一種層析柱的制作方法
【專利摘要】本實用新型提供了一種層析柱，所述層析柱包括至少兩個不同的固體層，以雙層層析柱為例，由第一固體層和第二固體層串聯(lián)耦合組成，所述第一固體層是由陰離子交換膜或微珠組成，所述第二固體層是由硅膠膜或微珠組成，所述層析柱結(jié)構(gòu)簡單、使用方便，特別適合同時分離RNA和DNA，以及用于提取如病毒等被蛋白質(zhì)包裹的核酸，和用于分離體積大而且濃度低的核酸，如血漿中提取少量的核酸；所提取的核酸可直接用于下游應(yīng)用。
【專利說明】一種層析柱
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其一種層析柱。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸提取被用于許多分子生物化學(xué)試驗和診斷，是克隆、轉(zhuǎn)化、酶切、體外轉(zhuǎn)錄、擴增、測序等重要的第一個步驟。然而由于細胞內(nèi)存在大量蛋白質(zhì)、碳水化合物、原始樣品中的代謝物以及其它污染物，提取高質(zhì)量的核酸并非易事?，F(xiàn)階段的核酸提取方法包括:
[0003](I)硅膠為基礎(chǔ)的提取方法:硅膠或二氧化硅為基礎(chǔ)的提取方法已成為一種流行的核酸提取方法，其中包括使用控制的微孔玻璃，嵌入二氧化硅顆粒的濾膜，硅膠顆粒，二氧化硅構(gòu)成的藻土型樹脂，和玻璃纖維。基本過程為，在高濃度離液鹽的存在下，DNA或RNA會粘結(jié)到硅膠樹脂或膜的表面，其它污染被沖洗走，然后用水或低鹽緩沖液洗脫DNA或RNA。
[0004]以硅膠為基礎(chǔ)的提取原理是依據(jù)在高濃度的離液鹽，例如碘化鈉(NaI)，高氯酸鈉(NaC104)，鹽酸胍(GuHCl )，和異硫氰酸胍(GuTC)等的條件下，帶負電荷的DNA骨架與帶正電的硅膠表面具有高度的親和力。
[0005]現(xiàn)階段已對離子強度、溫度、pH值、DNA大小和構(gòu)象與核酸結(jié)合到硅膠表面上的影響進行了研究，例如，在硅膠表面的結(jié)合能力與離液鹽濃度是呈線性相關(guān)的。此外，在一個給定的離液鹽濃度下，PH值越低則所有類型的DNA與硅膠表面的結(jié)合能力越高。
[0006]異硫氰酸胍(GuTC)和鹽酸胍(GuHCl)是常用的將核酸與硅膠表面粘結(jié)的試劑。碘化鈉(NaI)和高氯酸鈉(NaC104)也被少量的使用。異硫氰酸胍(GuTC)在濃度為4M至6M時效果最好，而鹽酸胍(GuHCl)則在6M的較高濃度下使用。在乙醇或異丙醇的條件下其結(jié)合效率顯著改善。以及控制結(jié)合試劑PH值為6至7.5的醋酸鈉和Tris-HCl緩沖液。而且，已知的可有效地裂解細胞并使蛋白質(zhì)變性的胍鹽，例如異硫氰酸胍(GuTC)的使用則免除了添加蛋白酶等變性酶的需求。
[0007]這種層析柱常用硅膠樹脂或膜作為固定相，并常用離心或真空來驅(qū)動，例如Promega公司的PureYield質(zhì)粒小量提取系統(tǒng)和WizardPlus小量DNA制備純化系統(tǒng),來自Qiagen公司的QIAprep小量制備試劑盒,和Bioland公司的EZgene質(zhì)粒小量制備純化試劑盒。
[0008]以硅膠為基礎(chǔ)的DNA提取方法具有快速、簡便、有效的特點，所純化的DNA質(zhì)量高并可以用于多種下游應(yīng)用。然而由于高達3倍體積的離液鹽溶液被添加到I份體積的DNA或RNA樣品中方可達到硅膠結(jié)合DNA所需的有效離液鹽的濃度，因而對血漿等標本的起始體積受到很大限制。
[0009](2)陰離子交換為基礎(chǔ)的DNA提取方法:通常也使用陰離子交換樹脂及膜的方法來分離核酸。這一過程中在低PH值及低鹽濃度下DNA可與陰離子交換劑結(jié)合，隨即可用高PH值及高濃度的鹽溶液來洗脫DNA。
[0010]其結(jié)合原理是基于DNA主鏈上的帶負電荷的磷酸根離子與分子表面上帶正電的DEAE等基團之間的相互作用，溶液中的鹽濃度和pH值決定了是否結(jié)合或洗脫DNA。
[0011]通常以微珠為基礎(chǔ)的陰離子交換柱多是重力流動型的，例如QIAGEN公司的基因組柱試劑盒。QIAGEN公司的樹脂是由多孔型硅膠微珠為基質(zhì)并加有一層二乙基氨基乙醇(DEAE)官能團的涂層；其它的則包括PALL公司的AciOSep層析柱，它是由弱的陰離子交換樹脂DEAE陶瓷HYPERD F微珠以及Q強陰離子交換陶瓷HYPERD F微珠組成的。
[0012]與基于微珠柱子相比，通常使用的為離心型或真空抽吸驅(qū)動型陰離子交換膜式柱子，例如Vivapure弱陰離子交換微型D膜離心柱和Vivapure強陰離子交換Q膜離心柱，它們具有流速高、成本低、高通量的優(yōu)勢。
[0013]陰離子交換柱提供了 一個簡單、安全、可靠的用于從各種樣品中分離核酸的方法，其所制備的核酸具有相當于兩次CsCl梯度離心純化的超純度。然而因為在洗脫液中含有高濃度的鹽，洗脫的核酸是不能直接使用的，通常需要一個額外的步驟，例如，乙醇或異丙醇沉淀以去除鹽。
[0014]因此，我們研發(fā)了一種新的層析柱，用以克服前述基于硅膠提取和基于陰離子交換提取核酸兩者的缺點，使核酸提取方法更加簡單、快速、高效、可靠，且具有成本效益，將具有非常重要的應(yīng)用價值。
實用新型內(nèi)容
[0015]本實用新型所要解決的技術(shù)問題在于提供一種層析柱。
[0016]為解決上述技術(shù)問題，本實用新型的技術(shù)方案是:
[0017]一種層析柱，包括至少兩個不同的固體層，以雙層層析柱為例，由第一固體層和第二固體層串聯(lián)耦合組成，所述第一固體層是由陰離子交換膜或微珠組成，所述第二固體層是由娃膠膜或微珠組成。
[0018]優(yōu)選的，上述層析柱，所述陰離子交換膜或微珠為陰離子交換劑二乙胺(D或DEAE)，季銨(Q)或二乙基氨基丙基(ANX)。
[0019]優(yōu)選的，上述層析柱，還包括層析柱柱體，所述層析柱柱體一端為外磨口，所述層析柱柱體另一端為內(nèi)磨口，層析柱柱體內(nèi)為所述串聯(lián)耦合組成的第一固體層和第二固體層。
[0020]優(yōu)選的，上述層析柱，還包括一個用于防止層析柱污染的蓋子，所述蓋子套于所述層析柱柱體外。
[0021 ] 優(yōu)選的，上述層析柱，所述內(nèi)磨口的口徑小于所述外磨口的口徑。
[0022]優(yōu)選的，上述層析柱，所述第一固體層和第二固體層設(shè)置于近內(nèi)磨口一端。
[0023]上述層析柱應(yīng)用時:(I)第一固體層，當含有核酸的第一溶液流經(jīng)時，其中核酸結(jié)合到此層，并在第二溶液流經(jīng)時核酸被洗脫；(2)第二固體層，當?shù)诙芤毫鹘?jīng)時，其中被洗脫的核酸可結(jié)合到此層，并在第三溶液流經(jīng)時被洗脫。在溶液經(jīng)過第一固體層然后通過第二固體層這種方式下，從而使得第一固體層串聯(lián)耦合到第二固體層。
[0024]本實用新型的有益效果是:
[0025]本實用新型所述層析柱結(jié)構(gòu)簡單、使用方便，特別適合同時分離RNA和DNA，以及用于提取如病毒等被蛋白質(zhì)包裹的核酸，和用于分離體積大而且濃度低的核酸，如血漿中提取少量的核酸；所提取的核酸可直接用于下游應(yīng)用?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0026]圖1是一個雙層層析柱的示意圖，在所示的例子中，1-第一固體層，2-第二固體層，其中，第一固體層是一種陰離子交換膜，例如DEAE膜；第二固體層是硅膠膜，它們是呈順序性的串聯(lián)耦合；溶液流過第一固體層，然后通過第二固體層；
[0027]圖2顯示了雙層層析柱內(nèi)的提取過程，以DEAE膜為第一固體層和硅膠膜為第二固體層為例，箭頭表示溶液流過DEAE膜，然后通過硅膠膜；雙彎曲的線則代表核酸，按照第一溶液及第二溶液的順序被結(jié)合到DEAE膜上然后被洗脫；再根據(jù)所述第二及第三溶液的順序核酸被結(jié)合到硅膠膜上，然后被洗脫；
[0028]圖3顯示了一個示例的雙層層析柱，1-第一固體層，2-第二固體層，3-柱體，5-內(nèi)磨口，6-外磨口，其中，第一固體層是由五張Whatman DE81片材組成的DEAE膜,而第二固體層則是的硅膠膜，直徑7毫米；
[0029]圖4標示出了用I %瓊脂糖凝膠來檢測的所提取的Ikb梯度DNA標記物及人類基因組DNA的大小，其中，泳道M是未經(jīng)處理的Ikb梯度DNA標記和基因組DNA混合控制物，泳道I一4是用不同條件下的第二溶液洗脫的Ikb梯度DNA標記物和人類基因組DNA，泳道5— 8是第一溶液的濾液，泳道9至12中的IX TE洗滌緩沖液的濾液。
[0030]圖5是另一個雙層層析柱的示意圖，其中，1-第一固體層，2-第二固體層，3-柱體，4-蓋子，5-內(nèi)磨口，6-外磨口。
【具體實施方式】
[0031]實施例1
[0032]一種層析柱，為雙層層析柱，由第一固體層I和第二固體層2串聯(lián)耦合組成，所述第一固體層I用DEAE陰離子交換膜作為第一陰離子交換介質(zhì)，所述第二固體層2用硅膠膜作為第二硅膠介質(zhì)(圖1)。
[0033]本實用新型所述層析柱在使用過程中，溶液流過第一固體層，然后通過第二固體層，可通過真空抽吸或離心來驅(qū)動溶液的流動，當含有核酸的第一溶液流過第一固體層時，核酸既結(jié)合于此層(圖2);當?shù)诙芤毫鹘?jīng)已結(jié)合核酸的第一固體層時，即可洗脫已結(jié)合的核酸，當它流經(jīng)所述第二固體層，將已洗脫的核酸結(jié)合至第二固體層。在這個意義上“串聯(lián)耦合器”即第二溶液將核酸從第一固體層洗脫下來，然后將核酸結(jié)合到第二固體層上；當?shù)谌齻€溶液流經(jīng)已結(jié)合核酸的第二固體層時可洗脫出核酸。
[0034]此外，作為雙層的組成物，第一固體層還可為其他陰離子交換膜或微珠。陰離子交換膜或微珠構(gòu)成一個支承介質(zhì)及一個以共價連接的陰離子交換劑?？墒褂萌蹶庪x子交換劑的二乙胺(D，或DEAE)，強陰離子交換劑的季銨鹽(Q)，以及另一個弱的陰離子交換劑二乙基氨基丙基(ANX)(表I)。
[0035]表I第一固體層的陰離子交換劑的功能基團
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種層析柱，其特征在于:包括至少兩個不同的固體層，即至少包括第一固體層和第二固體層，所述層析柱由所述第一固體層和所述第二固體層串聯(lián)耦合組成，所述第一固體層是由陰離子交換膜或微珠組成，所述第二固體層是由硅膠膜或微珠組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的層析柱，其特征在于:所述陰離子交換膜或微珠為陰離子交換劑二乙胺，季銨或二乙基氨基丙基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的層析柱，其特征在于:還包括層析柱柱體，所述層析柱柱體一端為外磨口，所述層析柱柱體另一端為內(nèi)磨口，層析柱柱體內(nèi)為所述串聯(lián)耦合組成的第一固體層和第二固體層。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的層析柱，其特征在于:還包括一個用于防止層析柱污染的蓋子，所述蓋子套于所述層析柱柱體外。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的層析柱，其特征在于:所述內(nèi)磨口的口徑小于所述外磨口的口徑。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的層析柱，其特征在于:所述第一固體層和第二固體層設(shè)置于近內(nèi)磨口一端。
【文檔編號】B01D15/22GK203389364SQ201320138958
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月14日
【發(fā)明者】丁少峰, 劉強 申請人:丁少峰, 劉強