率。此外，在多樣的帶電聚糖之間的固有地強(qiáng)烈的離子相互作用和固定相常常要求高洗脫緩沖劑濃度，不利地影響MS靈敏度。
[0004]一些報(bào)道已經(jīng)描述了使用氨基的或季銨化胺基的柱作為用于聚糖分析的陰離子交換/HILIC混合模式柱(Ruhaak等人，分析化學(xué)和生物分析化學(xué)(Anal.Bioanal Chem)(2010) 397:3457-3481 ;Anumula 等人，分析生物化學(xué)(Anal Biochem) (2000) 283:17-26 ；以及Neville等人，蛋白質(zhì)組研究雜志(J Proteome Res) (2009)8:681-687)。然而，以上參考的這些氨基或季銨化胺基的柱只具有一種模式，該模式是一種離子交換模式，并且因此不是混合模式。此外，這些柱只具有一種類型的色譜官能團(tuán)，該色譜官能團(tuán)在此種情況下是一種氨基亦或季銨化的胺基。以上這些參考文獻(xiàn)未描述在該氨基基團(tuán)將具有中性電荷(即，未質(zhì)子化的)的PH范圍內(nèi)的分離條件。應(yīng)注意，季銨化的胺基甚至在高pH下不能具有中性電荷。一種質(zhì)子化的胺基基團(tuán)將作為陰離子交換基團(tuán)并且不作為HILIC基團(tuán)。應(yīng)該注意的是，盡管隨著增加溶劑濃度而增加保留時(shí)間提供了一種HILIC相互作用的證據(jù)，但它還提供其他保留模式，如離子交換模式和鹽與兩性離子的相互作用模式的證據(jù)。這樣，隨著增加溶劑濃度而增加保留時(shí)間自身并不表明一種HILIC相互作用。氨基和季銨化的胺基的柱遭受具有長(zhǎng)保留時(shí)間(例如，>60分鐘)并且要求相對(duì)高的鹽濃度的缺點(diǎn)影響?？傮w上，相對(duì)高的鹽濃度干擾用質(zhì)譜法檢測(cè)聚糖。[0005]報(bào)道已經(jīng)描述了使用兩性離子磺基甜菜堿柱作為一個(gè)兩性離子的離子色譜(ZIC) /HILIC混合模式柱用于聚糖分析(Ruhaak等人，分析化學(xué)和生物分析化學(xué)(Anal.Bioanal Chem) (2010) 397:3457-3481 ;Takegawa 等人，色譜法雜志 A 輯(Journal ofChromatography A)(2006)1113:177-181 ;以及 Takegawa 等人，分離科學(xué)雜志(J Sep Sci )(2006) 29:2533-2540)。然而，以上參考的這些兩性離子柱只具有一種模式，該模式是一種基于磺基甜菜堿固定相的兩性離子模式，并且因此不是混合模式。此外，這些柱只具有一種類型的色譜官能團(tuán)，該官能團(tuán)在此種情況下是一種兩性離子磺基甜菜堿基團(tuán)。此類磺基甜菜堿基團(tuán)在非常廣泛的pH范圍內(nèi)是凈中性的，以取決于離子強(qiáng)度的方式經(jīng)由靜電機(jī)制與鹽相互作用，這不同于不帶電的HILIC機(jī)制。應(yīng)該注意的是，盡管隨著增加溶劑濃度而增加保留時(shí)間提供HILIC相互作用的證據(jù)，它還表明了其他保留模式，如離子交換模式和鹽與兩性離子的相互作用的模式。這樣，隨著增加溶劑濃度而增加保留時(shí)間自身并不表明一種HILIC相互作用。該兩性離子相柱遭受對(duì)于具有相同電荷的聚糖基團(tuán)顯示相對(duì)差的分辨率的缺點(diǎn)影響。
[0006]通常非常希望的是通過使用質(zhì)譜法檢測(cè)和表征洗出液中的聚糖分析物，然而，本領(lǐng)域清楚地傳授，當(dāng)與質(zhì)譜檢測(cè)相結(jié)合時(shí)，在陰離子交換相是高度離子化的條件下進(jìn)行工作是不可接受的。該兩性離子模式經(jīng)由一種鹽交換保留機(jī)制進(jìn)行工作，這比離子交換固有地具有更低的選擇性。高溶劑濃度僅僅增加這些鹽交換相互作用的強(qiáng)度。
[0007] 申請(qǐng)人:相信，存在對(duì)于新的多峰色譜介質(zhì)以及使用這些介質(zhì)分析聚糖的方法的需要，該方法將理想地提供在不同聚糖之間的高分辨率，基于尺寸、構(gòu)成、結(jié)構(gòu)(例如，異構(gòu)體、連接鍵)、和/或電荷的單一選擇性。而且， 申請(qǐng)人:還相信，如果可以通過不具有、或具有極小的清理或純化后分析和預(yù)檢測(cè)(例如，熒光標(biāo)記)的標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)(例如，質(zhì)譜法、熒光檢測(cè))來檢測(cè)從該介質(zhì)中洗脫出來的聚糖，這將大大簡(jiǎn)化并且有助于聚糖分析。本發(fā)明提供此類色譜介質(zhì)以及使用它們的方法。
發(fā)明概述
[0008]在一個(gè)示例性實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種在聚糖混合物的分析中具有獨(dú)特使用特性的真正的多峰色譜介質(zhì)(固定相)。本發(fā)明的色譜介質(zhì)包括一個(gè)離子交換色譜部分和一個(gè)結(jié)合到一種固體基質(zhì)(例如，顆粒、單塊)上的不帶電的色譜部分。在不同的實(shí)施例中，該不帶電的色譜部分是一個(gè)反相色譜部分和一個(gè)親水相互作用色譜部分中的一個(gè)或多個(gè)。這些離子交換部分是弱的或強(qiáng)的陰離子或陽離子交換部分。本發(fā)明的色譜介質(zhì)是一種雙峰或三峰的色譜介質(zhì)，適合于分析廣泛范圍的聚糖，包括在含有聚糖的生物分子中存在的那些聚糖。
[0009]在它的優(yōu)點(diǎn)之中，本發(fā)明的多峰色譜介質(zhì)是用于通過HPLC分析聚糖的一種優(yōu)異方法的一種組成部分，并且是基于提供對(duì)于不同聚糖的所希望的選擇性的高度多用途的化學(xué)平臺(tái)。此外，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供基于在電荷、連接鍵、異構(gòu)體和尺寸上的差異的對(duì)于復(fù)合聚糖的優(yōu)異分辨率。因?yàn)樵摱喾褰橘|(zhì)的獨(dú)特化學(xué)性質(zhì)，來自在該介質(zhì)上的聚糖的色譜分離的洗脫液與通過熒光和質(zhì)譜法檢測(cè)洗脫的聚糖是高度相兼容的。
[0010]在不同的實(shí)施例中，本發(fā)明提供在分析和/或分離聚糖混合物中使用這種多峰色譜介質(zhì)的方法。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種將聚糖混合物的一種第一聚糖組分與一種第二聚糖組分分離的多峰色譜方法。一種示例性方法包括，(a)使該聚糖混合物與一種多峰色譜介質(zhì)接觸，該多峰色譜介質(zhì)包含一個(gè)結(jié)合到一種第一基質(zhì)上的離子交換色譜部分和一個(gè)結(jié)合到一種第二基質(zhì)上的不帶電的色譜部分。該不帶電的色譜部分選自一個(gè)反相色譜部分、一個(gè)親水相互作用色譜部分以及它們的組合。如在一種色譜程序中典型的，在有效地實(shí)現(xiàn)該聚糖混合物的至少兩種組分的分離的條件下，通過使該介質(zhì)和同介質(zhì)結(jié)合的聚糖與一種洗脫液接觸，將該聚糖混合物從該柱中洗脫出來。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，所述洗脫液包含適合于在陰離子交換或陽離子交換色譜法中使用的并且與該色譜介質(zhì)兼容的一種電解質(zhì)。
[0011 ] 在不同的實(shí)施例中，本發(fā)明還提供用于通過在離子交換的活化類似物與在一種固體載體上的具有互補(bǔ)反應(yīng)性基團(tuán)的不帶電的色譜部分之間的反應(yīng)來制備本發(fā)明的色譜介質(zhì)的方法。
[0012]在本發(fā)明的所選擇的實(shí)施例中還提供含有本發(fā)明的多峰介質(zhì)的色譜裝置(例如柱)，以及使用該介質(zhì)和此類裝置進(jìn)行聚糖的色譜分離和分析的方法。
[0013]在一個(gè)示例性實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種色譜系統(tǒng)，該色譜系統(tǒng)包括一種含有本發(fā)明的色譜介質(zhì)的分離裝置。該系統(tǒng)任選地進(jìn)一步包括在進(jìn)行一種聚糖的色譜分離中使用的部件，例如，一種質(zhì)譜或熒光檢測(cè)器。
[0014]在以下詳細(xì)說明中提供本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點(diǎn)和方面。
附圖簡(jiǎn)要說明
[0015]圖1是示出通過一個(gè)填充有WAX/HILIC (相22，1.9μπι)的柱從牛胎球蛋白中分離2ΑΒ連接的N-聚糖的色譜圖。通過熒光檢測(cè)來檢測(cè)這些峰。該色譜分析是在Ultimate-3000UHPLC儀器上進(jìn)行的。中性聚糖峰在單唾液酸化的聚糖之前被洗脫，單唾液酸化的聚糖在二唾液酸化的之前被洗脫，雙唾液酸化的種類在三唾液酸化的峰之前被洗脫，三唾液酸化的在四唾液酸化的之前并且四唾液酸化的在五唾液酸化的種類之前被洗脫。
[0016]圖2A和2B是示出通過一個(gè)填充有WAX/HILIC (相22，1.9 μ m)柱的柱從人類IgG中分離2AA連接的N-聚糖的色譜圖。該分離使用Ultimate3000UHPLC系統(tǒng)使用二元梯度條件進(jìn)行。用Q-Exactive儀器記錄MS光譜。A.通過一個(gè)熒光檢測(cè)器檢測(cè)峰，B.通過具有從400道爾頓至2200道爾頓的質(zhì)譜掃描范圍的處于負(fù)模式的MS檢測(cè)來檢測(cè)峰。通過來自Simglycan軟件的LC-MS/MS數(shù)據(jù)來表征每個(gè)峰上的聚糖。在表I中示出了存在于IgG中的聚糖的清單。
[0017]圖3A和3B是示出通過兩種不同的柱從牛胎球蛋白中的2AB連接的N-聚糖的對(duì)比分離的色譜圖。這兩種柱的所有峰通過具有質(zhì)譜掃描范圍400道爾頓至2200道爾頓的處于負(fù)模式的MS檢測(cè)來檢測(cè)。A.在一個(gè)WAX/HILIC (相22，1.9 μ m)柱中的色譜分析，B.在一個(gè)商業(yè)酰胺HILIC柱(1.7 μ m)中的色譜分析。該WAX/HILIC (相22，1.9 μ m)柱提供就基于電荷、尺寸、極性的選擇性和基于峰寬度的分辨率而言優(yōu)于1.7 μ m商業(yè)酰胺HILIC柱的分離。在實(shí)例部分中提供用于分離的梯度條件。在表7中示出了在牛胎球蛋白中所識(shí)別的聚糖的清單。
[0018]圖4是使用一個(gè)WAX/HILIC(相22，1.9μ m)柱的來自牛胎球蛋白的未標(biāo)記的N-聚糖的LC-MS分析。未標(biāo)記的聚糖是基于電荷、尺寸和極性而進(jìn)行分離。所有的聚糖峰通過具有400道爾頓至2200道爾頓的質(zhì)譜掃描范圍的處于負(fù)模式的MS檢測(cè)來檢測(cè)。未標(biāo)記的聚糖的N-聚糖譜定量地不同于來自牛胎球蛋白的同一樣品的標(biāo)記的聚糖。例如，在圖4中未標(biāo)記的聚糖的雙唾液酸化的聚糖峰7-12的定量譜不同于圖3A中的2AB-標(biāo)記的二脫唾液酸化的聚糖峰11-15。
[0019]圖5是使用WAX/RP (相21，1.9 μ m)混合模式柱從牛胎球蛋白中分離2AB-N-聚糖。聚糖是使用基于電荷、尺寸、異構(gòu)體和極性的高分辨率(分辨出多達(dá)40個(gè)峰)來進(jìn)行分離的。
該柱提供來自牛胎球蛋白的2AB標(biāo)記的N-聚糖的峰的數(shù)量(~44)多于如分別在圖3B和圖3A中示出的一種示例性商業(yè)柱d26個(gè)峰)和WAX/HILIC (相22，1.9 μ m)柱。
[0020]圖6是示出使用一步梯度條件使用一個(gè)WAX/HILIC (相22，1.9 μ m)柱從牛胎球蛋白中分離2AB標(biāo)記的N-聚糖的色譜圖。該流動(dòng)相具有的水性比例高于在圖1中使用的，導(dǎo)致具有共同電荷的所有聚糖作為一個(gè)單一峰聚結(jié)在一起并且允許對(duì)于這些電荷狀態(tài)各自的容易和準(zhǔn)確的定量。通過熒光檢測(cè)來檢測(cè)這些峰。由每個(gè)峰的曲線下相對(duì)面積(AUC)(表10)來確定對(duì)于每個(gè)電荷狀態(tài)聚糖的定量。
[0021 ] 圖7示出了 WAX/RP混合模式介質(zhì)的制備。
[0022]圖8是對(duì)于陰離子交換/反相混合模式相的陰離子交換容量測(cè)定的色譜圖。柱:相21(1.9-μ m);尺寸:2.1X 150-mm ;流動(dòng)相:乙腈 /IOOmM 乙酸銨緩沖劑，pH5=50/50(v/v);流速:0.21mL/min ;注射體積:1 μ L ;溫度:30°C ;檢測(cè):220nm下的UV ;峰:1.尿嘧啶；2.辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基芐基銨(octylphenoxyethoxyethyl dimethylbenzyl ammonium)；
3.甲苯磺酸鈉；以及4.丙基苯。
[0023]圖9示出了 WAX/HILIC混合模式介質(zhì)的制備。
[0024]圖10是對(duì)于HILIC/陰離子交換混合模式相的陰離子交換容量測(cè)定的色譜圖。柱:相 22 (1.9-μ m);尺寸:2.1 X 150-mm;流動(dòng)相:乙腈/IOOmM 乙酸銨緩沖劑，pH5=90/10 (v/V);流速:0.21mL/min ;注射體積:1 μ L` ;溫度:30°C ;檢測(cè):220nm下的UV ;峰:1.醋氨酚；2.水楊酸；以及3.乙酰水楊酸。
[0025]圖11是HILIC/WAX/SCX混合三峰介質(zhì)(33)和HILIC/WAX/WCX混合三峰介質(zhì)(34)的示意圖。
發(fā)明詳細(xì)說明
-T-N /.、.1.1IJ H
[0026]本領(lǐng)域的液相柱色譜法是用于從樣品中分離物質(zhì)并且用于分析樣品的成分的一種古老和熟知的方法。取決于樣品和有待從其中分離的材料，各種各樣的液相柱色譜法模式中的一種或多種用于實(shí)現(xiàn)該分離。此類色譜模式包括尺寸排除(SEC)、離子交換、反相、正相、親水相互作用、疏水相互作用、親和、供體-受體、離子對(duì)以及手性分離色譜法。
[0027]不同分離方式的組合也可以在分離和分析中使用。混合模式色譜法是其中一種色譜介質(zhì)通過多于一種的相互作用模式與溶質(zhì)(分析物)相互作用的色譜法類型?；旌夏Ｊ缴V法介質(zhì)可以將IEX和RP特性或IEX和HILIC特性進(jìn)行組合?；旌夏Ｊ缴V法可以提供高分辨率、可調(diào)節(jié)的選擇性、高樣品負(fù)載、不需要離子配對(duì)試劑(MS-相容性)、以及在某些環(huán)境中替換兩個(gè)常規(guī)的相對(duì)應(yīng)的柱的能力。
[0028]當(dāng)與其中生物聚合物(像蛋白質(zhì)或核酸)與小分子(如藥物、代謝物、污染物、外毒素和內(nèi)毒素，等等)一起存在的大量生物樣品一起使用時(shí)，許多雙峰分離失效。由于樣品預(yù)處理，像溶劑萃取、固相萃取或超濾是費(fèi)時(shí)和冗長(zhǎng)的，已經(jīng)開發(fā)了新的色譜介質(zhì)，這些色譜介質(zhì)可以防止用于在反相或離子交換色譜法中分離的基團(tuán)之間的接觸。大多使用具有防止大分子滲透到珠粒中的非常小的孔的介質(zhì)(全排除)。由粘在珠粒表面上的蛋白質(zhì)造成的柱的阻塞通過提供具有親水基團(tuán)的表面而被抑制。近來綜述了該方法(Pinkerton T.C.，色譜(J.Chromatogr.),544, (1991) 13 ；Haginaka J.，分析化學(xué)發(fā)展趨勢(shì)(Trends Anal Chem.),10，(1991) 17)它可以被稱為假多峰，作為這些模式之一，實(shí)際上不是一種色譜法，而是一種簡(jiǎn)單的類過濾分離(超過一種尺寸限制的所有分子的全排除)。
[0029]本發(fā)明提供了具有多種獨(dú)特色譜特性的色譜介質(zhì)，該色譜介質(zhì)作為固定相對(duì)于聚糖的色譜分離和分析、以及固相萃取(SPE)是有用的。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的色譜介質(zhì)包括兩個(gè)或更多個(gè)具有陰離子交換能力、陽離子交換能力、反相能力或親水相互作用能力的不同色譜部分。在不同的實(shí)施例中，這些兩個(gè)或更多個(gè)不同的色譜部分被結(jié)合到固體載體的同一單元上(例如，至同一顆粒上)。在其他實(shí)施例中，該介質(zhì)通過將具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合到固體載體的同一單元上的色譜部分的兩種或更多種材料進(jìn)行組合而形成。
[0030]在示例性實(shí)施例中，本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的介質(zhì)來分離和分析聚糖混合物的方法、在這些方法中使用的裝置以及結(jié)合有此類裝置的系統(tǒng)。
[0031]在更加詳細(xì)地描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明不限制于在此描述的具體實(shí)施例，因?yàn)榇祟悓?shí)施例可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解的是，在此使用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施例的目的，并且該術(shù)語并非旨在是限制性的。本發(fā)明的范圍將只受所附權(quán)利要求書限制。除非另外定義，在此使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。當(dāng)提供了數(shù)值的范圍時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解的是，在該范圍的上限和下限之間的每個(gè)居中值(至該下限的單位的十分之一，除非上下文清楚地另外規(guī)定)，以及在所陳述范圍內(nèi)的任何其他陳述的或居中的值被涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。這些更小范圍的上限和下限可以獨(dú)立地被包括在這些更小范圍內(nèi)并且還被涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，經(jīng)受在所陳述范圍中的任何具體地排除的極限。當(dāng)所述的范圍包括這些極限中的一個(gè)或兩個(gè)時(shí)，排除這些被包括的極限中的任一個(gè)或兩個(gè)的范圍也被包括在本發(fā)明中。某些范圍用冠以術(shù)語“大約”的數(shù)值在此提出。術(shù)語“大約”在此用于為其后的精確數(shù)字、以及接近或近似該術(shù)語先于的數(shù)字提供字面支持。在確定一個(gè)數(shù)字是否接近或近似一個(gè)具體敘述的數(shù)字時(shí)，該接近或近似的未敘述的數(shù)字可以是在它被提出的上下文中提供該具體敘述的數(shù)字的實(shí)質(zhì)等價(jià)物的一個(gè)數(shù)字。本說明書引用的所有公開、專利、和專利申請(qǐng)通過引用而結(jié)合于此至與如同對(duì)每個(gè)單獨(dú)的公開、專利、或?qū)＠暾?qǐng)具體地和單獨(dú)地表明通過引用被結(jié)合相同的程度。此外，每個(gè)引用的公開物、專利、或?qū)＠暾?qǐng)通過引用結(jié)合在此，以便披露和描述與所引用公開相關(guān)的主題。任何公開物的引用是為了在申請(qǐng)日之前的其披露并且應(yīng)該被解釋為承認(rèn)在此描述的本發(fā)明沒有資格早于借助在先發(fā)明的此類公開。另外，提供的
【公開日】可能不同于實(shí)際的
【公開日】，這可能需要獨(dú)立地進(jìn)行確認(rèn)。
[0032]應(yīng)注意的是，這些權(quán)利要求可以被起草以排除任何任選的元素。這樣，這種陳述旨在作為使用與權(quán)利要求元素的敘述有關(guān)的此類排他性術(shù)語如“僅(solely)”、“只(only)”等等，或使用“否定性”限制的前提基礎(chǔ)。如當(dāng)閱讀本披露時(shí)，將對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員清楚的是，在此描述和說明的這些單獨(dú)實(shí)施例各自具有分立的組成部分和特征，它們可容易地與其他幾個(gè)實(shí)施例中任何一個(gè)的特征分離或與其結(jié)合，而不脫離本發(fā)明的范圍或精神。任何所敘述的方法可以按所敘述事件的順序或按邏輯上可能的任何順序來進(jìn)行。盡管與在此描述的那些類似或等價(jià)的任何方法和材料也可以用于本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中，但現(xiàn)在描述代表性的說明性方法和材料。
[0033]在描述本發(fā)明中，以下術(shù)語將被使用，并且是如以下所表明的而定義的。
I1.縮寫
[0034]弱陰離子交換(“WAX”)；強(qiáng)陰離子交換(“SAX”)；弱陽離子交換(“WCX”)；強(qiáng)陽離子交換(“ SCX”);親水相互作用液相色譜法(“HILIC”);2_氨基苯甲酰胺(2AB) ;2_氨基苯甲酸(2AA);去離子的(D.1.)。
II1.定義
[0035]在取代基是通過它們從左向右所書寫的常規(guī)化學(xué)式來說明的情況下，它們?nèi)芜x地涵蓋將因從右向左書寫該結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生的化學(xué)上相同的取代基，例如，-CH2O-旨在也敘述 _0CH2_。
[0036]除非另外說明，否則術(shù)語“烷基”獨(dú)自或作為另一個(gè)取代基的一部分意指一個(gè)直鏈或支鏈、或環(huán)狀烴基、或其組合，該烷基可以是完全飽和的、單或多不飽和的，并且可以包括具有指定碳原子數(shù)(即，C1-Cltl意指一個(gè)至十個(gè)碳)的二價(jià)和多價(jià)基團(tuán)。飽和烴基的實(shí)例包括(但不限于)如下基團(tuán):如甲基、乙基、正丙基(例如，-CH2-CH2-CH3、-CH2-CH2-CH2-)、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和異構(gòu)體。不飽和烷基是具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵或三鍵的基團(tuán)。不飽和烷基的實(shí)例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-( 丁二烯基)、
2,4-戍二烯基、3-(1，4-戍二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3- 丁炔基以及更聞級(jí)的同系物和異構(gòu)體。除非另外指出，否則術(shù)語“烷基”還意在包括以下更詳細(xì)定義的烷基的衍生物，如“雜烷基”。限于烴基的烷基被稱為“同源烷基(homoalkyl)”。在烷基是一個(gè)二價(jià)基團(tuán)的情況下，術(shù)語“烷基”還可以意指“亞烷基”或“烷二基”以及次烷基(alkylidene)。
[0037]術(shù)語“亞烷基”或“烷二基”獨(dú)自或作為另一個(gè)取代基的一部分意指衍生自烷基的二價(jià)基團(tuán)，如由(但不限于)-CH2CH2CH2-(亞丙基或丙烷-1，3- 二基)所舉例說明，并且進(jìn)一步包括以下描述為“雜亞烷基”的那些基團(tuán)。典型地，一個(gè)烷基(或亞烷基)將具有從I個(gè)到約30個(gè)碳原子、優(yōu)選地是從I個(gè)到約25個(gè)碳原子、更優(yōu)選地是從I個(gè)到約20個(gè)碳原子、甚至更優(yōu)選地是從I個(gè)到約15個(gè)碳原子并且最優(yōu)選地是從I個(gè)到約10個(gè)碳原子。一個(gè)“低級(jí)烷基”、“低級(jí)亞烷基”或“低級(jí)烷二基”是一個(gè)較短鏈的烷基、亞烷基或烷二基，總體上具有約10個(gè)或更少個(gè)碳原子、約8個(gè)或更少個(gè)碳原子、約6個(gè)或更少個(gè)碳原子、或約4個(gè)或更少個(gè)碳原子。
[0038]術(shù)語“烷氧基”、“烷氨基”以及“烷硫基”(或硫代烷氧基)是在它們的常規(guī)意義上使用的，并且各自是指經(jīng)由一個(gè)氧原子、一個(gè)氨基或一個(gè)硫原子連接到分子的其余部分上的那些燒基。
[0039]除非另外說明，否則術(shù)語“雜烷基”獨(dú)自或與另一個(gè)術(shù)語組合意指一個(gè)穩(wěn)定的直鏈或支鏈、或環(huán)狀烴基、或其組合，該雜烷基由規(guī)定數(shù)目的碳原子和至少一個(gè)選自下組的雜原子組成，該組由0、N、S1、S以及B組成，并且其中這些氮和硫原子可以任選地被氧化，并且該氮雜原子可以任選地被季銨化。該一個(gè)或多個(gè)雜原子0、N、B、S以及Si可以被放置在雜烷基的任何內(nèi)部位置上，或在該烷基與分子的其余部分相連接的位置上。實(shí)例包括，但不限于:-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N (CH3) -CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S (O) -CH3、-CH2-CH2-S (O) 2-CH3、-CH=CH-O-CH3' -Si (CH3) 3、-CH2-CH=N-OCH3' 以及-CH=CH-N (CH3) -CH30 最高達(dá)兩個(gè)雜原子可以是連續(xù)的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si (CH3) 3。類似地，術(shù)語“雜亞烷基”獨(dú)自或作為另一個(gè)取代基的一部分意指一個(gè)衍生自雜烷基的二價(jià)基團(tuán)，如由(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-所舉例說明。對(duì)于雜亞烷基，雜原子還可以占據(jù)鏈末端的任何一端或兩端(例如，亞烷基氧基、亞烷基二氧基、亞烷基氣基、亞烷基二氣基等)。更進(jìn)一步，對(duì)于亞烷基和雜亞烷基連接基團(tuán)，連接基團(tuán)的取向并非由書與該連接基團(tuán)的化學(xué)式的方向所暗示。舉例來講，化學(xué)式-C02R’代表-C(0)0R’和-OC(O)R’。
[0040]除非另外說明，否則術(shù)語“環(huán)烷基”和“雜環(huán)烷基”獨(dú)自或與其他術(shù)語組合各自表示“烷基”和“雜烷基”的環(huán)狀型式。另外，對(duì)于雜環(huán)烷基，一個(gè)雜原子可以占據(jù)該雜環(huán)與分子的其余部分相連接的位置。環(huán)烷基的實(shí)例包括(但不限于)環(huán)戊基、環(huán)己基、1-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基等。雜環(huán)烷基的實(shí)例包括(但不限于)1_(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另外說明，否則術(shù)語“鹵基”或“鹵素”獨(dú)自或作為另一個(gè)取代基的一部分意指一個(gè)氟、氯、溴或碘原子。另外，如“鹵烷基”的術(shù)語意在包括單鹵烷基和多鹵烷基。舉例來說，術(shù)語“鹵(C1-C4)烷基”意在包括(但不限于)三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
[0041]除非另外說明，否則術(shù)語“芳基”意指一個(gè)多不飽和、芳香族的取代基，該取代基可以是單個(gè)環(huán)或多個(gè)環(huán)(優(yōu)選地是從I個(gè)到3個(gè)環(huán))，這些環(huán)稠合在一起或共價(jià)連接。術(shù)語“雜芳基”是指包含從一個(gè)到四個(gè)選自N、O、S、Si以及B的雜原子的芳基(或環(huán))，其中這些氮和硫原子是任選地被氧化，并且該一個(gè)或多個(gè)氮原子是任選地被季銨化。一個(gè)雜芳基可以通過一個(gè)雜原子連接到分子的其余部分上。芳基和雜芳基的非限制性實(shí)例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基以及6-喹啉基。上述芳基和雜芳基環(huán)體系中的每一個(gè)的取代基是選自以下所描述的可接受取代基的組。
[0042]為了簡(jiǎn)便起見，術(shù)語“芳基”在與其他術(shù)語(例如，芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基)組合使用時(shí)包括如上文所定義的芳基和雜芳基環(huán)兩者。因此，術(shù)語“芳烷基”意在包括其中一個(gè)芳基被附接到一個(gè)烷基上的那些基團(tuán)(例如，苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等)，該烷基包括其中一個(gè)碳原子(例如一個(gè)亞甲基)已經(jīng)被例如一個(gè)氧原子替換的那些烷基(例如，苯氧基甲基、吡啶氧基甲基、3_(1_萘氧基)丙基等)。
[0043]以上術(shù)語(例如，“烷基”、“雜烷基”、“芳基”以及“雜芳基”)中的每一個(gè)均意在包括所指明基團(tuán)的被取代和未被取代的形式兩者。以下提供了每種類型的基團(tuán)的優(yōu)選取代基。
[0044]這些烷基和雜烷基(包括常被稱為亞烷基、烯基、雜亞烷基、雜烯基、炔基、環(huán)燒基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基以及雜環(huán)烯基的那些基團(tuán))的取代基一般被稱為“烷基取代基”，并且它們可以是選自(但不限于)以下各項(xiàng)的多種基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè):被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的雜芳基、被取代或未被取代的雜環(huán)烷基、-OR’、=0、=NR'、=N-OR'、-NR，R"、-SR，、-鹵素、-SiR，R"R"，、-OC (0) R，、-C (0) R，、-CO2R'、-CONR' R"、-OC (0)NR’ R"、-NR"C (0) R’、-NR’ -C (0) NR"R"’、_NR"C (0) 2R’、-NR-C (NR，R"R’ ")=NR""、-NR-C (NR，R")=NR’ "、-S (0) R’、-S (0) 2R’、-OS (0) 2R’、-S (0) 2NR’ R"、-NRSO2R'、-CN 以及-NO2,數(shù)目范圍是從零到(2m’+1)，其中m’是這類基團(tuán)中的碳原子的總數(shù)。R’、R〃、R〃’以及R〃〃各自優(yōu)選地獨(dú)立地是指氫、被取代或未被取代的雜烷基、被取代或未被取代的芳基(例如，被1-3個(gè)鹵素取代的芳基)、被取代或未被取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基、或芳烷基。當(dāng)一種本發(fā)明的化合物包括一個(gè)以上R基團(tuán)時(shí)，例如，每一個(gè)R基團(tuán)獨(dú)立地被選擇，當(dāng)存在R’、R〃、R’〃以及R〃〃基團(tuán)中的一個(gè)以上時(shí)，這些基團(tuán)中的每一個(gè)也同樣如此。當(dāng)R’和R〃被連接到同一個(gè)氮原子上時(shí)，它們可以與該氮原子組合形成5-、6_或7-元環(huán)。舉例來說，-NR’ R"意在包括(但不限于)1_吡咯烷基和4-嗎啉基。從以上關(guān)于取代基的討論中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解到，術(shù)語“烷基”意在包括包含與除了氫基以外的基團(tuán)結(jié)合的碳原子的基團(tuán)，如鹵烷基(例如，-CF3 和-CH2CF3)和?；?例如，-C(O) CH3> -C(O) CF3> -C(O) CH2OCH3 等)。
[0045]類似于對(duì)于烷基所描述的取代基，芳基和雜芳基的取代基一般被稱為“芳基取代基”。這些取代基選自，例如:被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的雜芳基、被取代或未被取代的雜環(huán)烷基、-0R’、=0、=NR'、=N-OR'、-NR’ R"、-SR’、-鹵素、-SiR’ R"R"’、-OC (0) R’、-C (0) R’、-CO2R'、-CONR' R"、-OC (0)NR’ R"、-NR"C (0) R’、-NR’ -C (0) NR"R"’、_NR"C (0) 2R’、-NR-C (NR，R"R’ ")=NR""、-NR-C (NR，R")=NR，"、-S (0) R'、-S(O)2R,、-S(O)2NR, R"、-NRSO2R'、-CN 和-NO2、-R，、-N3、-CH (Ph)2、氟代( C1-C4)烷氧基以及氟代(C1-C4)烷基，數(shù)目范圍是從零到芳香族環(huán)系統(tǒng)上的開放價(jià)態(tài)的總數(shù)；并且其中R’、R〃、R〃’以及R〃〃優(yōu)選地獨(dú)立地選自氫、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的雜烷基、被取代或未被取代的芳基以及被取代或未被取代的雜芳基。當(dāng)一種本發(fā)明的化合物包括一個(gè)以上R基團(tuán)時(shí)，例如，每一個(gè)R基團(tuán)獨(dú)立地被選擇，當(dāng)存在R’、R〃、R’〃以及R〃〃基團(tuán)中的一個(gè)以上時(shí)，這些基團(tuán)中的每一個(gè)也同樣如此。
[0046]芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的取代基中的兩個(gè)可以任選地被具有化學(xué)式-T-C (O) - (CRR’) q-U-的一個(gè)取代基替換，其中T和U獨(dú)立地是-NR-、-0-、-CRR’ -或一個(gè)單鍵，并且q是從O到3的一個(gè)整數(shù)。可替代地，芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的取代基中的兩個(gè)可以任選地被具有化學(xué)式-A-(CH2)^B-的一個(gè)取代基替換，其中A和B獨(dú)立地是-CRR’ -、-0-、-NR-、-S-、-S(0)-、-S(0)2-、-S(0)2NR’ -或一個(gè)單鍵，并且 r 是從 I 到 4 的一個(gè)整數(shù)。如此所形成的新環(huán)的這些單鍵中的一個(gè)可以任選地被一個(gè)雙鍵替換?？商娲?，芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的取代基中的兩個(gè)可以任選地被具有化學(xué)式(CRR’)S-X-(CR〃R〃’)d-的一個(gè)取代基替換，其中s和d獨(dú)立地是從O到3的整數(shù)，并且X是-0-、-NR’ -、-S-、-S (O)-、-S (O)2-或-S(O) 2NR’-。取代基R、R’、R〃以及R〃’優(yōu)選地獨(dú)立地選自氫或被取代或未被取代的(C1-C6)烷基。
[0047]如在此所使用，術(shù)語“稠環(huán)體系”意指至少兩個(gè)環(huán)，其中每個(gè)環(huán)具有至少2個(gè)與另一個(gè)環(huán)共有的原子。“稠環(huán)體系”可以包括芳香族以及非芳香族環(huán)?！俺憝h(huán)體系”的實(shí)例是萘、吲哚、喹啉、色烯等。
[0048]如在此所使用，術(shù)語“雜原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)以及硼(B)。
[0049]符號(hào)“R”是代表選自以下基團(tuán)的取代基的通用縮寫:取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、以及取代或未取代的雜
環(huán)燒基。
[0050]術(shù)語“基質(zhì)”與“載體”或“固體載體”可互換使用。
[0051]當(dāng)本發(fā)明的化合物含有相對(duì)堿性或酸性的官能團(tuán)時(shí)，此類化合物的鹽被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。鹽可以通過使此類化合物的中性形式與足夠量的所希望的酸或堿(純凈的亦或在一種合適的惰性溶劑中)接觸而獲得。本發(fā)明的相對(duì)酸性化合物的鹽的實(shí)例包括鈉、鉀、鈣、銨、有機(jī)氨基、或鎂的鹽，或類似的鹽。當(dāng)本發(fā)明的化合物包含相對(duì)堿性的官能團(tuán)時(shí)，酸加成鹽可以通過使此類化合物的中性形式與足夠量的所希望的酸(純凈的亦或在一種合適的惰性溶劑中)接觸而獲得。酸加成鹽的實(shí)例包括衍生自有機(jī)酸像鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、單氫碳酸、磷酸、單氫磷酸、二氫磷酸、硫酸、單氫硫酸、氫碘酸、或亞磷酸，等等的鹽，以及衍生自有機(jī)酸像乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富馬酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對(duì)甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸、甲磺酸，等等的鹽。還包括氨基酸的鹽如精氨酸鹽等等，以及有機(jī)酸像葡糖醛酸或半乳糖醛酸的鹽等等(參加，例如，Berge 等人,藥物科學(xué)雜志(Journal of Pharmaceutical Science) 1977，66:1-19)。本發(fā)明的某些具體化合物包含堿性和酸性官能團(tuán)兩者，這些官能團(tuán)允許這些化合物被轉(zhuǎn)化為堿的亦或酸的加成鹽。
[0052]這些化合物的中性形式優(yōu)選通過使該鹽與一種堿或酸接觸并且以常規(guī)方式分離該母體化合物而進(jìn)行再生。該化合物的母體形式在某些物理性質(zhì)(如在極性溶劑中的溶解度)上不同于這些不同的鹽形式，但對(duì)于本發(fā)明的目的，這些鹽在其他方面等價(jià)于該化合物的母體形式。
[0053]術(shù)語“顆粒的平均直徑”、“粒徑”、“平均粒徑”、“中值粒徑”或其任何語法變體是指對(duì)于一種本發(fā)明的基質(zhì)(固體載體)的粒徑規(guī)格。粒徑典型地由制造商提供。粒徑可以是指任何類型的顆粒，包括球形和不規(guī)則形狀的顆粒。
[0054]“流動(dòng)相”和“洗脫液”可互換地使用，是指使有待從一個(gè)色譜柱或其他分離裝置中分離的一種混合物的溶解的組分(例如，一種聚糖)移動(dòng)的一種液體。該流動(dòng)相常常含有多于一種化合物并且是一種不同溶劑的混合物或一種鹽、酸、堿，等等的溶液。
[0055]“溶劑”是一種液體有機(jī)化合物(例如，一種單一化合物)。一種示例性溶劑是至少部分地可與水混溶的。在不同的實(shí)施例中，一種溶劑是完全可與水混溶的。在不同的實(shí)施例中，“溶劑”是指乙腈。
[0056]“流動(dòng)相強(qiáng)度”是指就例如極性、在反相色譜法中的有機(jī)改性劑濃度、在離子交換色譜法或親水相互作用色譜法中的緩沖劑離子強(qiáng)度而言的流動(dòng)相的強(qiáng)度。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，該術(shù)語是指該流動(dòng)相的離子強(qiáng)度。
[0057]在本發(fā)明中使用的一種示例性流動(dòng)相包括與從約50%至約85%的溶劑(例如，乙腈)組合的一種從約2mM至約30mM的電解質(zhì)。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，該洗脫液用于在一個(gè)HILIC/WAX方案中分離聚糖。在本發(fā)明中使用的一種另外的示例性流動(dòng)相包括與從約0%至約50%的溶劑(例如，乙腈)組合的從約2mM至約30mM的一種電解質(zhì)。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，該洗脫液用于在一個(gè)RP/WAX方案中分離聚糖。
[0058]一種“洗脫液”是結(jié)合有本發(fā)明色譜介質(zhì)的分離裝置的洗脫液。
[0059]如在此使用的，術(shù)語“電解質(zhì)”是指一種流動(dòng)相(例如一種緩沖劑)的一種離子組分。
[0060]“梯度”是隨著時(shí)間在流動(dòng)相的構(gòu)成上的改變。
[0061]“色譜介質(zhì)”是指在固體載體上具有結(jié)合位點(diǎn)的一種物質(zhì)組合物。
[0062]“結(jié)合位點(diǎn)”、“色譜部分”和“色譜結(jié)合位點(diǎn)”是可互換地使用的，以指在能夠結(jié)合到一種聚糖分析物的本發(fā)明色譜介質(zhì)上的一個(gè)部分。
[0063]“聚糖”是指單聚的、二聚的或更高“聚的”糖類、低聚糖和多糖。術(shù)語“聚糖”還指包括一種聚糖組分，例如，糖脂類、糖聚合物類和糖肽類的種類。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，該聚糖混合物是一種糖類混合物。一種示例性聚糖包括一種或多種附接唾液酸的部分。
[0064]“糖類”是一種聚糖的種類，在其結(jié)構(gòu)內(nèi)不包括脂質(zhì)或多肽部分。
[0065]在本發(fā)明中使用涉及離子強(qiáng)度(例如，一種洗脫劑)的大小的術(shù)語。如在此使用的，術(shù)語“低離子強(qiáng)度”是指小于或等于約30mM的溶液電解質(zhì)組分的濃度。術(shù)語“高離子強(qiáng)度”是指大于或等于約IOOmM的溶液電解質(zhì)組分的濃度。相對(duì)應(yīng)地，術(shù)語“中等離子強(qiáng)度”是指大于約30mM并且小于約IOOmM的溶液電解質(zhì)組分的濃度。
[0066]在本發(fā)明中使用涉及一種水性溶液(例如，一種洗脫劑)中的溶劑濃度的術(shù)語。如在此使用的，術(shù)語“低溶劑含量”是指小于或等于約50%的水性溶液中的溶劑濃度。如在此使用的，術(shù)語“高溶劑含量”是指大于約50%的水性溶液中的溶劑濃度。
IV.色譜介質(zhì)
[0067]在一個(gè)示例性實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種多峰色譜介質(zhì)。一種示例性介質(zhì)具有帶電和不帶電兩種的結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，該介質(zhì)包括由不同模式(例如，離子交換、和RP或HILIC)進(jìn)行工作的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。
[0068]本發(fā)明的一種示例性多元色譜介質(zhì)包括與一個(gè)或多個(gè)反相和/或親水相互作用色譜結(jié)合位點(diǎn)相組合的一個(gè)或多個(gè)強(qiáng)陰離子交換、弱陰離子交換、強(qiáng)陽離子交換和/或弱陽離子交換的結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，這些位點(diǎn)與一種聚糖混合物中的一種或多種聚糖相互作用，以一種允許分離該混合物中的聚糖并且分析該聚糖混合物的方式。
[0069]在不同的實(shí)施例中，該離子交換部分是一種胺。
[0070]在一個(gè)示例性實(shí)施例中，該不帶電的第二結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)親水相互作用位點(diǎn)并且是一種脲，例如，一個(gè)不帶電的脲部分。
[0071]在一個(gè)示例性實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種色譜介質(zhì)，該色譜介質(zhì)具有一個(gè)陰離子交換位點(diǎn)(例如，一個(gè)WAX結(jié)合位點(diǎn))和一個(gè)HILIC結(jié)合位點(diǎn)以及約3 μ m的粒徑。在另一個(gè)示例性實(shí)施例中，本發(fā)明的色譜介質(zhì)具有一個(gè)陰離子交換位點(diǎn)和一個(gè)RP結(jié)合位點(diǎn)，并且該粒徑是約1.9 μ m。
[0072]在不同的實(shí)施例中，該介質(zhì)包括第一和第二離子交換位點(diǎn)兩者。示例性的第一和第二結(jié)合位點(diǎn)是基于結(jié)構(gòu)上彼此不同的部分的不同位點(diǎn)。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，該第一離子交換結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)陰離子結(jié)合位點(diǎn)并且所述第二離子交換結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)陽離子交換結(jié)合位點(diǎn)。
[0073]該色譜介質(zhì)還包括一個(gè)或多個(gè)不帶電的結(jié)合位點(diǎn)，并且類似于這些離子交換位點(diǎn)，當(dāng)存在兩個(gè)或更多個(gè)不帶電的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，它們是基于具有彼此不同的結(jié)構(gòu)的部分。
[0074]在一個(gè)示例性實(shí)施例中，本發(fā)明的介質(zhì)包括一個(gè)陽離子結(jié)合位點(diǎn)、一個(gè)陰離子結(jié)合位點(diǎn)、以及一個(gè)反相結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)親水相互作用結(jié)合位點(diǎn)中的一個(gè)或兩個(gè)。[0075]這些結(jié)合位點(diǎn)直接地或通過一個(gè)連接體被結(jié)合到該基質(zhì)上。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，該離子交換色譜部分通過一個(gè)第一連接體部分被結(jié)合到該第一基質(zhì)上。在不同的實(shí)施例中，該不帶電的色譜部分通過一個(gè)第二連接體部分被結(jié)合到該第二基質(zhì)上。
[0076]在不同的實(shí)施例中，該第一連接體部分和該第二連接體部分是單獨(dú)的化學(xué)種類，以使得該離子交換色譜部分和該不帶電的色譜部分可以獨(dú)立地分別被連接到該第一基質(zhì)和該第二基質(zhì)上。該第一基質(zhì)可以是與該第二基質(zhì)相同的，或可替代地該第一個(gè)和該第二基質(zhì)可以是不同的。獨(dú)立連接的方式意指該離子交換色譜部分和該不帶電的色譜部分不被附接到一個(gè)共同的共享的連接體基團(tuán)上。此外，該獨(dú)立連接的離子交換色譜部分和不帶電的色譜部分不是直接地被連接至彼此的。
[0077]在本發(fā)明的組合物中使用的連接體可以具有任何有用的結(jié)構(gòu)。例如，在一個(gè)示例性實(shí)施例中，該第一連接體部分和/或該第二連接體部分中的任一個(gè)或兩個(gè)是被取代的或未被取代的烷基或雜烷基部分。該連接體具有任何有用的長(zhǎng)度。在本發(fā)明的化合物中使用的示例性連接體包括在長(zhǎng)度上從約3個(gè)碳至約40個(gè)碳，例如8個(gè)碳至約30個(gè)碳的那些。當(dāng)該連接體是被取代的或未被取代的雜烷基時(shí)，該碳鏈被一個(gè)或多個(gè)雜原子中斷，然而，該連接體的總長(zhǎng)在長(zhǎng)度上是從約3個(gè)碳至約40個(gè)碳。
[0078]在一個(gè)示例性實(shí)施例中，該離子交換結(jié)合位點(diǎn)和該第一連接體具有以下化學(xué)式:
【權(quán)利要求】
1.一種將一種聚糖混合物的一種第一聚糖組分與一種第二聚糖組分分離的多峰色譜方法，所述方法包括: (a)使所述聚糖混合物在有效實(shí)現(xiàn)所述分離的條件下與一種多峰色譜介質(zhì)以及一種水性洗脫液接觸，該多峰色譜介質(zhì)包括一個(gè)結(jié)合到一種第一基質(zhì)上的離子交換色譜部分和一個(gè)結(jié)合到一種第二基質(zhì)上的不帶電的色譜部分，所述不帶電的色譜部分選自一個(gè)反相色譜部分、一個(gè)親水相互作用色譜部分以及它們的組合，該水性洗脫液包括一種電解質(zhì)和一種有機(jī)溶劑，從而分離所述第一聚糖組分和所述第二聚糖組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述離子交換色譜部分是一個(gè)陰離子交換部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述離子交換色譜部分是一種胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第二色譜部分是一個(gè)親水相互作用色譜部分并且是一種脲。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述離子交換色譜部分通過一個(gè)第一連接體部分被結(jié)合到所述第一基質(zhì)上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述不帶電的色譜部分通過一個(gè)第二連接體部分被結(jié)合到所述第二基質(zhì)上。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，選自所述第一連接體部分、所述第二連接體部分以及它們的組合的一個(gè)成員是一個(gè)被取代的或未被取代的烷基部分。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述被取代的或未被取代的烷基連接體在長(zhǎng)度上是從約3個(gè)碳至約40個(gè)碳。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述第一連接體在長(zhǎng)度上是從約3個(gè)碳至約30個(gè)碳。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述第二連接體在長(zhǎng)度上是從約8個(gè)碳至約40個(gè)碳。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述第一基質(zhì)和所述第二基質(zhì)是相同的基質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述第一基質(zhì)和所述第二基質(zhì)是不同的基質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述離子交換色譜部分與所述第一連接體一起具有以下化學(xué)式:c.R2 (^(CH2)r1-N、 其中 R2和R3獨(dú)立地選自H、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的雜烷基；并且η是一個(gè)從3至30的整數(shù)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述離子交換色譜部分與所述第一連接體一起具有以下化學(xué)式:
L I zR2
g*/d I \ _(uj ^ ? U~~Oi Ι^.>οΙρι ιΝ、ζI測(cè)、R3
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述不帶電的色譜部分與所述第二連接體一起具有一個(gè)化學(xué)式，該化學(xué)式是一個(gè)選自以下化學(xué)式的成員:
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述不帶電的色譜部分與所述第二連接體一起具有一個(gè)化學(xué)式，該化學(xué)式是一個(gè)選自以下化學(xué)式的成員:
17.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，選自所述第一基質(zhì)、所述第二基質(zhì)以及它們的組合的一個(gè)成員是一種二氧化硅基質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，選自所述第一基質(zhì)、所述第二基質(zhì)以及它們的組合的一個(gè)成員是一種顆粒。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，選自所述第一基質(zhì)、所述第二基質(zhì)以及它們的組合的一個(gè)成員是一種二氧化硅顆粒，該二氧化硅顆粒具有從約I μ m至約20 μ m的直徑。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述電解質(zhì)以從約ImM至約50mM的量存在。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述有機(jī)溶劑以最高達(dá)所述洗脫液的約95%(v/v)的量存在于所述洗脫液中。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括(b):在步驟(a)之前，通過處理至少一種具有糖苷酶的糖蛋白的一種溶液來制備一種第一前體聚糖混合物，從而形成所述第一前體聚糖混合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，在所述糖苷酶中是一個(gè)選自N-糖酰胺酶F、N-糖酰胺酶A以及它們的組合的成員。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，進(jìn)一步包括(c):在步驟(b)之后，通過一種方法制備一種第二前體聚糖混合物，該第二前體聚糖混合物包括所述第一聚糖組分和所述第二聚糖組分，該制備方法包括: (i)將在所述第一前體聚糖混合物中的蛋白質(zhì)沉淀，形成一種包含沉淀的蛋白質(zhì)和上清液的混合物；(?)通過將所述步驟(i)的混合物離心來將所述沉淀的蛋白質(zhì)造粒，形成一種兩相混合物； (iii)將所述上清液從所述兩相混合物中去除，形成一種分離的上清液；并且 (iv)將所述分離的上清液進(jìn)行透析，從而形成所述第二前體聚糖混合物；或者 (i)使所述第一前體聚糖混合物經(jīng)受反相高效液相色譜法，從而形成所述第二前體聚糖混合物。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，進(jìn)一步包括(d):在步驟(c)之后，通過一種方法制備一種標(biāo)記的聚糖混合物，該標(biāo)記的聚糖混合物包括一種標(biāo)記的所述第一聚糖組分和標(biāo)記的所述第二聚糖組分，該制備方法包括使所述第二前體聚糖混合物經(jīng)受一種包含一種反應(yīng)性的、可檢測(cè)的標(biāo)記的混合物，在有效地用所述可檢測(cè)的標(biāo)記來標(biāo)記所述第二前體聚糖混合物中的一種聚糖的條件下，從而制備所述標(biāo)記的聚糖混合物。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述可檢測(cè)的標(biāo)記是一種熒光標(biāo)記。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述條件是對(duì)于通過具有選自所述第一聚糖組分、所述第二聚糖組分和它們的組合的一個(gè)成員的一個(gè)還原部分來進(jìn)行的所述可檢測(cè)的標(biāo)記的還原氨化而言是有效的，其中所述可檢測(cè)的標(biāo)記包括一個(gè)反應(yīng)性胺部分。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述熒光標(biāo)記是一種芳香胺。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述芳香胺是選自2-氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酰胺、2-氨基吡唳、8-氨基萘-1，3, 6-二磺酸、2-氨基B丫唳酮、以及9-氨基花-1, 3, 6-二磺酸的一個(gè)成員。
30.如權(quán)利要求24所述的方法，進(jìn)一步包括⑷:在步驟(c)之后，用選自唾液酸酶A、唾液酸酶B以及它們的組合的一個(gè)成員來處理所述第二前體聚糖混合物，從而制備所述聚糖混合物。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，進(jìn)一步包括(e):在步驟(a)之后，使所述第一聚糖組分和所述第二聚糖組分經(jīng)受通過質(zhì)譜法的分析。
32.如權(quán)利要求25所述的方法，進(jìn)一步包括，在步驟(a)之后，使所述標(biāo)記的第一聚糖組分和所述標(biāo)記的第二聚糖組分經(jīng)受通過質(zhì)譜法的分析。
33.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述分離導(dǎo)致一個(gè)色譜圖，其中所述第一聚糖組分和所述第二聚糖組分具有與它們的電荷成比例的保留時(shí)間，使得具有與所述第一聚糖組分或所述第二聚糖組分相同的電荷的一種第三聚糖將具有與具有相同電荷的聚糖組分成組的保留時(shí)間。
34.一種改進(jìn)在一種多峰色譜介質(zhì)上的一種未唾液酸化的第一聚糖和一種未唾液酸化的第二聚糖的色譜分離的方法，所述介質(zhì)包括一個(gè)結(jié)合到一種第一基質(zhì)上的離子交換色譜部分和一個(gè)結(jié)合到一種第二基質(zhì)上的不帶電的色譜部分，所述不帶電的色譜部分選自一個(gè)反相色譜部分、一個(gè)親水相互作用色譜部分以及它們的組合，所述方法包括: (a)用一種包括一個(gè)帶電部分的可檢測(cè)標(biāo)記將所述第一未唾液酸化的聚糖和所述第二未唾液酸化的聚糖進(jìn)行衍生，形成一種標(biāo)記的第一聚糖和一種標(biāo)記的第二聚糖；并且 (b)使所述多峰色譜介質(zhì)在有效地分離所述第一和第二標(biāo)記的聚糖的條件下與所述標(biāo)記的第一聚糖以及所述標(biāo)記的第二聚糖接觸，其中所述分離相對(duì)于在所述多峰色譜介質(zhì)上的所述第一未唾液酸化的聚糖和所述第二未唾液酸化的聚糖的一種分離是改進(jìn)的。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述分離是通過在有效地實(shí)現(xiàn)所述分離的條件下，使一種洗脫液流過所述多峰色譜介質(zhì)，使得所述第一標(biāo)記的聚糖和所述第二標(biāo)記的聚糖與所述介質(zhì)接觸而實(shí)現(xiàn)的，其中所述洗脫液包含不大于30%的電解質(zhì)，從而形成包含與所述第二聚糖組分分離的所述第一聚糖組分的一種洗脫液。
36.一種多峰色譜介質(zhì)，包含: (a)—種微粒二氧化硅基質(zhì)； (b)一個(gè)結(jié)合到所述基質(zhì)上的第一離子交換結(jié)合位點(diǎn)； (C)一個(gè)不帶電的結(jié)合位點(diǎn)，該不帶電的結(jié)合位點(diǎn)是選自也結(jié)合到所述基質(zhì)上的一個(gè)親水相互作用色譜結(jié)合位點(diǎn)、和一個(gè)反相色譜結(jié)合位點(diǎn)的一個(gè)成員；以及 (d) —個(gè)選自一個(gè)第二離子交換結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)第二不帶電的結(jié)合位點(diǎn)的成員，該第二不帶電的結(jié)合位點(diǎn)是選自也結(jié)合到所述基質(zhì)上的一個(gè)親水相互作用色譜結(jié)合位點(diǎn)、和一個(gè)反相色譜結(jié)合位點(diǎn)的一個(gè)成員。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的色譜介質(zhì)，其中，所述第一離子交換結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)陰離子結(jié)合位點(diǎn)。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的色譜介質(zhì)，進(jìn)一步包括一個(gè)第二離子交換結(jié)合位點(diǎn)。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的色譜介質(zhì)，其中，所述第一離子交換結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)陰離子結(jié)合位點(diǎn)并且所述第二離子交換結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)陽離子交換結(jié)合位點(diǎn)。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的色譜介質(zhì)，其中，所述不帶電的結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)反相結(jié)合位點(diǎn)。
41.根據(jù)權(quán)利要 求39所述的色譜介質(zhì)，其中，所述不帶電的結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)親水相互作用結(jié)合位點(diǎn)。
【文檔編號(hào)】B01D15/20GK103877748SQ201310712282
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月21日
【發(fā)明者】X·劉, U·埃契, C·A·波爾 申請(qǐng)人:戴安公司