基于nmr的代謝物篩選平臺的制作方法
【專利摘要】描述了使人們能夠特異性測量特定分子在相對較少的細胞（例如原代細胞）中的代謝產(chǎn)物的方法。該方法牽涉任選與標記底物（例如通過13c，15N，或31P標記）一起預先加載細胞。該方法容許不同表型的細胞中差異生成的代謝物的容易鑒定。用于無偏愛的多維NMR篩選和NMR篩選的快速且有效分析的新方法鑒定不同細胞或組織類型中的差異表達的代謝物。對差異表達的代謝物的分析可以呈現(xiàn)可以對其設計小分子治療劑的獨特的可用藥靶物。
【專利說明】基于NMR的代謝物篩選平臺
[0001] 關于聯(lián)邦資助研究的聲明
[0002] 本發(fā)明在國家健康研究所授予的R21AI087431下在政府幫助下進行。政府具有本 發(fā)明的某些權利。 發(fā)明領域
[0003] 本發(fā)明涉及基于NMR的篩選平臺。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 細胞的代謝輸出是限定該細胞類型的功能性基因組，轉(zhuǎn)錄物組和蛋白質(zhì)組網(wǎng)絡的 總和。代謝物組學是代謝物組中的代謝物水平及其由于刺激物而隨時間變化的全面且同 時的系統(tǒng)性測定。雖然其它領域可以提供關于例如給定基因，mRNA或蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)的信 息；但是牽涉代謝物的化學過程的此研究提供了所有異常基因，RNA，和/或蛋白質(zhì)的下游 總和。此"代謝指紋"代表特定細胞類型中所有運行或非運行途徑的瞬象。
[0006] 已經(jīng)使用幾種分析方法，包括質(zhì)譜術，層析，和NMR分光術來量化細胞代謝物。質(zhì) 譜術和層析兩者需要較小的樣品量，并且可以容易適合于高通量分析；然而，這兩種方法都 通常牽涉至少一個（若不是幾個）純化步驟。此外，在大多數(shù)情況中，要檢查的代謝物必須 推理預選擇。非祀向質(zhì)譜術（untargeted mass spectrometry)方法是可能的，但是需要幾 輪純化和進一步鑒定方法。另外，不是所有代謝物，包括核苷酸類類似物和脂質(zhì)是容易可電 離的，因此不能通過質(zhì)譜術檢測。此外，源自質(zhì)譜術的片段化樣式不總是適合于區(qū)別諸如具 有相等質(zhì)量，但不同結構的糖等分子，因此限制分析。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本文中描述了一種快速的，無偏愛的，超高分辨率，定量NMR篩選平臺，其利用任 何組合的下列任一種，兩種，三種，四種，或所有五種技術：底物的穩(wěn)定同位素標記，光譜 寬度折疊，隨機相取樣，非均勻取樣，和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴展，以產(chǎn)生定制的 "NMR代謝物陣列"，其中將給定細胞樣品的所有已知代謝物的共振分類，并用于簡化統(tǒng)計學 分析的比較。這是第一次組合所有這些技術來提供穩(wěn)健的，有效的且高通量的NMR代謝物 篩選方案。步驟的組合容許水溶性和基于脂質(zhì)的代謝物兩者的全局的，無偏愛的，超高的分 辨率。另外，本文中描述的新穎"NMR代謝物陣列"程序提供了以簡化方式分析較大的復雜 NMR數(shù)據(jù)集的新方式。該新平臺同時容許差異表達的代謝物的快速鑒定，特定代謝物的量 化，和分析給定前體的代謝流量的能力。
[0009] 新方法使人們能夠特異性追蹤特定分子在相對較少的細胞（例如約200-2000萬 個細胞）中的代謝分解。該方法牽涉與經(jīng)標記前體底物（例如用 13C，或15N，或31P標記）一 起預先加載細胞，并使用多維NMR。該方法不需要在分析前純化感興趣的各個代謝物，所述 分析容許具有不同特性的細胞中差別生成的代謝物的全局，無偏愛鑒定。
[0010] 正常和疾病狀態(tài)細胞中差異表達的代謝物的鑒定可以是臨床上的一種有力的工 具。用于監(jiān)測來自表型上不同的細胞的代謝物的差異表達的新方法特別可用于鑒定可以用 于調(diào)控表型的治療性靶物。這包括存在于代謝物的生物合成途徑中的靶物，或代謝物自身。 此外，鑒定差異表達的代謝物可以用于區(qū)別正常對疾病狀態(tài)的細胞。因此，它們具有充當與 其關聯(lián)的表型的生物標志物的潛力，使本文中描述的方法可用于鑒定診斷標志物，例如用 于診斷疾病的標志物。
[0011] 另外，本文中描述了我們鑒定N-乙酰神經(jīng)氨酸（NANA)作為乳腺癌腫瘤啟動細胞 的新穎生物標志物，并且監(jiān)測其表達可以用于診斷和檢測乳腺癌。另外，顯示了 CMAS(NANA 生物合成中的一種酶）的蛋白質(zhì)水平在乳腺腫瘤啟動細胞中顯著過表達。在此工作前，尚 未探索CMAS在腫瘤啟動和轉(zhuǎn)移中的作用。在本文中，我們提供了如下的證據(jù)，即CMAS表達 對于腫瘤形成和遷移是絕對重要的，且CMAS是乳腺癌的一種新穎的真正靶標。
[0012] 對個別患者的細胞分析應用此方法還會為用于患者護理的"個人化醫(yī)學"方法提 供基礎。
[0013] 因而，本公開內(nèi)容描述了用于監(jiān)測細胞群體，例如原代細胞群體，組織細胞群體， 或培養(yǎng)細胞（例如永生化細胞）內(nèi)的給定底物前體的代謝的方法。描述了使用本文中描述 的方法鑒定具有不同表型的兩種或更多種細胞群體間的差異表達代謝物。還描述了用于鑒 定潛在的治療靶物和診斷標志物的方法。
[0014] 一般而言，在第一個方面，公開內(nèi)容特征在于在樣品中監(jiān)測給定類型細胞內(nèi)的底 物代謝的新方法。該新方法包括（a)用底物將第一樣品的給定類型細胞培養(yǎng)足夠的時間 段，使得容許所述底物代謝分解成底物代謝物，其中任選地用核磁共振（NMR)穩(wěn)定同位素 標記所述底物的至少一部分；(b)從步驟（a)的細胞收獲所述底物代謝物以獲得底物代謝 物的第二樣品；并（c)對步驟（b)的所述第二樣品實施多維NMR以測定代謝底物的共振譜 (resonance spectrum)，其中所述共振譜代表所述底物的代謝物，且其中所述多維NMR包含 下列任一種技術：光譜寬度折疊 （spectral width folding)，隨機相取樣（random phase sampling),非均勻取樣（non-uniform sampling),和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴展 (data extension for enhanced dynamic range data reconstruction)〇
[0015] 在另一個方面，公開內(nèi)容特征在于用于鑒定第一細胞群體和第二細胞群體之間的 差異表達的底物代謝物的方法。這些方法包括（a)任選地，與核磁共振（NMR)穩(wěn)定同位素 標記底物一起加載第一和第二細胞群體；(b)將步驟（a)的所述第一和第二細胞群體培養(yǎng) 足夠的時間段，使得容許所述底物向底物代謝物的代謝分解；（c)從步驟（b)的所述第一和 第二群體細胞收獲所述底物代謝物以從所述第一和第二細胞群體中每種獲得底物代謝物 的樣品；（d)對所述第一和第二細胞群體中每種的步驟（c)的樣品實施多維NMR以測定所 述第一細胞群體和所述第二細胞群體的代謝底物的共振譜，其中所述共振譜代表所述底物 的代謝物；并（e)比較所述第一細胞群體的共振譜與所述第二細胞群體的共振譜以測定哪 些共振是差異表達的，其中差異表達的共振提供代表差異表達的代謝物的共振標記。
[0016] 在這些方法之任一種中，多維NMR可以包括任何組合的下列任兩種，三種，或所有 四種技術：光譜寬度折疊，隨機相取樣，非均勻取樣，和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴展。 在這些方法之任一種中，底物可以用NMR穩(wěn)定同位素標記，且多維NMR可以包括任何組合的 下列任兩種，三種，或所有四種技術：光譜寬度折疊，隨機相取樣，非均勻取樣，和增強動態(tài) 范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴展。
[0017] 在這些方法的一些實施方案中，沒有將存在于所述樣品中的所述底物代謝物與所 述樣品中的其他分子分開。在一些實施方案中，在與NMR標記底物一起加載細胞前將細胞 群體內(nèi)的底物濃度降低一段時間，并使用為所述底物定制的NMR脈沖程序或過濾技術或兩 者測定經(jīng)標記的底物的代謝物的共振。細胞群體內(nèi)的細胞數(shù)目可以小于2X 106,并且細胞 群體可以是原代細胞群體。
[0018] 這些方法之任一種可以進一步包括比較步驟（e)的共振標記與已知共振標記的 數(shù)據(jù)庫以測定所述共振標記代表的分子結構，由此測定所述第一和第二細胞群體之間差異 表達的底物代謝物。
[0019] 在某些實施方案中，所述方法可以進一步包括鑒定底物代謝物生成中牽涉的生物 合成途徑，并鑒定途徑中可以被靶向以調(diào)控所述代謝物的差異表達，由此調(diào)控細胞表型的 蛋白質(zhì)/酶。在一些實施方案中，所述第一細胞群體和所述第二細胞群體是同基因群體和/ 或所述第一細胞群體和所述第二細胞群體具有不同表型。在一些實施方案中，所述第一細 胞群體是對照細胞群體，且所述第二細胞群體已經(jīng)與測試化合物或藥劑接觸?？梢允褂盟?述方法鑒定在特定細胞類型中活性過度或活性不足的代謝途徑。所述方法可以進一步包括 抑制或過表達所述第二細胞群體中的基因，并且使用所述方法鑒定在細胞中過表達或抑制 基因的代謝結果。
[0020] 在另一個方面，公開內(nèi)容的特征在于用于治療受試者中的癌癥的方法。該方法基 于使用本文中描述的新平臺方法測定的結果。治療癌癥的方法包括對有此需要的受試者施 用有效量的N-?；窠?jīng)氨酸胞苷酰基（citidylyl)轉(zhuǎn)移酶（CMAS)抑制劑，N-乙酰神經(jīng)氨 酸合酶（NANS)抑制劑，或降低N-乙酰神經(jīng)氨酸表達的分子。例如，抑制劑可以是酶或者可 以選自下組：小分子，核糖核酸，脫氧核糖核酸，蛋白質(zhì)，肽，和抗體。
[0021] 如本文中使用的，術語"同基因的"指從相同組織類型（任何組織，例如相同器官、 皮膚、膀胱、肝、心臟等的組織）及從相同生物體類型（例如人，或動物，或魚）分離的相同 遺傳背景的細胞（任何細胞類型，例如上皮細胞，或脂肪細胞，或干細胞，或肌肉細胞等）。
[0022] 如本文中使用的，術語"代謝物"指代謝的中間體或終產(chǎn)物。"代謝物"具有包括對 酶的能源，結構，信號傳導，刺激，和抑制影響的功能。代謝物還可以自身具有催化活性。代 謝物可以是底物-酶反應的終產(chǎn)物。
[0023] 如本文中使用的，術語"代謝前體"指參與化學反應的化合物。該術語意圖包括作 為得到終產(chǎn)物的酶促反應的起始化合物或中間體化合物的化合物。
[0024] 術語"底物"指酶對其起作用并且導致底物轉(zhuǎn)化成一種或多種終產(chǎn)物的分子或化 合物。終產(chǎn)物從酶的活性位點釋放。
[0025] 術語"酶"指在其活性位點中接受底物，并且將底物轉(zhuǎn)化成一種或多種終產(chǎn)物，隨 后該終產(chǎn)物從活性位點釋放的分子。
[0026] 如本文中使用的，術語"原代細胞"或"原代組織"指從正常個體或具有獲得性或 遺傳性疾病的個體的活組織直接采集并且為了在體外生長而建立的細胞或組織。
[0027] 術語"轉(zhuǎn)移"指癌癥從其作為原發(fā)性腫瘤出現(xiàn)的地方擴散到身體的遠離位置及新 建立的腫瘤自身的過程，所述新建立的腫瘤又稱為"轉(zhuǎn)移性腫瘤"，其可以源自許多原發(fā)性 腫瘤類型，包括但不限于前列腺，結腸，肺，乳腺，骨，和肝起源的。例如，當從原發(fā)性腫瘤脫 落的腫瘤細胞粘著血管內(nèi)皮，穿透到周圍組織中，并且在與原發(fā)性腫瘤分開的部位生長，從 而形成獨立腫瘤時形成轉(zhuǎn)移。
[0028] 術語"癌癥"指具有自主生長能力的細胞。例子包括具有以快速增值細胞生長為 特征的異常狀態(tài)或狀況的細胞。該術語意圖包括癌性生長，例如腫瘤（例如實體瘤）；致 癌性過程，轉(zhuǎn)移性組織，和惡性轉(zhuǎn)化細胞，組織，或器官，與侵入性的組織病理學類型或階段 無關。還包括各種器官系統(tǒng)，諸如呼吸，心血管，腎，生殖，血液學，神經(jīng)學，肝，胃腸，和內(nèi)分 泌系統(tǒng)的惡性；及腺癌，其包括惡性，諸如大多數(shù)結腸癌，腎細胞癌，前列腺癌和/或睪丸腫 瘤，非小細胞肺癌，小腸癌，和食管癌。"天然發(fā)生的"癌癥包括不是通過將癌細胞植入受試 者中憑實驗誘導的任何癌癥，并且包括例如自發(fā)發(fā)生的癌癥，通過將患者暴露于致癌物引 起的癌癥，源自轉(zhuǎn)基因癌基因的插入或腫瘤抑制基因的敲除的癌癥，和由感染（例如病毒 感染）引起的癌癥。術語"癌"是本領域公認的，并且指上皮或內(nèi)分泌組織的惡性。該術語 還包括癌肉瘤，其包括由癌瘤性和肉瘤組織構成的惡性腫瘤。"腺癌"指源自腺組織或其中 腫瘤細胞形成可認識的腺結構的癌癥。
[0029] 如本文中使用的，術語"治療"或"處理"指為了賦予治療效果，例如為了治愈，減 緩，改變，影響，改善，或減少病癥，其癥狀，或素因，對受試者施用一種或多種本文中描述的 化合物，該受試者具有用此類化合物可治療的病癥，和/或此類病癥的癥狀，和/或此類病 癥的素因。
[0030] 如本文中使用的，術語"有效量"指對治療的患者賦予治療效果需要的活性化合物 的量。有效劑量會隨治療疾病的類型，施用路徑，賦形劑使用，和與其它治療性處理的共使 用的可能性而變化，如本領域技術人員認可的。
[0031] 治療性化合物的劑量，毒性，和治療功效可以在細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏型ㄟ^標 準藥學規(guī)程（例如用于測定LD50(對50%群體致死的劑量）和ED50(在50%群體中治療有 效的劑量））測定。毒性和治療效果之間的劑量比率是治療指數(shù)，并且其可以以比率LD50/ ED50表示。展現(xiàn)出高治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。雖然可以使用展現(xiàn)出毒性副作用的化合 物，應當注意設計投遞系統(tǒng)，其將此類化合物靶向到受累組織的部位，以使對未感染細胞的 潛在損傷最小化，由此降低副作用。
[0032] 除非另有規(guī)定，本文中使用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所屬領域的普通技術 人員的通常理解具有相同的意義。雖然與本文中所描述的方法和材料相似或等同的方法和 材料可以用于實施或測試本發(fā)明，下文描述了合適的方法和材料。本文中提及的所有出版 物，專利申請，專利，或其它參考文獻通過提及完整收錄。在沖突的情況中，應當以本說明書 (包括定義）為準。另外，材料，方法和例子僅僅是例示性，而非意圖為限制性的。
[0033] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點從以下詳細描述及從權利要求書看會是顯而易見的。
[0034] 附圖簡述
[0035] 圖1是流程圖，其匯總了本文中描述的基于NMR的代謝物篩選平臺的關鍵步驟。
[0036] 圖2A-F詳述了 NMR方法中的采集和處理的每個步驟，所述NMR方法容許快速的， 無偏愛的，超高分辨率代謝物序型分析（profiling)。圖2A-2D證明了光譜寬度（sw)折疊 策略，其中將sw從220pm降低至90ppm導致分辨率升高2. 5倍。圖2E匯總了非均勻取樣 (NUS)策略，其容許時間縮短40%中分辨率升高4倍或分辨率升高8倍。圖2F顯示了使用 正向最大熵重建（forward maximum entropy reconstruction)處理的 NUS 13C-1H HSQC 譜（左側(cè)）和在重建中包括將分辨率提高2倍的數(shù)據(jù)擴展步驟后的相同NUS 13C-1H HSQC 譜（右側(cè)）。
[0037] 圖3A和3B分別是展示來自相同p53缺陷小鼠肺腫瘤的水溶性（3A)和基于脂質(zhì) 的（3B)代謝物的全代謝覆蓋的HSQC譜。
[0038] 圖4是流程圖，其匯總了用于創(chuàng)建用于快速分析的NMR陣列的定制NMR分析程序。
[0039] 圖5A-C是來自2000萬個未標記的（5A)，13C_谷氨酰胺溫育的（5B)和 13C_葡萄糖 溫育的（5C)乳腺腫瘤啟動細胞的水溶性代謝物的一組13CjH HSQC共振譜。
[0040] 圖6突出顯示了本文中描述的NMR陣列中可得到的信息。使用圖5A-C中的未標 記的，谷氨酰胺，和葡萄糖譜，創(chuàng)建主查找(master look up)以為所有可能共振代謝物產(chǎn)生 代謝物ID，并將這些在X軸上列出。Y軸顯示每個條件下每個共振的相對強度，突出顯示差 別的葡萄糖和谷氨酰胺衍生的代謝物。
[0041] 圖7A-B是乳腺腫瘤啟動BPLER細胞（圖7A)和惡性較小的同基因 HMLER細胞（圖 7B)中的水溶性葡萄糖衍生代謝物的13CjH HSQC共振譜的代表性例子。
[0042] 圖7C匯總了 BPLER和HMLER HSQC共振譜的NMR陣列，顯示了所有可能的 代謝物共振（X軸）的強度（Y軸）在每個細胞類型中如何變化。BPLER和HMLER細胞起源 于相同正常乳腺組織，并且培養(yǎng)成兩種細胞類型，即化學成分確定的WIT培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 BPEC (乳腺原代上皮細胞）和MEGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HMEC (人乳腺上皮細胞）。將BPEC和 HMEC細胞用hTERT (L)，SV40早期區(qū)（E)，和H-ras (R)轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生BPLER和HMLER細胞。
[0043] 圖7D是NMR陣列預測為僅具有BPLER共振的區(qū)域中BPLER(紅色）和HMLER(藍 色） 130屮HSQC譜覆蓋的區(qū)域的圖像放大。
[0044] 圖8A-C匯總了用于確認BPLER NMR陣列中過表達的差異表達的代謝物是N-乙 酰神經(jīng)氨酸（NANA)的各種方法。圖8A是純NANA的ncJHHSQC。圖8B顯示了定制NMR HCN(氫-碳-氮）實驗的結果，其確認BPLER細胞具有差異表達的共振，與NANA具有相似 的連接性。圖8C顯示了 Μ/S結果，其使用液相層析-質(zhì)譜法多反應監(jiān)測（LC/MS MRM)直接 測量HMLER(左側(cè)）和BPLER(右側(cè)）細胞中的NANA，其中報告的數(shù)目是NANA峰下的面積。
[0045] 圖9是羅丹明標記的麥芽凝集素（WGA)免疫-熒光顯微術的顯微鏡照片的一系列 表示，其分別顯示HMLER(上排）和BPLER細胞（下排）中的NANA表達。WGA特異性結合 NANA。
[0046] 圖10是示意圖，其描繪了將葡萄糖轉(zhuǎn)化成NANA的酶促步驟，其中N-乙酰神經(jīng)氨 酸合酶（NANS)和N-?；窠?jīng)氨酸胞苷?；D(zhuǎn)移酶（CMAS)是關鍵的酶。
[0047] 圖11是柱形圖，其顯示了通過經(jīng)由siRNA下調(diào)CMAS，NANS，和PLKI對增殖的影響， 對HMLER和BPLER細胞的存活力。
[0048] 圖12A-C是一系列圖像，其提供了 NANA對BPLER和HMLER細胞的細胞遷移的影響 的概述。圖12A和12B各是一系列免疫組織化學圖像，其分別在HMLER和BPLER細胞中顯示 了在缺乏NANS和CMAS的情況下對細胞遷移的抑制和用NANA對遷移的挽救。圖12C是柱 形圖，其量化在缺乏NANS和CMAS的情況中遷移細胞的數(shù)目及在添加 NANS后的隨后遷移。
[0049] 圖13A-B是柱形圖，其描繪了 HMLER和BPLER細胞中CMAS和cMYC的定量PCR(mRNA 水平）（13A)和對NANS和CMAS表達的Western印跡分析（13B)。
[0050] 圖14A和14B是CMAS表達對細胞遷移影響的免疫組織化學圖像。圖14A是過表 達CMAS后HMLER細胞遷移的一系列免疫組織化學圖像。圖14B是BPLER細胞和穩(wěn)定CMAS 敲低BPLER細胞（BPLER-shCMASl)的一系列免疫組織化學圖像。
[0051] 圖15A-B匯總了測定CMAS水平對體內(nèi)腫瘤啟動和轉(zhuǎn)移的影響的策略。圖15A顯示 了免疫方案，且圖15B顯示了在注射500, 000個BPLER (左側(cè)）或500, 000個BPLER-shCMASl 細胞的NOD/SCIN小鼠中后每天的腫瘤體積生長。
[0052] 圖16A，16B，16C和16D分別是CMAS (基于NANA結構的合成的基于底物的CMAS抑 制劑）的酶機制和免疫組織化學分析，其顯示了用合成的氟-NANA抑制劑抑制細胞遷移。
[0053] 圖 17A 和 17C 是（2R，3R，4S)-4-胍基-3-(丙-1-烯-2-基氨 基）-2-((11?，21〇-1，2,3-三羥基丙基）-3,4-二氫-2!1-吡喃-6-羧酸（其是扎那米韋 (Zanamivir)，以瑞樂砂（Relenza) ? 銷售）（圖 17A)和乙基（3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰 氨基-3-(戊燒-3-基氧基）-環(huán)己-1-烯-1-羧酸酯（其是奧司他韋（oseltamivir)，以達 菲（Tamiflu) ?銷售）（圖17C)的化學結構。
[0054] 圖17B和17D顯示了瑞樂砂⑧對BPLER細胞遷移（17D)和對照（17B)的影響的免 疫組織化學分析。這兩種藥物都是神經(jīng)氨酸苷酶抑制劑。
[0055] 圖18A和18B是顯示了在存在和缺乏神經(jīng)氨酸苷酶的情況中HMLER和BPLER細胞 中NANA表達的免疫熒光顯微術圖像（18A)和在存在和缺乏神經(jīng)氨酸苷酶的情況中HMLER 和BPLER細胞遷移的免疫組織化學圖像（18B)。
[0056] 發(fā)明詳述
[0057] 本公開內(nèi)容描述了新穎的方法，該方法提供了相對于已知NMR數(shù)據(jù)采集的多個方 面的益處，并且容許快速的，無偏愛的，全局的，定量超高分辨率NMR數(shù)據(jù)采集和定制NMR分 析，其利用新穎的辦法進行。本公開內(nèi)容描述了新的NMR篩選方法，其可以用于鑒定，追蹤， 和表征特定分子的代謝分解及用于分析對于給定細胞類型至關重要的細胞代謝物組學。本 文中描述的方法繞過已知NMR方案呈現(xiàn)的障礙，即實施數(shù)據(jù)采集必需的樣品大小降低，消 除對要分析的代謝物的純化的需要，多維NMR需要的實驗時間縮短及獲得代謝物鑒定必需 的高分辨率。該方法需要相對較少的細胞（200-2000萬個），其容許該方法用于研究來自原 代細胞和組織，而非僅來自細胞培養(yǎng)基的代謝物。另外，公開的方法不需要在分析前從其它 細胞代謝物純化個別感興趣代謝物。此外，新方法容許顯現(xiàn)給定前體在任何細胞類型中的 特定代謝命運，因此提供利用本文中也描述的新數(shù)據(jù)分析方法對不同細胞類型中差別生成 的代謝物的簡化鑒定。
[0058] 為了突出顯示新平臺方法的能力和寬度，本公開內(nèi)容描述了鑒定與惡性較小的同 基因系HMLER相比高度攻擊性的三重陰性乳腺癌腫瘤啟動BPLER細胞中的差異表達的代謝 物。本領域中公知的是，癌細胞依靠消耗葡萄糖而生長。葡萄糖代謝物N-乙?；?神經(jīng) 氨酸（NANA)在本文中已經(jīng)鑒定為在乳腺癌腫瘤啟動BPLER細胞中差異表達（即升高的表 達）。生成代謝物的生物合成途徑也已經(jīng)得到鑒定，并且用于將代謝物合成需要的蛋白質(zhì)/ 酶鑒定為途徑內(nèi)調(diào)控升高的腫瘤啟動和轉(zhuǎn)移潛力的表型的候選靶物。
[0059] 另外，將生成關鍵酶NANS和CMAS的基因沉默的敲低實驗的結果證明了降低這些 酶的正常功能以生成NANA并將其附著于蛋白質(zhì)對BPLER細胞的增殖沒有影響，但是大大降 低其遷移。另一方面，相同酶在HMLER細胞中受迫的過表達提高其遷移。在BPLER細胞中 穩(wěn)定敲低CMAS完全阻止小鼠中的腫瘤形成。因此，新方法成功用于鑒定對致腫瘤性重要的 代謝物（例如NANA)并且證明NANA和NANA合成中涉及的蛋白質(zhì)可以充當治療性干預的靶 物以降低乳腺腫瘤形成和腫瘤啟動細胞的轉(zhuǎn)移。另外，NANS和CMAS確認為用于在體外和 在體內(nèi)抑制腫瘤啟動和轉(zhuǎn)移的靶物。因此，這些酶的小分子和其它抑制劑是現(xiàn)在的候選治 療劑，其可以用于特異性靶向乳腺腫瘤啟動細胞。此外，差異表達的代謝物（例如NANA)也 可以充當與其關聯(lián)的表型的生物標志物，容許本文中描述的方法用于鑒定新的候選診斷標 志物。
[0060] 通用方法
[0061] 一般地，用于監(jiān)測給定細胞類型內(nèi)給定前體分子（即底物）的代謝物的本文中所 述新方法包括下列步驟：（a)任選地，與經(jīng)標記的底物，例如經(jīng) 13C_標記的底物一起加載細 胞群體，（b)將步驟（a)的細胞培養(yǎng)足夠的時間段，使得容許底物代謝分解成底物代謝物 (例如根據(jù)實驗問題，通常為5分鐘至24小時）；(c)從細胞中收獲底物代謝物以獲得底物 代謝物的樣品，例如底物代謝物的水溶性樣品和基于脂質(zhì)的代謝物的有機樣品；并（d)對 步驟（c)的樣品實施多維NMR以測定代謝底物的共振譜，其中共振代表底物代謝物的共振。 下文更為詳細描述了如何實施多維NMR。
[0062] 在這些方法中，可以使用各種底物和各種穩(wěn)定的自旋-1/2核同位素標記那些底 物。例如，葡萄糖，谷氨酰胺，脂肪酸，氨基酸，丙酮酸鹽，藥物化合物，和其它分子可以用作 底物，并且可以使用穩(wěn)定同位素，諸如 13c，15N，29Si，31P等標記底物。任何組織，原代細胞或 培養(yǎng)的細胞系可以用于分析，諸如癌細胞，肌肉細胞，脂肪細胞，內(nèi)皮細胞，上皮細胞，神經(jīng) 元細胞，心臟細胞，等等。一般地，會想要測試與特定疾病或病癥有關的細胞，諸如癌細胞， 以及來自健康受試者的相同細胞類型，以提供差異代謝分析。還可以測試具有單一基因突 變的細胞（即突變體細胞對野生型）或用藥物處理或不處理的細胞，或與前體一起溫育多 個時間的相同細胞。每份樣品的細胞群體可以是同質(zhì)細胞群體。在備選的實施方案中，每 份樣品的細胞群體可以是異質(zhì)細胞群體（例如源自組織樣品）。雖然本文中描述的方法中 可以使用任何細胞數(shù)目，在多個實施方案中，每個細胞群體內(nèi)的細胞數(shù)目可以小于IX 1〇8， 小于8xl07,小于7x 107,小于6x 107,小于5x 107,小于2. 5x 107,或小于2. OX 107,或細胞 數(shù)目的范圍可以為約lx 1〇6至lx 1〇8個細胞，或lx 1〇6至5x 107,或lxlO6至2. 5x 107,或 lx 106 至 2.0X 107。
[0063] 用于加載細胞的方法是本領域技術人員公知的，例如可以將經(jīng)標記的底物添加至 細胞培養(yǎng)基一段時間（例如5分鐘至24小時），或者可以通過轉(zhuǎn)染（例如脂質(zhì)體或磷酸 鈣），轉(zhuǎn)導（例如經(jīng)標記底物的病毒投遞）或注入（例如對腫瘤的直接注射）加載。在一個 實施方案中，對受試者施用經(jīng)標記的前體，例如口服，表面，胃腸外，或靜脈內(nèi)。在一些實施 方案中，對動物飼料添加經(jīng)標記的底物。
[0064] 在多個實施方案中，在添加含有經(jīng)標記的底物的培養(yǎng)基前，將細胞與缺乏任何底 物形式，例如缺乏未標記或標記的形式的底物的細胞培養(yǎng)基一起溫育。可以將細胞在此培 養(yǎng)基中溫育幾分鐘至幾小時，基本上使細胞對該底物饑餓。這有助于降低后來分析中的背 景。然后，將細胞與僅含有經(jīng)標記的底物的細胞培養(yǎng)基一起溫育（例如5分鐘至24小時）。 可以使用任何濃度的底物。在多個實施方案中，濃度范圍為lng/ml至>lmg/ml。熟練技術 人員可以通過測試多個濃度范圍容易地測定使用的最佳濃度。在溫育后，將細胞短暫清洗， 并立即收獲以分離代謝物。為了收獲代謝物，可以實施簡單的氯仿提取以獲得有機層中存 在的代謝物的水溶性樣品或非水溶性樣品。不需要額外的純化。
[0065] 幾種核磁共振（NMR)技術可以在本發(fā)明的方法，優(yōu)選多維NMR中使用。例如，可以 使用異核單量子相關（heteronuclear single quantum correlation, HSQC)分光術，HSQC 的變型，和其它多維NMR技術。用于實施多維NMR(例如2D NMR和/或130屮HSQC NMR)的 方法是本領域技術人員公知的。
[0066] 可以使用NMR脈沖程序（其可以定制用于底物）測定經(jīng)標記底物的代謝物的共振 譜。一般地，NMR使用靜態(tài)的，同質(zhì)的外部磁場來極化NMR樣品。此一次場通常稱作"B0" 場，并且它定義用于NMR系統(tǒng)的參照軸。如下在B0場的方向磁化NMR樣品，即將樣品在B0 場中放置一段時間（例如幾分鐘），并且容許樣品達到熱平衡狀態(tài)。一次B0場也通常定義 樣品中的自旋-1/2核種類的共振頻率。例如，更強的一次場一般提高核自旋的共振頻率。 核自旋以其相應的共振頻率在B0場周圍"旋進"。在大多數(shù)NMR系統(tǒng)中，核自旋具有射頻 (rf)范圍中的共振頻率。
[0067] 在NMR實驗中，通過以核自旋共振頻率應用時間變化磁場操作NMR樣品中的核自 旋。在一些例子中（例如用于低翻轉(zhuǎn)角（flip angle)脈沖），高強度射頻（RF)脈沖提供核 自旋的快速的精確控制。高強度RF脈沖具有較短的脈沖時間的益處，其降低脈沖期間發(fā)生 的脫散量。在一些例子中（例如用于高翻轉(zhuǎn)角脈沖），高強度RF脈沖提供較小的精度，例如 這是由于感興趣的頻率范圍里不均勻功率輸出，由于RF場中的空間不均勻性，或者由于其 他考慮。
[0068] 在一些實施方案中，絕熱脈沖可以對核自旋提供更精確的控制。絕熱脈沖通常具 有較低的強度，并且需要較長的脈沖時間。在一些情況中，絕熱脈沖用于較大的翻轉(zhuǎn)角脈沖 (例如180度翻轉(zhuǎn)角）以在感興趣的整個頻率范圍里提供更一致的翻轉(zhuǎn)角。絕熱脈沖通常 是實施的成形脈沖（意味著它們具有時間變化功率譜），其可以在特定的翻轉(zhuǎn)角，特定的頻 率范圍等方面參數(shù)化。
[0069] 在多個實施方案中，新的NMR方法包括使用下列任何一項或多項方法和技術 來提高分析速度和/或分辨率，或兩者：（i)穩(wěn)定同位素標記，（ii)折疊譜寬度和混淆 (aliasing)峰，（iii)隨機相取樣（iv)非均勻取樣，和（v)數(shù)據(jù)擴展。在一些實施方案中， 方法包括任何組合的這些中的至少兩種或三種方法。在一些實施方案中，方法包括所有5 種方法。下文表1匯總了每個步驟對NMR采集和數(shù)據(jù)分辨率的影響。下文更為詳細描述了 這些步驟。
[0070] 表 1
[0071]
【權利要求】
1. 一種用于在樣品中監(jiān)測給定類型細胞內(nèi)的底物代謝的方法，該方法包括： a. 用底物將第一樣品的給定類型細胞培養(yǎng)足夠的時間段，使得容許所述底物代謝分解 成底物代謝物，其中任選地用核磁共振（NMR)穩(wěn)定同位素標記所述底物的至少一部分； b. 從步驟（a)的細胞收獲所述底物代謝物以獲得底物代謝物的第二樣品；并 c. 對步驟（b)的所述第二樣品實施多維NMR以測定代謝底物的共振譜（resonance spectrum)，其中所述共振譜代表所述底物的代謝物，且其中所述多維NMR包含下列任一種 技術：光譜寬度折疊 （spectral width folding),隨機相取樣（random phase sampling), 非均勻取樣（non-uniform sampling)，和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴展（data extension for enhanced dynamic range data reconstruction)〇
2. 權利要求1的方法，其中所述多維NMR包含任何組合的下列任何兩種技術：光譜寬 度折疊，隨機相取樣，非均勻取樣，和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴展。
3. 權利要求1的方法，其中所述多維NMR包含任何組合的下列任何三種技術：光譜寬 度折疊，隨機相取樣，非均勻取樣，和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴展。
4. 權利要求1的方法，其中所述多維NMR包含下列所有四種技術：光譜寬度折疊，隨機 相取樣，非均勻取樣，和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴展。
5. 權利要求1的方法，其中用穩(wěn)定同位素標記所述底物，并且所述多維NMR包含任何組 合的下列任何兩種技術：光譜寬度折疊，隨機相取樣，非均勻取樣，和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重 建的數(shù)據(jù)擴展。
6. 權利要求1的方法，其中用穩(wěn)定同位素標記所述底物，并且所述多維NMR包含非均勻 取樣和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴展。
7. 權利要求1的方法，其中用穩(wěn)定同位素標記所述底物，并且所述多維NMR包含隨機相 取樣，非均勻取樣，和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴展。
8. 權利要求1的方法，其中用穩(wěn)定同位素標記所述底物，并且所述多維NMR包含所有下 列四種技術：光譜寬度折疊，隨機相取樣，非均勻取樣，和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴 展。
9. 權利要求1的方法，其中沒有將存在于所述樣品中的所述底物代謝物與所述樣品中 的其他分子分開。
10. 權利要求1至9中任一項的方法，其中在與經(jīng)NMR標記的底物一起加載細胞前將細 胞群體內(nèi)的底物濃度降低一段時間。
11. 權利要求1至9中任一項的方法，其中使用為所述底物定制的NMR脈沖程序或過濾 技術或兩者測定經(jīng)標記的底物的代謝物的共振。
12. 權利要求1至9中任一項的方法，其中所述細胞群體內(nèi)的細胞數(shù)目小于2 X 106。
13. 權利要求1至9中任一項的方法，其中所述細胞群體是原代細胞群體。
14. 一種用于鑒定第一細胞群體和第二細胞群體之間的差異表達的底物代謝物的方 法，該方法包括 ： a. 任選地，與經(jīng)核磁共振（NMR)穩(wěn)定同位素標記的底物一起加載第一和第二細胞群 體； b. 將步驟（a)的所述第一和第二細胞群體培養(yǎng)足夠的時間段，使得容許所述底物向底 物代謝物的代謝分解； C.從步驟（b)的所述第一和第二群體細胞收獲所述底物代謝物以從所述第一和第二 細胞群體中每種獲得底物代謝物的樣品； d. 對所述第一和第二細胞群體中每種的步驟（C)的樣品實施多維NMR以測定所述第一 細胞群體和所述第二細胞群體的代謝底物的共振譜，其中所述共振譜代表所述底物的代謝 物；并 e. 比較所述第一細胞群體的共振譜與所述第二細胞群體的共振譜以測定哪些共振是 差異表達的，其中差異表達的共振提供代表差異表達的代謝物的共振標記。
15. 權利要求14的方法，其中所述多維NMR包含下列任一種技術：光譜寬度折疊，隨機 相取樣，非均勻取樣，和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴展。
16. 權利要求14的方法，其中所述多維NMR包含任何組合的下列任何兩種技術：光譜 寬度折疊，隨機相取樣，非均勻取樣，和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴展。
17. 權利要求14的方法，其中所述多維NMR包含任何組合的下列任何三種技術：光譜 寬度折疊，隨機相取樣，非均勻取樣，和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴展。
18. 權利要求14的方法，其中所述多維NMR包含下列所有四種技術：光譜寬度折疊，隨 機相取樣，非均勻取樣，和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴展。
19. 權利要求14的方法，其中用穩(wěn)定同位素標記所述底物，并且所述多維NMR包含任何 組合的下列任何兩種技術：光譜寬度折疊，隨機相取樣，非均勻取樣，和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù) 重建的數(shù)據(jù)擴展。
20. 權利要求14的方法，其中用穩(wěn)定同位素標記所述底物，并且所述多維NMR包含非均 勻取樣和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴展。
21. 權利要求14的方法，其中用穩(wěn)定同位素標記所述底物，并且所述多維NMR包含隨機 相取樣，非均勻取樣，和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù)擴展。
22. 權利要求14的方法，其中用穩(wěn)定同位素標記所述底物，并且所述多維NMR包含所有 下列四種技術：光譜寬度折疊，隨機相取樣，非均勻取樣，和增強動態(tài)范圍數(shù)據(jù)重建的數(shù)據(jù) 擴展。
23. 權利要求14的方法，其中沒有將存在于所述樣品中的所述底物代謝物與所述樣品 中的其他分子分開。
24. 權利要求14-23中任一項的方法，其中在與經(jīng)NMR穩(wěn)定同位素標記的底物一起加載 細胞前將每個細胞群體內(nèi)的底物濃度降低一段時間。
25. 權利要求14-23中任一項的方法，其中使用下列任一種或多種測定經(jīng)標記底物的 代謝物的共振：定制NMR絕熱脈沖程序，定制采集技術（custom acquisition technique), 和定制NMR分析和過濾程序。
26. 權利要求14-23中任一項的方法，其中每個細胞群體內(nèi)的細胞數(shù)目小于2 X 106。
27. 權利要求14-23中任一項的方法，其中所述第一細胞群體和第二細胞群體是原代 細胞群體。
28. 權利要求14-23中任一項的方法，其中所述第一細胞群體和第二細胞群體之每種 中的細胞群體是異質(zhì)細胞群體，或是同質(zhì)細胞群體。
29. 權利要求14-23中任一項的方法，其進一步包括比較步驟（e)的共振標記與已知共 振標記的數(shù)據(jù)庫以測定所述共振標記代表的分子結構，由此測定所述第一和第二細胞群體 之間差異表達的底物代謝物。
30. 權利要求14-23中任一項的方法，其進一步包括鑒定底物代謝物生成中牽涉的生 物合成途徑，并鑒定途徑中可以被靶向以調(diào)控所述代謝物的差異表達，由此調(diào)控細胞表型 的蛋白質(zhì)/酶。
31. 權利要求14-23中任一項的方法，其中所述第一細胞群體和所述第二細胞群體是 同基因群體。
32. 權利要求14-23中任一項的方法，其中所述第一細胞群體和所述第二細胞群體具 有不同表型。
33. 權利要求14-23中任一項的方法，其中所述第一細胞群體是對照細胞群體，且所述 第二細胞群體已經(jīng)與測試化合物或藥劑接觸。
34. 權利要求14-23中任一項的方法，其中使用所述方法鑒定在特定細胞類型中活性 過度或活性不足的代謝途徑。
35. 權利要求14-23中任一項的方法，其中所述方法進一步包括抑制或過表達所述第 二細胞群體中的基因，并且使用所述方法鑒定在細胞中過表達或抑制基因的代謝結果。
36. -種用于治療受試者中的癌癥的方法，該方法包括對有此需要的受試者施用N-酰 基神經(jīng)氨酸胞苷酰基（citidylyl)轉(zhuǎn)移酶（CMAS)抑制劑，或N-乙酰神經(jīng)氨酸合酶（NANS) 抑制劑，或降低N-乙酰神經(jīng)氨酸表達的分子。
37. 權利要求36的方法，其中所述抑制劑選自下組：小分子，核糖核酸，脫氧核糖核酸， 蛋白質(zhì)，肽，和抗體。
38. 權利要求36的方法，其中所述抑制劑是酶。
【文檔編號】B01D59/44GK104220873SQ201380019199
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年2月11日 優(yōu)先權日:2012年2月10日
【發(fā)明者】E.M.奧戴, J.利伯曼, G.瓦格納 申請人:兒童醫(yī)療中心公司, 哈佛大學的校長及成員們