微點(diǎn)樣裝置制造方法
【專利摘要】提供用于將流體點(diǎn)樣到陣列的裝置和方法。還提供了通過這類方法生產(chǎn)的陣列。在本發(fā)明的一個(gè)方面，描述了用于將多個(gè)流體點(diǎn)樣到陣列中的點(diǎn)樣器裝置，點(diǎn)樣器裝置包括：以第一配置設(shè)置的多個(gè)儲(chǔ)存器，每個(gè)儲(chǔ)存器保持其各自的流體；具有以第二配置設(shè)置的多個(gè)位置的打印頭，所述第二配置不同于所述第一配置；多個(gè)管，每個(gè)管被配置為從管的第一端處的儲(chǔ)存器到所述管的第二端處的打印頭中的位置提供流體連通；以及泵，用于通過管將流體從儲(chǔ)存器泵送到打印頭。
【專利說明】微點(diǎn)樣裝置
[0001]政府利益
本發(fā)明是在通過美國國立衛(wèi)生研究院授予的許可N0.A1061611下的政府支持做出的。美國政府對于本發(fā)明具有某些權(quán)利。

【背景技術(shù)】
[0002]在美國、加拿大和西歐，傳染病導(dǎo)致約7%的人類死亡率，而在發(fā)展中地區(qū)，傳染病導(dǎo)致超過40%的人類死亡率。傳染病引起各種臨床表現(xiàn)。常見的明顯表現(xiàn)是發(fā)燒、肺炎、腦膜炎、腹瀉he腹瀉含血。盡管身體上的現(xiàn)象暗示一些病原體為致病因素并排除其他病原體，但仍存在各種可能的誘發(fā)性因素并且清楚的診斷通常需要執(zhí)行各種化驗(yàn)。用于診斷病原體的傳統(tǒng)微生物學(xué)技術(shù)可花費(fèi)數(shù)天或數(shù)周，常常延誤合適的治療過程。
[0003]近年來，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)已成為快速診斷傳染因素可選擇的方法。PCR可以是診斷傳染病的快速、靈敏和專用工具。使用PCR作為主要診斷手段的挑戰(zhàn)是可能的誘發(fā)性有機(jī)體的多樣性和存在于一些病理樣本中的有機(jī)體的低水平。通常不能進(jìn)行大組的PCR化驗(yàn)，對每一種可能的誘發(fā)性有機(jī)體進(jìn)行一個(gè)化驗(yàn)，其中大部分預(yù)期是陰性的。當(dāng)病原體核酸的濃度低并且需要大量樣本以收集充足的反應(yīng)模板時(shí)，問題加劇。在一些情形中，樣本不足以化驗(yàn)所有可能的致病因素。一種方案是進(jìn)行“多重PCR”，其中，在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)化驗(yàn)樣本的多個(gè)靶。盡管已經(jīng)證明多重PCR在一些系統(tǒng)中是有價(jià)值的，但在高水平多重反應(yīng)的魯棒性和難以清楚分析多種產(chǎn)物方面存在缺點(diǎn)。為了解決這些問題，化驗(yàn)可隨后被劃分為多個(gè)次要PCR。在主要產(chǎn)物中嵌入次要反應(yīng)會(huì)增加魯棒性。然而，這種進(jìn)一步處理可能是昂貴的并且可引起污染或其他問題。
[0004]本發(fā)明解決搬運(yùn)材料的各種問題，以進(jìn)行生物分析。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]在本發(fā)明的一個(gè)方面，描述了一種用于將多個(gè)流體點(diǎn)樣(spot)到陣列中的點(diǎn)樣器(spotter)裝置，所述點(diǎn)樣器裝置包括:被設(shè)置為第一配置的多個(gè)儲(chǔ)存器，每個(gè)儲(chǔ)存器保持其各自的流體；被設(shè)置為第二配置的具有多個(gè)位置的打印頭，第二配置與第一配置不同；多個(gè)管，每個(gè)管被配置為提供從管的第一端處的儲(chǔ)存器到管的第二端處的打印頭中的位置的流體連通；以及泵，用于通過管將流體從儲(chǔ)存器泵送到打印頭。本文描述了點(diǎn)樣器裝置、泵、打印頭和其他部件的配置的各種特征。
[0006]在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于打印具有處于一配置的多個(gè)井的陣列的方法。所述方法包括:將流體從多個(gè)儲(chǔ)存器同時(shí)泵送到打印頭上的多個(gè)位置，以在具有與陣列相同的配置的打印頭上形成多個(gè)滴；移動(dòng)陣列以與滴接觸；以及將每個(gè)相應(yīng)滴同時(shí)傳送到其各自的井中。還公開了通過這類方法制造的陣列。
[0007]在又一方面，提供一種用于將一個(gè)或多個(gè)液體傳送到多個(gè)井的預(yù)選定陣列中的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括:多個(gè)管，每個(gè)管具有與儲(chǔ)存器流體連通的第一端和終止于孔口中的第二端；多個(gè)儲(chǔ)存器，所述儲(chǔ)存器相對于彼此被設(shè)置為預(yù)定配置；打印頭，其能夠操作為可移動(dòng)地保持每個(gè)孔口處于預(yù)定位置，從而使得每個(gè)孔口的位置對應(yīng)于井的預(yù)選定陣列中的井；多個(gè)吸管，每個(gè)吸管具有將第一端連接到第二端的中空開口，該第一端流體連接到相應(yīng)的管的第一端并且該第二端與相應(yīng)的儲(chǔ)存器的底部可移除地接觸；以及計(jì)量供給裝置，其能夠操作為將預(yù)選定量的流體從每個(gè)吸管的第二端推動(dòng)通過其相應(yīng)的管并從其相應(yīng)的孔口出來。
[0008]對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，通過考慮例示目前被認(rèn)為是執(zhí)行本發(fā)明的最佳模式的優(yōu)選實(shí)施例的以下詳細(xì)描述，本發(fā)明的附加特征將變得顯而易見。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1示出根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的柔性袋。
[0010]圖2示出根據(jù)圖1的柔性袋的細(xì)胞溶解區(qū)的實(shí)施例。
[0011]圖2a示出與圖2所示的細(xì)胞溶解區(qū)相對應(yīng)的氣囊(bladder)的一部分的實(shí)施例。
[0012]圖2b示出根據(jù)圖1的具有替代性渦旋機(jī)構(gòu)的柔性袋的細(xì)胞溶解區(qū)的實(shí)施例。
[0013]圖3示出根據(jù)圖1的柔性袋的核酸制備區(qū)的實(shí)施例。
[0014]圖4示出根據(jù)圖1的柔性袋的第一級擴(kuò)增區(qū)的實(shí)施例。
[0015]圖5除了示出袋的替代性實(shí)施例之外與圖1類似。
[0016]圖5a是圖5的袋的配件的橫截面圖。
[0017]圖5b是圖5的袋的一部分的放大圖。
[0018]圖6是袋的另一替代性實(shí)施例的立體圖。
[0019]圖6a是圖6的袋的配件的橫截面圖。
[0020]圖7示出與圖6的袋一起使用的說明性氣囊部件。
[0021]圖8是與圖6的袋一起使用的儀器的分解立體圖，包括圖6的袋。
[0022]圖9示出圖8的儀器的局部橫截面圖，包括圖7的氣囊部件，以陰影示出圖6的袋。
[0023]圖10示出圖8的儀器的局部橫截面圖，包括用于夾閥的各個(gè)氣囊和圖6的袋。
[0024]圖11示出來自在圖5的袋中溶解和擴(kuò)增的樣本的第二級擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線(陽極對照；---釀酒酵母靶I ; 一(細(xì)實(shí)線)釀酒酵母靶2 ；-(粗實(shí)線)釀酒酵母靶3 ；-
-----粟酒裂殖酵母靶I ;----粟酒裂殖酵母靶2 ；陰性對照)。
[0025]圖12除了示出具有第二級高密度陣列的袋之外與圖6類似。
[0026]圖13示出圖8的儀器的部件的修改。支撐構(gòu)件已經(jīng)設(shè)置有配置為與圖12的袋一起使用的馬達(dá)。
[0027]圖14是圖12的第二級高密度陣列的分解立體圖。
[0028]圖15是圖12的第二級高密度陣列的仰視圖，示出處于第二級高密度陣列的構(gòu)造期間。
[0029]圖16示出類似于圖14-15所示陣列的部分地被構(gòu)造的高密度陣列，只是井的布置不同。
[0030]圖17示出移除了放置臂以允許觀察下面的細(xì)節(jié)的點(diǎn)樣器的立體圖。
[0031]圖18除了示出放置臂之外與圖17類似。
[0032]圖19是圖18的點(diǎn)樣器的一部分的右側(cè)視圖。
[0033]圖20是沿圖17中的線20-20的橫截面圖。
[0034]圖21是沿圖17中的線21-21的橫截面圖。
[0035]圖22是圖17的打印頭的仰視圖，示出了 96個(gè)足量滴。
[0036]圖23除了僅示出76個(gè)滴之外與圖22類似。
[0037]圖24是圖18的點(diǎn)樣器的右側(cè)視圖，示出了放置臂的細(xì)節(jié)。
[0038]圖25除了放置臂已移動(dòng)陣列以與打印頭接觸之外與圖24類似。
[0039]圖26是點(diǎn)樣器系統(tǒng)的不意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0040]本文描述的獨(dú)立的(self-contained)核酸分析袋可用于化驗(yàn)樣本中存在的各種生物物質(zhì)，例如抗原和核酸序列，例如在單個(gè)封閉系統(tǒng)中。在一個(gè)實(shí)施例中，袋用于化驗(yàn)多種抗原。說明性地，在選擇性地可用完即棄的袋中執(zhí)行各個(gè)步驟，包括核酸制備、初級大體積多重PCR、稀釋初級擴(kuò)增產(chǎn)物以及次級PCR，最后進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測和/或后擴(kuò)增分析，諸如熔解曲線分析。然而，應(yīng)該理解，抗原檢測是一個(gè)示例性用途并且袋可用于其他核酸分析或檢測其他物質(zhì)，包括但不限于多肽類、毒素和小分子。此外，應(yīng)該理解，可在本發(fā)明的袋中執(zhí)行各個(gè)步驟，但對于某些用途可省略一個(gè)或多個(gè)步驟，并且可相應(yīng)地改變袋配置。
[0041 ] 盡管PCR是本文的例子中所使用的擴(kuò)增方法,但是應(yīng)該理解,使用引物的任何擴(kuò)增方法都可能是合適的。這類合適的過程包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR);鏈置換擴(kuò)增(SDA);核酸序列基擴(kuò)增(NASBA);級聯(lián)滾環(huán)擴(kuò)增(CRCA) ；DNA的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP);核酸的等溫和嵌合體(chimeric)引物起始擴(kuò)增(ICAN);基于祀的依賴解旋酶的擴(kuò)增(HDA);轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)等。因此，當(dāng)使用術(shù)語PCR時(shí)，應(yīng)該理解包括其他替代性擴(kuò)增方法。應(yīng)該理解，可能需要相應(yīng)地調(diào)整規(guī)程。
[0042]圖1示出了說明性的獨(dú)立式核酸分析袋10。袋10具有細(xì)胞溶解區(qū)20、核酸制備區(qū)40、第一級擴(kuò)增區(qū)60和第二級擴(kuò)增區(qū)80。含核酸的樣本經(jīng)由樣本注射端口 12被引入袋10。袋10包括不同尺寸的各種通道和泡形罩(blister)并且被布置為使得樣本流過系統(tǒng)。樣本穿過各個(gè)區(qū)并因此被處理。
[0043]樣本處理發(fā)生在位于袋10內(nèi)的各種泡形罩中。各種通道被設(shè)置用以在處理區(qū)內(nèi)和處理區(qū)之間移動(dòng)樣本，而其他通道被設(shè)置用以將流體和試劑傳送到樣本或從樣本移除這類流體和試劑。說明性地，袋10內(nèi)的液體通過壓力(例如氣動(dòng)壓力)在泡形罩之間移動(dòng)，如下所述，但也可考慮在袋內(nèi)移動(dòng)材料的其他方法。
[0044]盡管可以使用其他容器，但是說明性地，袋10由兩層柔性塑料薄膜或其他柔性材料(諸如，聚酯、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚碳酸酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯及其混合物)形成，所述材料可通過本領(lǐng)域已知的任何過程制造，包括擠出、等離子體沉積和層壓。也可以使用金屬箔或具有鋁層壓結(jié)構(gòu)(laminat1n)的塑料。其他屏障材料是本領(lǐng)域已知的，并且能夠密封在一起以形成泡形罩和通道。如果使用塑料薄膜，則層可被粘合在一起，說明性地，通過熱密封。說明性地，材料具有低核酸結(jié)合能力。
[0045]對于采用熒光監(jiān)測的實(shí)施例，優(yōu)選在操作波長下吸收率足夠低并且自發(fā)熒光的塑料薄膜。這種材料可通過嘗試不同的塑料、不同的塑化劑和合成比例以及不同的薄膜厚度來識別。對于具有鋁或其他箔層壓結(jié)構(gòu)的塑料，可使被熒光檢測裝置讀取的袋部分沒有箔。例如，如果在袋10的第二級擴(kuò)增區(qū)80的泡形罩82中監(jiān)測熒光，則將使泡形罩82處的一層或兩層不具有箔。在PCR的例子中，由約0.0048英寸(0.1219mm)厚的聚酯(Mylar, Dupont,Wilmington DE)和0.001-0.003英寸(0.025-0.076mm)厚的聚丙烯薄膜構(gòu)成的薄膜層壓件執(zhí)行良好。說明性地，袋10由能夠傳輸約80%-90%的入射光的透明材料制成。
[0046]在說明性實(shí)施例中，通過在泡形罩和通道上施加壓力(例如氣動(dòng)壓力)，在泡形罩之間移動(dòng)材料。因此，在采用氣動(dòng)壓力的實(shí)施例中，說明性地，袋材料的柔性足夠大，以允許氣動(dòng)壓力具有期望效果。術(shù)語“柔性”在此用于描述袋材料的物理特性。術(shù)語“柔性”在此被定義為通過在此使用的氣動(dòng)壓力的水平可容易地變形，而不會(huì)開裂、破碎、龜裂等。例如，薄塑料片(諸如Saran ?包裹膜和Ziploc?袋)和薄金屬箔(諸如鋁箔)是柔性的。然而，僅泡形罩和通道的某些區(qū)域需要是柔性的，即使在采用氣動(dòng)壓力的實(shí)施例中。此外，僅泡形罩和通道的一側(cè)需要是柔性的，只要泡形罩和通道容易變形。袋10的其他區(qū)域可由剛性材料制成或可以利用剛性材料加強(qiáng)。
[0047]說明性地，塑料薄膜被用于袋10。可銑削或以其他方式切割金屬片(例如鋁)或其他合適的材料，以產(chǎn)生具有上凸表面圖案的模具。當(dāng)被配合到氣動(dòng)壓力機(jī)(例如，A-5302-PDS, Janesville Tool Inc., Milton WI)中時(shí)，說明性地被調(diào)節(jié)處于 195°C 的操作溫度，氣動(dòng)壓力機(jī)用作印刷機(jī)，僅在模具與薄膜接觸處熔化塑料薄膜的密封表面。在形成袋10時(shí)，各種部件，諸如PCR引物(說明性地被點(diǎn)樣到薄膜上并干燥)、抗原結(jié)合基質(zhì)、磁珠和硅酸鋯珠，可被密封在各種泡形罩內(nèi)。用于樣品處理的試劑可在密封之前共同地或單獨(dú)地被點(diǎn)樣到薄膜上。在一個(gè)實(shí)施例中，核苷三磷酸(NTP)與聚合酶和引物相分離地被點(diǎn)樣到薄膜上，基本上消除聚合酶的活性，直到通過含水樣本進(jìn)行水合反應(yīng)。如果在水合作用之前含水樣本已被加熱，則這為真正的熱啟動(dòng)PCR提供條件并且降低或消除對昂貴的化學(xué)熱啟動(dòng)成分的需求。下面參照圖5b進(jìn)一步論述這種單獨(dú)點(diǎn)樣，但是應(yīng)該理解，這種點(diǎn)樣可與本文論述的任何實(shí)施例一起使用。
[0048]當(dāng)氣動(dòng)壓力用于移動(dòng)袋10中的材料時(shí)，在一個(gè)實(shí)施例中可采用“氣囊”。氣囊組件710 (其一部分在圖2a中示出)可在類似于袋制造過程的過程中制造，但氣囊組件710中的各個(gè)泡形罩包括氣動(dòng)配件(例如配件724a),該氣動(dòng)配件允許通過壓縮氣體源為氣囊組件710中的各個(gè)氣囊加壓。由于氣囊組件經(jīng)受壓縮氣體并且可使用多次，因此氣囊組件可由比袋堅(jiān)韌或厚的材料制成。替代性地，氣囊可由利用墊圈、密封件、閥門和活塞緊固在一起的一系列板形成。其他布置也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0049]當(dāng)袋10被放置在儀器內(nèi)時(shí)，氣動(dòng)氣囊組件710壓靠袋10的一個(gè)面，從而如果特定氣囊充氣，則壓力將迫使液體從袋10中的相應(yīng)泡形罩中流出。除了與袋10的許多泡形罩相對應(yīng)的氣動(dòng)氣囊之外，氣囊組件可具有對應(yīng)于袋10的各種通道的額外氣動(dòng)致動(dòng)器，諸如氣囊或氣動(dòng)驅(qū)動(dòng)的活塞。當(dāng)啟用時(shí)，這些額外的氣動(dòng)致動(dòng)器形成夾閥(pinch valve)以阻斷和關(guān)閉相應(yīng)的通道。為了將液體約束在袋10的特定泡形罩內(nèi)，可在通向和來自泡形罩的通道上方對夾閥氣動(dòng)致動(dòng)器充氣，從而使得致動(dòng)器用作夾閥以夾閉通道。說明性地，為了混合不同泡形罩中的兩個(gè)液體體積，使密封連接通道的夾閥氣動(dòng)致動(dòng)器減壓，并且交替地為泡形罩上方的氣動(dòng)氣囊加壓，迫使液體來回通過連接泡形罩的通道以混合其中的液體。夾閥氣動(dòng)致動(dòng)器可具有各種形狀和尺寸并且可被配置為一次阻斷多于一個(gè)通道。在圖1中這種說明性夾閥被示出為夾閥16，其可用于關(guān)閉所有注射端口。雖然在此論述了氣動(dòng)致動(dòng)器，但應(yīng)該理解，可考慮為袋提供壓力的其他方式，包括各種機(jī)電致動(dòng)器，諸如直線步進(jìn)電機(jī)、馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的凸輪、氣動(dòng)驅(qū)動(dòng)的剛性槳葉、液壓或電磁力、輥、搖臂以及(在一些情形中)翹起的彈簧。此外，除了垂直于通道的軸線施加壓力之外，還有各種可逆或不可逆地關(guān)閉通道的方法。這些方法包括橫跨通道扭結(jié)袋、熱密封、滾動(dòng)致動(dòng)器以及被密封到通道中的各種物理閥，諸如蝶閥和球閥。此外，小的珀?duì)柼b置或其他溫度調(diào)節(jié)器可被放置在通道附近并被設(shè)定在足以凍結(jié)流體的溫度，有效地形成密封。此外，盡管圖1的設(shè)計(jì)適于以將致動(dòng)器元件放置在泡形罩和通道中的每個(gè)上方為特征的自動(dòng)化儀器，但還可考慮致動(dòng)器可保持靜止，并且袋可在一個(gè)或兩個(gè)維度中過渡，從而使得較少數(shù)量的致動(dòng)器可用于若干處理站，包括樣本破裂、核酸俘獲、第一級和第二級PCR以及其他袋應(yīng)用，諸如免疫測定和免疫PCR。作用在通道和泡形罩上的輥能夠證明在袋在站之間轉(zhuǎn)移的配置中尤其有用。因此，盡管在目前公開的實(shí)施例中使用氣動(dòng)致動(dòng)器，但當(dāng)在本文中使用“氣動(dòng)致動(dòng)器”時(shí)，應(yīng)該理解，根據(jù)袋和儀器的配置可使用其他致動(dòng)器和其他提供壓力的方式。
[0050]參照圖1，提供了被配置用于核酸提取和多重PCR的說明性樣本袋10。樣本經(jīng)由配件90中的樣本注射端口 12進(jìn)入袋10。注射端口 12可以是易破密封件、單向閥或其他入口端口。來自袋10內(nèi)的真空可用于將樣本抽入袋10中，注射器或其他壓力結(jié)構(gòu)可用于迫使樣本進(jìn)入袋10，或者可使用經(jīng)由注射端口 12將樣本引入袋10中的其他裝置。樣本經(jīng)由通道14行進(jìn)到細(xì)胞溶解區(qū)20的三瓣式泡形罩22，在其中溶解樣本中的細(xì)胞。一旦樣本進(jìn)入三瓣式泡形罩22，就關(guān)閉夾閥16。與可能已經(jīng)關(guān)閉的夾閥36 —起，夾閥16的閉合將樣本密封在三瓣式泡形罩22中。應(yīng)該理解，不是每個(gè)樣本都需要進(jìn)行細(xì)胞溶解。對于這類樣本，可省略細(xì)胞溶解區(qū)或可將樣本直接移動(dòng)到下一區(qū)。然而，許多樣本需要進(jìn)行細(xì)胞溶解。在一個(gè)實(shí)施例中，珠銑削法用于溶解細(xì)胞。
[0051]通過在存在諸如硅酸鋯(ZS)珠34的溶解顆粒的情況下?lián)u晃或渦旋樣本的珠銑削法(bead-milling)是形成溶解產(chǎn)物的有效方法。應(yīng)該理解，如在此使用的，諸如“溶解”、“溶解的”和“溶解產(chǎn)物”的術(shù)語不限于使細(xì)胞破裂，而是這類術(shù)語包括破壞非細(xì)胞微粒，諸如病毒。圖2顯示細(xì)胞溶解區(qū)20的一個(gè)實(shí)施例，其中，會(huì)聚流產(chǎn)生高速珠沖擊，以產(chǎn)生溶解產(chǎn)物。說明性地，三瓣式泡形罩22的兩個(gè)下瓣24、26經(jīng)由通道30連接，并且上瓣28在通道30的相對側(cè)31處連接到下瓣24、26。圖2a示出氣囊組件710的對應(yīng)部分，該對應(yīng)部分將與袋10的細(xì)胞溶解區(qū)20接觸。當(dāng)袋10被放置在儀器中時(shí)，泡形罩組件710中的相應(yīng)氣動(dòng)氣囊724、726、728與袋10的每個(gè)瓣24、26、28相鄰。應(yīng)該理解，當(dāng)涉及袋中的泡形罩或通道與其相應(yīng)的氣動(dòng)致動(dòng)器之間的關(guān)系時(shí)，術(shù)語“相鄰”指的是當(dāng)袋被放置在儀器中時(shí)泡形罩或通道與相應(yīng)的氣動(dòng)致動(dòng)器之間的關(guān)系。在一個(gè)實(shí)施例中，與下瓣24、26相鄰的兩個(gè)下氣動(dòng)氣囊724、726的氣動(dòng)配件724a、726a接通(plumb)在一起。氣動(dòng)配件724a、726a和與上瓣28相鄰的上氣動(dòng)氣囊728的氣動(dòng)配件728a接通到被配置為驅(qū)動(dòng)雙動(dòng)氣動(dòng)氣缸的電致動(dòng)閥的相對側(cè)。通過這樣配置，壓力在上氣動(dòng)氣囊728和兩個(gè)下氣動(dòng)氣囊724、726之間交替。當(dāng)來回切換閥時(shí)，袋10中的液體通過通道30中的窄連結(jié)點(diǎn)(nexus) 32在下瓣24、26和上瓣28之間被驅(qū)動(dòng)。當(dāng)同時(shí)對兩個(gè)下瓣24、26加壓時(shí)，流會(huì)聚并噴射到上瓣28中。根據(jù)瓣的幾何形狀，連結(jié)點(diǎn)32處珠34的碰撞速度可以為至少約12m/sec，提供導(dǎo)致溶解的高沖擊碰撞。說明性的三瓣式系統(tǒng)允許良好的細(xì)胞破裂和結(jié)構(gòu)魯棒性，同時(shí)最小化尺寸和氣動(dòng)氣體消耗。盡管ZS珠被用作溶解顆粒，但是應(yīng)該理解，此選擇僅是說明性的，并且可使用其他材料和其他形狀的顆粒。還應(yīng)該理解，其他配置的細(xì)胞溶解區(qū)20在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0052]盡管三瓣式泡形罩被用于細(xì)胞溶解，但是應(yīng)該理解，其他多瓣式配置在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可以使用四瓣式泡形罩，例如四葉式交叉圖案的泡形罩，其中，對相對的泡形罩同時(shí)加壓，朝向彼此推進(jìn)溶解顆粒，然后斜向移動(dòng)到另兩個(gè)瓣，然后可同時(shí)對這另兩個(gè)瓣加壓。這種四瓣式泡形罩的優(yōu)點(diǎn)是具有沿兩個(gè)方向的高速?zèng)_擊。此外，可以考慮使用單瓣式泡形罩，其中，溶解顆粒從單瓣式泡形罩的一部分快速移動(dòng)到另一部分。例如，氣動(dòng)致動(dòng)器可用于關(guān)閉單瓣式泡形罩的一些區(qū)域，在其余區(qū)域中暫時(shí)形成多瓣式泡形罩。還可以使用其他致動(dòng)方法，諸如馬達(dá)、氣動(dòng)、液壓或電磁驅(qū)動(dòng)的槳葉作用在裝置的瓣上。輥或旋轉(zhuǎn)槳葉可用于在圖2的連結(jié)點(diǎn)32處將流體驅(qū)動(dòng)到一起，例如如果在上和下瓣之間設(shè)置再循環(huán)裝置并且致動(dòng)器提供蠕動(dòng)式泵送作用。其他配置在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0053]在不臨時(shí)形成多瓣式泡形罩的情況下，也可在單瓣式溶解泡形罩內(nèi)足夠快地移動(dòng)樣本和溶解顆粒以實(shí)現(xiàn)溶解。在一個(gè)這種替代性實(shí)施例中，如圖2b所示，通過經(jīng)由旋轉(zhuǎn)附接到電動(dòng)馬達(dá)19的葉片或槳葉21來沖擊袋可實(shí)現(xiàn)渦流。葉片21可在溶解泡形罩處沖擊袋或者可在溶解泡形罩附近沖擊袋，例如在臨近溶解泡形罩的邊緣17處。在這種實(shí)施例中，溶解泡形罩可包括一個(gè)或多個(gè)泡形罩。圖12示出包括一個(gè)這種泡形罩522的實(shí)施例。圖13示出包括葉片21的珠敲擊馬達(dá)19，葉片21可被安裝在圖8所示的儀器800的第二支撐構(gòu)件804的第一側(cè)811上。然而應(yīng)該理解，馬達(dá)19可被安裝在第一支撐構(gòu)件802或儀器800的其他結(jié)構(gòu)上。
[0054]圖2a還示出了具有氣動(dòng)配件716a的氣動(dòng)氣囊716和具有氣動(dòng)配件736a的氣動(dòng)配件736。當(dāng)袋10被放置為與氣囊組件710接觸時(shí)，氣囊716與通道12對齊，以使夾閥16完整。類似地，氣囊736與通道38對齊，以使夾閥36完整。氣動(dòng)氣囊716和736的操作允許打開和關(guān)閉夾閥16和36。盡管僅示出了氣囊組件710的與細(xì)胞溶解區(qū)相鄰的部分，但是應(yīng)該理解，氣囊組件710可設(shè)置有與氣動(dòng)泡形罩類似的裝置，以控制遍布袋10的其余區(qū)域的流體的移動(dòng)。
[0055]其他現(xiàn)有技術(shù)儀器在密封的柔性容器內(nèi)教導(dǎo)PCR。見例如美國專利N0.6，645，758和N0.6, 780,617以及共同待決的美國專利申請N0.10/478，453，其通過引用合并于此。然而，在密封的PCR器皿中進(jìn)行細(xì)胞溶解可提高使用容易度和安全性，尤其是當(dāng)待測試樣本可能含有有害生物物質(zhì)時(shí)。在本文所示的實(shí)施例中，來自細(xì)胞溶解的廢物以及來自所有其他步驟的廢物保留在密封袋內(nèi)。然而，應(yīng)該理解，可以移除袋內(nèi)容物，以便進(jìn)行進(jìn)一步測試。
[0056]一旦細(xì)胞溶解，就打開夾閥36并通過通道38將溶解產(chǎn)物移動(dòng)到核酸制備區(qū)40，如圖3所最佳示出的，之后，關(guān)閉夾閥36，將樣本密封在核酸制備區(qū)40中。在圖3所示的實(shí)施例中，核酸的提純采用經(jīng)珠銑削的材料并利用與基于二氧化硅的磁珠56結(jié)合的親和性，利用乙醇沖洗珠并利用水或其他流體洗提核酸，以從細(xì)胞溶解產(chǎn)物提純核酸。核酸提取所需的各個(gè)成分說明性地位于泡形罩44、46、48中，通過通道45、47、49連接泡形罩以允許試劑混合。溶解產(chǎn)物從通道38進(jìn)入泡形罩44。泡形罩44可設(shè)置有磁珠56和合適的結(jié)合緩沖液，例如高鹽緩沖液，諸如 1_2_3 ? Sample Preparat1n Kit (Idaho Technology, SaltLake City, UT)緩沖液，或者可通過連接到泡形罩44的一個(gè)或多個(gè)通道隨后提供這些成分之一或兩者。核酸被俘獲在珠56上，然后打開夾閥53，并且溶解產(chǎn)物和珠56可通過在泡形罩44和58上交替地作用輕柔的壓力而被混合，然后經(jīng)由例如由氣囊組件710上的相應(yīng)氣動(dòng)氣囊提供的氣動(dòng)壓力移動(dòng)到泡形罩58。通過可收縮磁體50將磁珠56俘獲在泡形罩58中，可收縮磁體50位于與泡形罩58相鄰的儀器中，并且通過向泡形罩58施加壓力可將廢物移動(dòng)到廢物儲(chǔ)存器或可返回泡形罩44。然后關(guān)閉夾閥53。當(dāng)釋放夾閥55時(shí)，利用從泡形罩46提供的乙醇、異丙醇或其他有機(jī)或無機(jī)沖洗溶液沖洗磁珠56?？蛇x地，磁體50可收縮，允許通過在泡形罩46和58上提供交替的壓力來沖洗珠。通過磁體50再次將珠56俘獲在泡形罩58中，并且溶解產(chǎn)物的非核酸部分從珠56被沖洗掉并且可返回泡形罩46，并通過夾閥55被固定或者可以經(jīng)由另一通道被沖洗到廢物儲(chǔ)存器。一旦磁珠被沖洗，就打開夾閥57，從泡形罩48釋放水(例如緩沖水)或另一種核酸洗提液。再次地，磁體50可收縮以允許最大程度地混合水和珠56，例如通過在泡形罩48和58上提供交替的壓力。磁體50再次伸展以收集珠56。釋放夾閥59，并且經(jīng)洗提的核酸經(jīng)由通道52移動(dòng)到第一級擴(kuò)增區(qū)60。然后關(guān)閉夾閥59，由此將樣本固定在第一級擴(kuò)增區(qū)60。
[0057]應(yīng)該理解，如圖3所示和如上所述的核酸制備區(qū)40的配置僅是說明性的，并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)存在各種其他配置。
[0058]在此使用的乙醇、水和其他流體可通過各種方式提供到泡形罩。流體可存儲(chǔ)在泡形罩中，泡形罩的頸部可被各種夾閥或易破部分阻斷，易破部分可在樣本制備順序中的合適時(shí)間打開。替代性地，流體可存儲(chǔ)在袋(如圖5所示的袋110)中的儲(chǔ)存器中，或存儲(chǔ)在參照圖6的袋210所論述的配件中，必要時(shí)經(jīng)由通道移動(dòng)。在另一實(shí)施例中，可從外部源引入流體，如圖1所示,特別地對于乙醇注射端口 41、88和柱塞67、68、69。說明性地，由更硬材料制成的柱塞67、68、69可插入配件90，并且在啟用柱塞時(shí)可提供測定量的流體，如在通過引用合并于此的美國專利8，409，508中一樣。替代性地，柱塞可以是較軟材料并且配件可以是更硬材料。對于每個(gè)柱塞，測定量可以相同或不同。最后，在另一實(shí)施例中，袋可設(shè)置有存儲(chǔ)在一個(gè)或多個(gè)泡形罩中的測定量的流體，其中，流體被容納在泡形罩中，例如被設(shè)置在泡形罩內(nèi)的小密封袋中，在泡形罩內(nèi)有效地泡形罩。在合適的時(shí)刻，可使密封袋破裂，例如通過氣動(dòng)壓力，由此將流體釋放到袋的泡形罩中。儀器還可被配置為直接通過儀器和配件或袋材料之間的液體接觸來提供一些或所有試劑，只要經(jīng)由單向閥封閉地調(diào)節(jié)流體通道以防止儀器在運(yùn)行期間被污染。此外，通常期望在操作之后密封袋或其配件以阻止污染的DNA從袋中逸出。已知各種根據(jù)需要提供試劑的裝置，諸如注射器泵，并且已知各種與配件或袋暫時(shí)流體接觸的裝置，諸如有倒鉤的配件或O型圈密封件。應(yīng)該理解，如特定應(yīng)用的需要所確定的，將流體引入合適的泡形罩的這些方法中的任何方法都可與在此論述的袋的實(shí)施例中的任何實(shí)施例一起使用。
[0059]如上所述，巢式(nested) PCR涉及以兩個(gè)級進(jìn)行的靶擴(kuò)增。在第一級，擴(kuò)增靶，例如從基因組(genomic)或逆轉(zhuǎn)錄模板(reverse-transcribed template)。根據(jù)需要,可在平穩(wěn)階段之前終止第一級擴(kuò)增。在第二反應(yīng)中，第一級的擴(kuò)增子(amplicon)可被稀釋，并且次級擴(kuò)增使用相同的引物或例如使用混雜到第一級產(chǎn)物的引物內(nèi)部的巢式引物。巢式PCR的優(yōu)點(diǎn)包括:a)初始反應(yīng)產(chǎn)物形成均勻的特異性(specific)模板,確保第二反應(yīng)中的高保真度，其中，即使相對低效的第一級反應(yīng)也可產(chǎn)生合適的模板來支持穩(wěn)健的第二級反應(yīng)山)來自第一級反應(yīng)的非特異性產(chǎn)物不會(huì)明顯干擾第二級反應(yīng)，因?yàn)槭褂貌煌某彩揭锊⑶页跏紨U(kuò)增模板(例如，基因組DNA或逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)可被稀釋到消除其在第二擴(kuò)增中的意義的程度；以及c)巢式PCR使得可進(jìn)行更高階反應(yīng)復(fù)用。第一級反應(yīng)可包括用于若干唯一擴(kuò)增產(chǎn)物的引物。然后在第二級反應(yīng)中識別這些產(chǎn)物。然而，應(yīng)該理解，第一級多重反應(yīng)和第二級單重反應(yīng)僅是說明性的，并且其他配置也可行。例如，第一級可利用單對引物擴(kuò)增各種不同的相關(guān)擴(kuò)增子，并且第二級可用于以擴(kuò)增子之間的區(qū)別為目標(biāo)，例如利用熔解曲線分析。
[0060]返回圖1，核酸樣本經(jīng)由通道52進(jìn)入第一級擴(kuò)增區(qū)60并被傳送到泡形罩61。包括聚合酶(例如Taq聚合酶)、dNTP和引物(例如用于多重?cái)U(kuò)增的多對引物)的PCR混合物可被設(shè)置在泡形罩61中或可如上所述地經(jīng)由各種裝置被引入泡形罩61中。替代性地，干燥的試劑可在組裝袋10時(shí)被點(diǎn)樣到袋10上的位置，并且水或緩沖液可被引入泡形罩61，例如經(jīng)由柱塞68，如圖1所示。如圖4最佳示出的，現(xiàn)在樣本被夾閥59和72固定在泡形罩61中，并且在兩個(gè)或多個(gè)溫度之間熱循環(huán)，例如通過位于儀器中并被配置為接觸泡形罩61的加熱塊或珀?duì)柼b置。然而，應(yīng)該理解，如本領(lǐng)域已知的，加熱和冷卻容納在泡形罩61內(nèi)的樣本的其他裝置在本發(fā)明的范圍內(nèi)。用于熱循環(huán)的替代性加熱/冷卻裝置的非限制性例子包括:在氣囊中設(shè)置空氣循環(huán)泡形罩，其中，與泡形罩61相鄰的氣動(dòng)泡形罩中的空氣在兩個(gè)或多個(gè)溫度之間循環(huán)；或者將樣本移動(dòng)到泡形罩61內(nèi)的溫度區(qū)，例如利用多個(gè)氣動(dòng)壓力機(jī)，如在通過引用合并于此的美國專利申請N0.10/478, 453中一樣，或者通過在軸線上平移袋10或通過為袋10設(shè)置旋轉(zhuǎn)布局并旋轉(zhuǎn)袋10以在固定溫度的熱區(qū)之間移動(dòng)內(nèi)容物。
[0061]來自病原體的核酸通常與大量宿主核酸分離。這些宿主衍生的核酸通常與引物相互作用，導(dǎo)致擴(kuò)增不期望的產(chǎn)物，此產(chǎn)物清除引物、dNTP和聚合酶活性，可能導(dǎo)致缺乏期望的資源產(chǎn)物。來自病原有機(jī)體的核酸通常數(shù)量低，并且不期望的產(chǎn)物是潛在問題?？蓛?yōu)化區(qū)60的第一級反應(yīng)中的循環(huán)數(shù)量，以最大化特異性產(chǎn)物并最小化非特異性產(chǎn)物。預(yù)期最佳的循環(huán)數(shù)量將在約10至約30個(gè)循環(huán)之間，例如在約15至約20個(gè)循環(huán)之間，但是應(yīng)該理解，可根據(jù)具體靶、宿主和弓I物順序改變循環(huán)數(shù)量。
[0062]在第一級多重?cái)U(kuò)增之后，在流體轉(zhuǎn)移到次級反應(yīng)位置之前，稀釋第一級擴(kuò)增產(chǎn)物，例如在不完全的PCR混合液(master mix)中。
[0063]圖4示出以三個(gè)步驟稀釋樣本的說明性實(shí)施例。在第一步驟中，打開夾閥72，并且通過將泡形罩61中的樣本與來自泡形罩62的等體積的水或稀釋液混合，樣本經(jīng)歷二倍稀釋，水或稀釋液被提供到泡形罩62，以及64和66，如上所述。在泡形罩61、62之間來回?cái)D壓體積提供徹底的混合。如上所述，可通過設(shè)置在氣囊710中并且與泡形罩61、62相鄰的氣動(dòng)氣囊提供混合?？山惶娴貙鈩?dòng)氣囊加壓，迫使液體來回移動(dòng)。在混合期間，夾閥74防止液體流入相鄰泡形罩。在混合結(jié)束時(shí)，在區(qū)域70俘獲一定量被稀釋的樣本，關(guān)閉夾閥72，將稀釋的樣本密封在區(qū)域70中。打開夾閥74，并且通過設(shè)置在泡形罩63、64之一或兩者中的水或緩沖液進(jìn)一步稀釋樣本。如上所述，在泡形罩63、64之間前后擠壓體積會(huì)提供混合。隨后，關(guān)閉夾閥74，將進(jìn)一步稀釋的一定量樣本密封在區(qū)域71中。說明性地，通過利用設(shè)置在泡形罩65、66之一或兩者中的緩沖液或水進(jìn)行最終稀釋，如上所述地混合。說明性地，利用不完全PCR混合液(例如，含有除引物之外的所有PCR試劑)作為流體進(jìn)行此最終稀釋。在第二級擴(kuò)增之前可選地加熱泡形罩66的內(nèi)容物可提供在不需要昂貴的抗體或酶的情況下進(jìn)行熱啟動(dòng)擴(kuò)增的益處。然而，應(yīng)該理解，最終稀釋可使用水或其他稀釋液，并且在第二級擴(kuò)增區(qū)80中提供額外的PCR成分。盡管說明性實(shí)施例使用三個(gè)稀釋級，但是應(yīng)該理解，可使用任何數(shù)量的稀釋級來提供合適水平的稀釋。應(yīng)該理解，通過調(diào)整區(qū)域70和71中俘獲的樣本量可控制稀釋量，其中，在區(qū)域70和71中俘獲的樣本量越少，稀釋量越大，或者其中，通過重復(fù)打開和關(guān)閉夾閥72和74和/或夾閥74和76而在區(qū)域70和/或區(qū)域71中俘獲的額外等份可用于減少稀釋量。預(yù)期約10_2至約10 _5的稀釋液適用于許多應(yīng)用。
[0064]次級PCR反應(yīng)的成功取決于多重第一級反應(yīng)產(chǎn)生的模板。通常，利用高純度DNA執(zhí)行PCR。諸如酚提取的方法或商業(yè)DNA提取包提供高純度DNA。通過袋10處理的樣本可能需要進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)節(jié)以補(bǔ)償較低純度的制備物。生物樣本的成分可抑制PCR，這是潛在的障礙。說明性地，熱啟動(dòng)PCR、較高濃度的taq聚合酶、調(diào)整MgCl2濃度、調(diào)整引物濃度以及添加輔助物(諸如DMSO、TMSO或甘油)可擇地可以用于補(bǔ)償較低的核酸純度。盡管第一級擴(kuò)增可能更關(guān)注純度問題，但是應(yīng)該理解，在第二級擴(kuò)增中也可進(jìn)行類似調(diào)整。
[0065]盡管在說明性實(shí)施例中通過將少量擴(kuò)增樣本保留在袋的第一級PCR部分的泡形罩和通道中來完成稀釋和第二級樣本制備，但是應(yīng)該理解，也可以通過其他方式執(zhí)行這些過程。在一個(gè)這種說明性例子中，預(yù)擴(kuò)增樣本可被俘獲在能夠?qū)⒐潭康臉颖緩牡谝患塒CR試劑移動(dòng)到第二級PCR試劑的構(gòu)件(例如平移或旋轉(zhuǎn)構(gòu)件)的小腔中。一微升份的預(yù)擴(kuò)增樣本與100微升新鮮PCR試劑混合將致使?jié)舛葴p小100倍。應(yīng)該理解，此稀釋僅是示例性的，并且其他體積和稀釋水平是可行的。此方法可通過迫使第一級擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入剛性配件來實(shí)現(xiàn)，第一級擴(kuò)增產(chǎn)物在其中與圖1的柱塞68或69之一接觸。在這種實(shí)施例中，柱塞將被配置為運(yùn)載一小部分樣本以與相鄰稀釋緩沖液或第二級PCR緩沖液接觸。類似地，滑動(dòng)元件可用于運(yùn)載少量第一級擴(kuò)增產(chǎn)物以與第二級反應(yīng)混合物接觸，同時(shí)保持各級之間的密封,并且將擴(kuò)增樣本容納在剛性配件90內(nèi)。
[0066]在第一級PCR和稀釋之后，通道78將樣本轉(zhuǎn)移到多個(gè)小體積泡形罩82，以便進(jìn)行次級巢式PCR。在一個(gè)說明性實(shí)施例中，在第二級泡形罩中提供的干燥引物通過進(jìn)入的含水材料再懸浮，以完成反應(yīng)混合?？蛇x擇地，用于檢測雙鏈核酸的熒光染料，諸如LCGreen?Plus (Idaho Technology, Salt Lake City, UT),可被設(shè)置在每個(gè)泡形罩中或者可被添加到在連續(xù)稀釋結(jié)束時(shí)提供的不完全PCR混合液中，但是應(yīng)該理解，LCGreen? Plus僅是說明性的，并且如本領(lǐng)域已知的可使用其他染料。在另一可選實(shí)施例中，被配置為用于每個(gè)特異性擴(kuò)增子的干燥熒光標(biāo)記低聚核苷酸探針可與各個(gè)干燥引物一起被設(shè)置在每個(gè)相應(yīng)第二級泡形罩中。此外，盡管袋10被設(shè)計(jì)為在其中容納所有反應(yīng)和操作，以減少污染，但在一些情況中，可能期望從每個(gè)泡形罩82移除擴(kuò)增產(chǎn)物以進(jìn)行進(jìn)一步分析。本領(lǐng)域已知的用于檢測第二級擴(kuò)增子的其他手段在本發(fā)明的范圍內(nèi)。一旦樣本被轉(zhuǎn)移到泡形罩82，就啟用夾閥84和86以關(guān)閉泡形罩82?，F(xiàn)在每個(gè)泡形罩82容納擴(kuò)增特定靶所需的所有試劑。說明性地，每個(gè)泡形罩可容納唯一一對引物，或者多個(gè)泡形罩82可容納相同引物以提供許多復(fù)制的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0067]可以注意到，在此公開的實(shí)施例使用泡形罩進(jìn)行第二級擴(kuò)增，其中，泡形罩由與柔性部分的其余部分相同或類似的塑料薄膜形成。然而，在許多實(shí)施例中，從未從第二級泡形罩移除第二級泡形罩的內(nèi)容物，并且因此，不需要在柔性泡形罩中發(fā)生第二級反應(yīng)。應(yīng)該理解，第二級反應(yīng)可在與泡形罩流體連接的多個(gè)剛性、半剛性或柔性腔中發(fā)生。腔可被密封，如在本例子中通過在連接腔的柔性通道上施加壓力，或者可以用其他方式密封，例如通過加熱密封或利用單向閥。在此論述的各個(gè)實(shí)施例包括單獨(dú)設(shè)置用于收集廢物的泡形罩。由于從未移除廢物，因此可將廢物收集在剛性、半剛性或柔性腔中。
[0068]利用在第一級擴(kuò)增中使用的相同引物進(jìn)行第二級擴(kuò)增(見美國專利N0.6，605，451)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。然而，通常有利的是在第二級反應(yīng)中具有第一級產(chǎn)物內(nèi)部的引物，從而使得第一和第二級引物結(jié)合位置之間沒有重疊或重疊最小。第一級產(chǎn)物的稀釋很大地消除初始模板DNA和第一級試劑對第二級反應(yīng)的貢獻(xiàn)。此外，說明性地，具有高于用于第一級Tm的Tm的第二級引物可用于加強(qiáng)巢式擴(kuò)增。引物可被設(shè)計(jì)為避免顯著的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、異源/同源二聚體和不期望的混雜物。由于巢式設(shè)計(jì)，第二級引物比用于在單個(gè)步驟中從基因組DNA擴(kuò)增靶的引物更耐有毒反應(yīng)?？蛇x擇地，熱啟動(dòng)用于第二級擴(kuò)增。
[0069]如果熒光染料被包括在第二級擴(kuò)增中，例如作為dsDNA結(jié)合染料或作為熒光探針的一部分，如本領(lǐng)域已知的，則提供的光學(xué)器件可用于監(jiān)測一個(gè)或多個(gè)樣本的擴(kuò)增?？蛇x擇地，擴(kuò)增曲線的形狀分析可提供用于將每個(gè)樣本稱呼為陽性或陰性。在通過引用合并于此的美國專利N0.6，730，501中論述了稱呼樣本的說明性方法。替代性地，可使用采用交叉閾值的方法。計(jì)算機(jī)可被設(shè)置在外部或儀器內(nèi)，并且可被配置為執(zhí)行方法并基于第二級擴(kuò)增的存在或缺乏稱呼樣本為陽性或陰性，并且可通過將擴(kuò)增曲線的特征參數(shù)(諸如交叉閾值)與標(biāo)準(zhǔn)曲線或相對于運(yùn)行內(nèi)的其他擴(kuò)增曲線對比，提供關(guān)于開始模板濃度的定量信息。然而，應(yīng)該理解，本領(lǐng)域已知的其他方法可用于稱呼每個(gè)樣本?？蓪晒庑畔⑦M(jìn)行其他分析。一個(gè)這種非限制性例子是使用熔解曲線分析來顯示擴(kuò)增子的合適的熔解特征(例如，Tm、熔解曲線形狀)。提供的光學(xué)器件可配置為立即俘獲所有泡形罩63的圖像，或者可為每個(gè)單個(gè)泡形罩提供單個(gè)光學(xué)器件。其他配置在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0070]圖5示出替代性的袋110。在本實(shí)施例中，各個(gè)試劑經(jīng)由配件190被加載到袋110中。圖5a示出具有多個(gè)柱塞168之一的配件190的橫截面。應(yīng)該理解，盡管圖5a示出穿過入口通道115a的橫截面，但如圖5的實(shí)施例所示，存在12個(gè)入口通道(入口通道115a至1151)，每個(gè)入口通道可具有其在配件190中使用的自己的柱塞168，但在本特定配置中，未使用入口通道115c、115f和115i。應(yīng)該理解，具有12個(gè)入口通道的配置僅是說明性的，并且可使用任何數(shù)量的入口通道和相關(guān)柱塞。在說明性實(shí)施例中，配件190的可選的真空端口 142可形成為通過配件190的第一表面194以與腔192連通?？蛇x的真空端口 142可被設(shè)置用于與真空或真空腔(未示出)連通以抽出袋110內(nèi)的空氣，從而在腔192和袋110的各個(gè)泡形罩和腔內(nèi)形成真空。柱塞168隨后被足夠遠(yuǎn)地插入到腔192內(nèi)以密封真空端口142。說明性地，腔192被設(shè)置在預(yù)定量的真空下以在使用時(shí)將期望量的液體抽入腔192。在已經(jīng)通過引用合并于此的美國專利N0.8，409, 508中可找到制備腔192的額外信息。
[0071]說明性配件190進(jìn)一步包括形成在配件190的第二表面195中的注射端口 141。說明性地，注射端口 141被放置得比真空端口 142更靠近袋110的塑料薄膜部分，如圖5a所示，從而使得柱塞168插入得足夠遠(yuǎn)以密封真空端口 142，同時(shí)仍允許經(jīng)由注射端口 141進(jìn)入腔192。如圖所示，塑料薄膜部分117的第二表面119提供可穿透密封件139，以防止腔192和周圍大氣之間經(jīng)由注射端口 141連通。然而，應(yīng)該理解，第二表面119可以可選擇地不延伸到注射端口 141，并且可以采用各種其他密封件。此外，如果需要密封的另一位置，例如在配件190的第一表面194上，則注射端口 141可包括至配件190上的該位置的通道。已經(jīng)通過引用合并于此的美國專利申請N0.10/512，255示出密封件位置遠(yuǎn)離注射端口并且密封件經(jīng)由通道連接到腔的各種配置。此外，美國專利N0.8，409，508公開了通道將單個(gè)密封件連接到多個(gè)腔的各種配置。密封件位置的變化以及單個(gè)注射端口與多個(gè)腔的連接在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？蛇x擇地，密封件139可以是易破的并且可在插入插管(未示出)時(shí)破裂，以允許來自插管內(nèi)的流體樣本被抽入或壓入腔192。
[0072]袋組件110的說明性柱塞168是圓柱形的并且具有約5mm的直徑以被壓配合到腔192中。柱塞168包括第一端173和相反的第二端175。如圖5a所示，柱塞168的凹口 169形成在第二端175中。在使用時(shí)，第二端175被部分插入腔192中，并且凹口 169與注射端口 141對準(zhǔn)以允許流體樣本被抽入或注射到腔192中，即使當(dāng)柱塞168插入足夠遠(yuǎn)以致柱塞168反而阻擋注射端口 141時(shí)。
[0073]說明性地，流體位于具有注射器的容器(未示出)中，注射器具有可被插入注射端口 141以刺穿其中的密封件139的筒狀尖端。在使用排空空氣的袋組件110的情況下，當(dāng)密封件139被刺穿時(shí)，由于腔192內(nèi)相對于環(huán)境空氣壓力的負(fù)壓，流體從容器退出。然后流體穿過端口 141以填充腔192。此時(shí)，流體通常不會(huì)流到袋110的塑料薄膜部分117中。最后，將柱塞168插入腔192中，從而使得柱塞168的第二端175接近腔192的底部191，以將測定量的試劑或樣本推入塑料薄膜部分117。如圖所示，柱塞168被配置為使得，當(dāng)完全插入時(shí)，第二部分175不會(huì)遭遇腔192的底部191。剩余空間可用于捕集氣泡，由此減少進(jìn)入塑料薄膜部分117的氣泡數(shù)量。然而，在一些實(shí)施例中，當(dāng)完全插入柱塞168時(shí)，期望第二端175接觸底部191。在圖5所示的實(shí)施例中，入口通道115a、115b、115d、115e、115g、115h、115j、115k和1151都通向反應(yīng)區(qū)或儲(chǔ)存器泡形罩。應(yīng)該理解，與入口通道115a相關(guān)的柱塞的完全插入將迫使樣本進(jìn)入三瓣式泡形罩122，與入口通道115b相關(guān)的柱塞的完全插入將迫使試劑進(jìn)入儲(chǔ)存器泡形罩101，與入口通道115d相關(guān)的柱塞的完全插入將迫使試劑進(jìn)入儲(chǔ)存器泡形罩102，與入口通道115e相關(guān)的柱塞的完全插入將迫使試劑進(jìn)入儲(chǔ)存器泡形罩103，與入口通道115g相關(guān)的柱塞的完全插入將迫使試劑進(jìn)入儲(chǔ)存器泡形罩104，與入口通道115h相關(guān)的柱塞的完全插入將迫使試劑進(jìn)入儲(chǔ)存器泡形罩105，與入口通道115j相關(guān)的柱塞的完全插入將迫使試劑進(jìn)入儲(chǔ)存器泡形罩106，與入口通道115k相關(guān)的柱塞的完全插入將迫使試劑進(jìn)入儲(chǔ)存器泡形罩107，并且與入口通道1151相關(guān)的柱塞的完全插入將迫使試劑進(jìn)入儲(chǔ)存器泡形罩108。
[0074]如果使用包括如圖5a所示的實(shí)施例所示的凹口 169的柱塞設(shè)計(jì)，則柱塞168可在下降之前旋轉(zhuǎn)，從而偏置凹口 169并關(guān)閉注射端口 141使其不與腔192連通，以將內(nèi)容物密封在其中。這用于最小化通過注射端口 141流到周圍大氣中的任何可能的流體回流，這在期望延遲完全插入柱塞時(shí)尤其有用。盡管以上參照柱塞168示出和描述的凹口 169，但是在將流體樣本分配到腔192中之后不久通過其他方式(諸如，朝向腔192的底部按壓柱塞168、熱密封、單向閥或自密封端口)關(guān)閉注射端口 141在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如果熱密封被用作密封方法，則儀器中可包括密封條，從而當(dāng)將袋插入儀器中時(shí)熱密封所有腔。
[0075]在說明性方法中，使用者將樣本注射到與入口通道115a相關(guān)的注射端口 141中，并將水注射到各個(gè)其他注射端口。水使之前已經(jīng)在與每一個(gè)入口通道115b、115d、115e、115g、115h、115j、115k和1151相關(guān)的腔192中冷凍干燥的試劑復(fù)水。水可通過單個(gè)密封件注射，然后經(jīng)由通道被分配到每個(gè)腔，如以下圖6所示，或者水可被單獨(dú)地注射到每個(gè)腔中。替代性地，不通過注射水來使干燥的試劑復(fù)水，而是可將諸如溶解試劑、核酸提取試劑和PCR試劑的試劑注射到配件190的合適的腔192中。
[0076]當(dāng)啟用與入口通道115a相關(guān)的柱塞168時(shí)，經(jīng)由通道114迫使樣本直接進(jìn)入三瓣式泡形罩122。使用者還按壓其余柱塞168，迫使內(nèi)容物從配件190中的每個(gè)腔192出來并通過108進(jìn)入儲(chǔ)存器泡形罩101。此時(shí)，袋110被加載到儀器中進(jìn)行處理。盡管圖8所示的儀器800被配置用于圖6的袋210，但是應(yīng)該理解，修改儀器800的氣囊的配置將使儀器800適于與袋110和510或其他配置的袋一起使用。
[0077]在一個(gè)說明性例子中，當(dāng)按壓柱塞168時(shí)，儲(chǔ)存器泡形罩101現(xiàn)在包含在異丙醇中的DNA結(jié)合磁珠，儲(chǔ)存器泡形罩102現(xiàn)在包含第一沖洗溶液，儲(chǔ)存器泡形罩103現(xiàn)在包含第二沖洗溶液，儲(chǔ)存器泡形罩104現(xiàn)在包含核酸洗提緩沖液，儲(chǔ)存器泡形罩105現(xiàn)在包含第一級PCR試劑(包括多重第一級引物)，儲(chǔ)存器泡形罩106現(xiàn)在包含沒有引物的第二級PCR試齊U，儲(chǔ)存器泡形罩107現(xiàn)在包含沒有引物和沒有模板的陰性對照PCR試劑，并且儲(chǔ)存器泡形罩108現(xiàn)在包含具有模板的陽性對照PCR試劑。然而，應(yīng)該理解，這些試劑僅是說明性的，并且根據(jù)期望的反應(yīng)和最佳條件可使用其他試劑。
[0078]一旦袋110已被放置到儀器800中并且樣本已經(jīng)移動(dòng)到三瓣式泡形罩122，就可通過利用溶解顆粒(諸如ZS或陶瓷珠)攪拌樣本而使樣本經(jīng)受破裂。溶解顆?？杀辉O(shè)置在三瓣式泡形罩122中，或者可與樣本一起被注射到三瓣式泡形罩122中。圖5的三瓣式泡形罩122以與圖1的三瓣式泡形罩22很相同的方式操作，對兩個(gè)下瓣124、126 —起加壓，并且壓力在上瓣128和兩個(gè)下瓣124、126之間交替。然而，如圖所示，下瓣124、126比下瓣24,26圓很多，允許珠平穩(wěn)地流到通道130并且允許高速碰撞，即使在連結(jié)點(diǎn)32處沒有三角形流分離器。與三瓣式泡形罩22相同，圖5的三瓣式泡形罩122允許有效地溶解或分裂樣本中的微生物、細(xì)胞和病毒微粒。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),寬度為約3-4_ (例如約3.5mm)的通道130在溶解期間保留相對純凈的珠并且有效地提供高速碰撞。
[0079]在溶解之后，通過對位于儲(chǔ)存器泡形罩101上方的氣囊加壓經(jīng)由通道138將核酸結(jié)合磁珠注射到上瓣128。磁珠與三瓣式泡形罩122的內(nèi)容物混合(例如，比在溶解期間更輕柔地),并培養(yǎng)溶液例如約I分鐘，以允許核酸結(jié)合到珠。
[0080]然后，經(jīng)由通道143將溶液泵送到“圖8”的泡形罩144，在該處，珠被容納在儀器中的可收縮磁體俘獲，該磁體例如是氣動(dòng)驅(qū)動(dòng)的。磁珠俘獲過程開始于對珠銑削設(shè)備122的所有瓣124、126和128加壓。這迫使122的多數(shù)液體內(nèi)容物通過通道143進(jìn)入泡形罩144。磁體與泡形罩144的下部144b接觸并且培養(yǎng)樣本若干秒，以允許磁體從溶液俘獲珠，然后對臨近泡形罩122的氣囊減壓，對臨近泡形罩部分144a和144b的氣囊加壓，并且流體被迫返回泡形罩122。由于單次穿過不能俘獲所有珠，因此可重復(fù)10次此過程以基本俘獲泡形罩144中的所有珠。然后，迫使液體離開泡形罩144，僅留下磁珠和俘獲的核酸，并在兩次連續(xù)沖洗中將沖洗試劑引入泡形罩144 (例如分別經(jīng)由通道145和147從儲(chǔ)存器泡形罩102和103中引入)。在每次沖洗時(shí)，對包含沖洗試劑的儲(chǔ)存器泡形罩上方的氣囊加壓，迫使內(nèi)容物進(jìn)入泡形罩144。退出磁體并且通過對覆蓋泡形罩144的每個(gè)瓣144a和144b的兩個(gè)氣囊中的每個(gè)交替加壓來分裂包含磁珠的小球。當(dāng)上瓣144a被壓縮時(shí)，液體內(nèi)容物受迫進(jìn)入下瓣144b，并且當(dāng)下瓣144b被壓縮時(shí)，內(nèi)容物受迫進(jìn)入上瓣144a。通過在上瓣144a和下瓣144b之間攪拌泡形罩144中的溶液，有效地從磁珠沖掉雜質(zhì)。在不充分?jǐn)嚢?珠的小球不受干擾)和過度攪拌(可能從珠表面沖掉核酸并隨著沖洗試劑損失核酸)之間保持平衡。在每個(gè)沖洗循環(huán)之后，經(jīng)由泡形罩144中的磁體俘獲磁珠并且說明性地迫使沖洗試劑進(jìn)入現(xiàn)在用作廢物盛器的三瓣式泡形罩122。然而,應(yīng)該理解,所使用的儲(chǔ)存器泡形罩也可用作廢物盛器，或者其他泡形罩可被專門設(shè)置為廢物盛器。
[0081]然后經(jīng)由通道149將來自儲(chǔ)存器泡形罩104的核酸洗提緩沖液注射到泡形罩144中，再次攪拌樣本，并且通過采用磁體再次俘獲磁珠。泡形罩144中的流體混合物現(xiàn)在含有來自原始樣本的核酸。泡形罩144上的壓力經(jīng)由通道152將核酸樣本移動(dòng)到第一級PCR泡形罩161，在該處樣本與含有多個(gè)引物組的第一級PCR混合液混合，經(jīng)由通道162從儲(chǔ)存器泡形罩105提供PCR混合液。如果需要，可在混合之前加熱樣本和/或第一級PCR混合液，以提供熱啟動(dòng)的優(yōu)點(diǎn)?？蛇x地，在第一級PCR之前可提供用于逆轉(zhuǎn)錄RNA靶的成分。替代性地，RT酶，例如耐熱RT酶，可被設(shè)置在第一級PCR混合液中，以允許同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄RNA靶。應(yīng)該理解，RT酶可以存在于本文公開的任何實(shí)施例中的第一級PCR混合物中。如下面將看到的，圖5的袋110可被配置為高達(dá)10個(gè)引物組，但是應(yīng)該理解，可以改變配置并且可使用任何數(shù)量的引物組。以低壓對位于泡形罩161上方的氣囊加壓，以迫使泡形罩161的內(nèi)容物與泡形罩161的另一側(cè)上的加熱/冷卻元件(例如珀?duì)柼?緊密接觸。泡形罩161上的壓力應(yīng)該足以確保與加熱/冷卻元件的良好接觸，但應(yīng)該足夠輕柔使得不致從泡形罩161壓迫出流體。加熱/冷卻元件是溫度循環(huán)的，例如在約60°C至約95°C之間。說明性地，溫度循環(huán)執(zhí)行約15-20個(gè)循環(huán)，由此擴(kuò)增存在的一個(gè)或多個(gè)核酸靶。同樣說明性地，溫度循環(huán)在平穩(wěn)階段之前停止，并且可在對數(shù)階段甚至對數(shù)階段之前停止。在一個(gè)例子中，可以僅期望利用所需的擴(kuò)增子富集樣本，而不達(dá)到最小檢測量。見通過引用合并于此的美國專利N0.6,605,451。
[0082]然后，通過迫使大多數(shù)樣本經(jīng)由通道152返回泡形罩144可選擇地稀釋經(jīng)擴(kuò)增的樣本，僅在泡形罩161中留下少量(例如，約1%至5%)經(jīng)擴(kuò)增的樣本，并且經(jīng)由通道163從儲(chǔ)存器泡形罩106提供第二級PCR混合液。樣本被徹底混合，例如通過經(jīng)由通道163在泡形罩106和161之間來回移動(dòng)樣本。如果需要，在第二級擴(kuò)增之前，可將反應(yīng)混合物加熱到延伸溫度(extens1n temperature)以上,例如至少60°C。然后,迫使樣本通過通道165進(jìn)入第二級擴(kuò)增區(qū)180中心的一陣列小體積泡形罩182中。十個(gè)說明性小體積泡形罩182中的每個(gè)可包含不同引物對，基本與第一級擴(kuò)增中的引物對之一相同或“嵌入”第一級引物對內(nèi)以擴(kuò)增縮短的擴(kuò)增子?，F(xiàn)在通過樣本與水化合的引物使擴(kuò)增混合物完全。并且，通過分別對儲(chǔ)存器泡形罩107和108的內(nèi)容物加壓，迫使PCR混合液不具有經(jīng)由通道166來自儲(chǔ)存器泡形罩107的靶DNA或具有經(jīng)由通道167來自儲(chǔ)存器泡形罩108的對照DNA，引入陽性和陰性對照樣本。如圖所示，陽極對照泡形罩183和陰極對照泡形罩181的每一種存在五個(gè)，其可2倍復(fù)用，以為十個(gè)不同的第二級擴(kuò)增反應(yīng)提供必要的對照。應(yīng)該理解，此配置僅是說明性的，并且可提供任何數(shù)量的第二級泡形罩。
[0083]說明性地，用于第二級擴(kuò)增的PCR混合液缺少引物，但以其他方式變得完全。然而，“不完全的”PCR混合液也可缺少其他PCR成分。在一個(gè)例子中，第二級PCR混合液僅是水或緩沖液，然后其與可選擇地稀釋的第一級PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合。此混合物移動(dòng)到小體積PCR反應(yīng)泡形罩，在該處已經(jīng)提前提供了所有其余成分。如果需要，所有其余成分可混合在一起并作為單一混合物被點(diǎn)樣到小體積PCR反應(yīng)泡形罩中。替代性地,如圖5b所示,每個(gè)成分可被點(diǎn)樣到小體積PCR反應(yīng)泡形罩182的單獨(dú)區(qū)域上。如圖5b所示，存在四個(gè)區(qū)域，例如，dNTP被點(diǎn)樣在區(qū)域182a處，引物被點(diǎn)樣在182b處，聚合酶被點(diǎn)樣在182c處，并且鎂混合物被點(diǎn)樣在182d處。通過在使成分復(fù)水之前單獨(dú)點(diǎn)樣成分并加熱樣本混合物，可最小化非特異性反應(yīng)。應(yīng)該理解，可以用此方式點(diǎn)樣任意組合的成分，將成分點(diǎn)樣到泡形罩的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域中的該方法可與本發(fā)明的任何實(shí)施例一起使用。
[0084]密封通向小體積PCR反應(yīng)泡形罩181、182和183的通道165、166和167，并且氣動(dòng)氣囊輕柔地按壓陣列使其靠著加熱/冷卻元件(例如珀?duì)柼?，以便熱循環(huán)?？蓡为?dú)為第二級熱循環(huán)設(shè)定循環(huán)參數(shù)。說明性地，通過將激勵(lì)源(例如藍(lán)光(450-490nm))聚焦到陣列上并對得到的熒光發(fā)射物(例如510nm以上的熒光射線)成像，來監(jiān)測反應(yīng)。
[0085]在以上例子中，未論述夾閥。然而，應(yīng)該理解，當(dāng)期望將樣本包含在泡形罩之一中時(shí)，對位于通向和來自特定泡形罩的通道上方的氣動(dòng)致動(dòng)器加壓，產(chǎn)生夾閥并關(guān)閉通道。相反，當(dāng)期望從泡形罩之一移動(dòng)樣本時(shí)，對合適的氣動(dòng)致動(dòng)器減壓，允許樣本流過通道。
[0086]上述圖5中的袋包括試劑儲(chǔ)存器泡形罩101至108，其中，使用者將試劑從配件190注射到袋110的塑料薄膜部分117中的試劑儲(chǔ)存器泡形罩101至108，例如在將袋110插入儀器之前。雖然使用圖5的試劑儲(chǔ)存器泡形罩具有優(yōu)點(diǎn)，包括能夠保持各個(gè)泡形罩的內(nèi)容物處于不同溫度，但也存在一些缺點(diǎn)。由于操作者負(fù)責(zé)將試劑從配件190移動(dòng)到儲(chǔ)存器泡形罩101至108，并且由于這通常在機(jī)器外部完成并因而沒有啟用的夾閥，因此試劑可能偶爾從儲(chǔ)存器泡形罩泄漏到工作泡形罩。在制備和加載期間，暴露儲(chǔ)存器泡形罩中的試齊IJ。如果它們被按壓、擠壓甚至被輕微地撞擊，試劑可能通過可用通道泄漏。如果試劑損失大，則反應(yīng)可能完全失敗。此外，在操作期間，從儲(chǔ)存器泡形罩101至108壓入的試劑量可能存在一些變化，導(dǎo)致不一致的結(jié)果。自動(dòng)地將試劑引入配件190并將試劑從配件190移動(dòng)到試劑儲(chǔ)存器泡形罩101至108，將會(huì)解決這些問題中的許多問題，并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0087]圖6的袋210通過利用直接注射方法以不同方式處理這些問題中的許多問題，其中，儀器自身移動(dòng)柱塞268 (例如經(jīng)由氣動(dòng)活塞)并當(dāng)需要試劑時(shí)迫使試劑進(jìn)入各個(gè)工作泡形罩。在圖6的實(shí)施例中，試劑被引入配件290的各個(gè)腔292中并且保持在其中直到被需要，而非將試劑存儲(chǔ)在圖5的儲(chǔ)存器泡形罩101至108中。活塞268在合適時(shí)間的氣動(dòng)操作將測定量的試劑引入合適的反應(yīng)泡形罩。除了處理許多上述問題之外，袋210還具有更緊湊的形狀，允許更小的儀器設(shè)計(jì)，并且袋210具有更短的通道，允許更好的流體流動(dòng)并最小化通道中的試劑損失。
[0088]在圖6的一個(gè)說明性實(shí)施例中，包括待測試樣本(100 μ I)和溶解緩沖液(200 μ I)的300 μ I混合物被注入注射端口 241a。水也經(jīng)由密封件239b被注入配件290，與i^一種不同的試劑混雜，每種試劑經(jīng)由通道293以干燥形式被預(yù)先設(shè)置在腔292b至2921(以陰影示出)。說明性地，這些試劑可包括冷凍干燥的PCR試劑、DNA提取試劑、沖洗溶液、免疫測定試劑或其他化學(xué)實(shí)體。對于圖6的例子，試劑用于核酸提取、第一級多重PCR、多重反應(yīng)的稀釋以及制備第二級PCR試劑并且控制反應(yīng)。在圖6所示的實(shí)施例中，需要注入的僅是端口 241a中的樣本和端口 241b中的水。
[0089]如圖6所示，經(jīng)由密封件293b注射的水經(jīng)由通道293分配到各個(gè)腔。在本實(shí)施例中，僅樣本和水需要被注射到袋210中。然而，應(yīng)該理解，水可被單獨(dú)地注射到每個(gè)腔292中。此外應(yīng)該理解，如果需要，可將特定濕試劑注射到每個(gè)腔中，而不是將干燥試劑設(shè)置在各個(gè)腔292中并在注入水時(shí)混雜。此外，應(yīng)該理解，腔292中的一個(gè)或多個(gè)可僅設(shè)置有水，并且必要的試劑可干燥地設(shè)置在合適的反應(yīng)泡形罩中。如由特定反應(yīng)的需要指示的，以上各種組合在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0090]如圖6中可見，可選擇的突起213被設(shè)置在配件290的底部表面297上。如圖所示，突起213位于它們各自的入口通道215內(nèi)。然而，可以采用其他配置。突起213輔助打開入口通道215，并當(dāng)柱塞268被按壓時(shí)防止底部表面297與另一平坦表面接合從而阻斷入口通道215，這有助于在柱塞268啟用時(shí)防止回流。這類突起可用在根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)袋中的任何袋上。
[0091]在將水注入袋以混雜配件的多個(gè)腔中的多種干燥試劑的實(shí)施例中，需要關(guān)閉注射端口和許多腔之間的通道的裝置。如果通道未關(guān)閉，則每個(gè)柱塞的啟用可能迫使其各自腔中的一些內(nèi)容物返回到通道中，可能污染相鄰腔并改變?nèi)菁{在腔中和從腔傳送的體積。已經(jīng)使用若干方式關(guān)閉此通道，包括如上所述地旋轉(zhuǎn)有凹口的柱塞268，橫跨通道熱密封塑料薄膜由此永久地關(guān)閉通道，以及向通道施加壓力作為夾閥。也可以使用其他封閉件，諸如內(nèi)嵌入配件中的閥，例如單向閥。
[0092]在將流體加載到腔292中并將袋210加載到儀器中之后，按壓柱塞268a (例如經(jīng)由啟動(dòng)氣動(dòng)活塞)，迫使其余樣本經(jīng)由通道214進(jìn)入三瓣式泡形罩220。與圖1和5所示的實(shí)施例一樣，經(jīng)由氣囊組件810的作用氣囊824、826和828順序地按壓三瓣式泡形罩220的瓣224、226和228，如圖7_9所示，迫使液體通過瓣之間的窄連結(jié)點(diǎn)232，并驅(qū)動(dòng)高速碰撞，切割樣本并釋出核酸，例如包括來自難以打開的孢子、細(xì)菌和真菌的核酸。細(xì)胞溶解持續(xù)合適的時(shí)間長度，例如0.5至10分鐘。
[0093]一旦充分溶解了細(xì)胞，就啟用柱塞268b并經(jīng)由通道236將儲(chǔ)存在腔292b中的核酸結(jié)合磁珠注射到三瓣式泡形罩220的上瓣228中。樣本與磁珠混合并且允許培養(yǎng)混合物合適的時(shí)間長度,例如約10秒至10分鐘。
[0094]樣本和珠的混合物經(jīng)由氣囊826的作用受迫通過通道238進(jìn)入泡形罩244，然后經(jīng)由氣囊844的作用通過通道243進(jìn)入泡形罩246，其中，位于儀器800中鄰近泡形罩245的可收縮磁體850 (在圖8中示出)俘獲來自溶液的磁珠，形成靠著泡形罩246的內(nèi)表面的小球。然后位于泡形罩246上方的氣動(dòng)氣囊846迫使液體從泡形罩246流出并通過泡形罩244返回現(xiàn)在用作廢物盛器的泡形罩222中。然而，如以上參照圖5論述的，其他廢物盛器在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可以啟用柱塞268c、268d和268e之一，以經(jīng)由通道245將沖洗溶液提供到泡形罩244，然后經(jīng)由通道243將沖洗溶液提供到泡形罩246。可選擇地，收縮磁體850，并且通過交替地對氣囊844和846加壓使得珠經(jīng)由通道243從泡形罩244和246來回移動(dòng)來沖洗磁珠。一旦磁珠被沖洗，就通過啟用磁體850將磁珠俘獲在泡形罩246中，然后將沖洗溶液移動(dòng)到泡形罩222。可根據(jù)需要重復(fù)此過程，以從核酸結(jié)合磁珠沖洗掉溶劑緩沖液和樣本殘?jiān)?。說明性地，進(jìn)行三次沖洗，每個(gè)都利用腔292c、292d和292e中的沖洗試劑。然而，應(yīng)該理解，更多或更少次的沖洗在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如果需要更多次沖洗，則可提供更多個(gè)腔292。替代性地，每個(gè)腔292可保存較大體積的流體并且每次啟用柱塞可在每次啟用時(shí)僅迫使部分體積從腔流出。
[0095]在沖洗之后，存儲(chǔ)在腔292f中的洗提緩沖液經(jīng)由通道247移動(dòng)到泡形罩248，并且收縮磁體。溶液經(jīng)由通道252在泡形罩246和248之間循環(huán)，破壞泡形罩246中的磁珠小球并允許被俘獲的核酸脫離珠并進(jìn)入溶液。再次啟用磁體850，俘獲泡形罩246中的磁珠，并且洗提的核酸溶液受迫進(jìn)入泡形罩248。
[0096]按壓柱塞268h并且來自腔292h的第一級PCR混合液與泡形罩248中的核酸樣本混合?？蛇x擇地，通過交替啟用氣囊848和864，經(jīng)由通道253在248和264之間壓迫混合物，來混合混合物。在若干混合循環(huán)之后，溶液包含在泡形罩264中，在該處執(zhí)行第一級多重PCR。如果需要，在混合之前，樣本可保留在泡形罩246中，同時(shí)預(yù)加熱第一級PCR混合液，例如通過將第一級PCR混合液移動(dòng)到泡形罩264中或者通過在泡形罩248附近提供加熱器。如上所述，此預(yù)加熱可提供熱啟動(dòng)PCR的益處。圖8所示的儀器800的特征是加熱和冷卻樣本的基于珀?duì)柼臒嵫h(huán)器886和888。然而，應(yīng)該理解，如上所述可以使用其他加熱器/冷卻器裝置?？蛇x擇地，在溫度循環(huán)期間，泡形罩248和264之間的混合可持續(xù)，其中熱循環(huán)器886被放置用于加熱和冷卻泡形罩248和264兩者。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些實(shí)施例中這種混合改進(jìn)第一級PCR反應(yīng)。此外，可通過改變兩個(gè)或多個(gè)不同泡形罩中的溫度，允許最小的能量消耗和最大的熱循環(huán)速率，來完成熱循環(huán)。例如，泡形罩248中的溫度可保持在95°C，并且泡形罩264中的溫度可保持在65°C，并且在這些泡形罩之間移動(dòng)樣本會(huì)有效地將熱量傳遞到樣本以及從樣本傳遞出熱量，允許快速準(zhǔn)確的熱循環(huán)。溫度循環(huán)例如執(zhí)行15-20個(gè)循環(huán)，但如上所述地，根據(jù)應(yīng)用可期望進(jìn)行其他程度的擴(kuò)增。如以下將看到的，第二級擴(kuò)增區(qū)280被配置用以檢測18個(gè)第二級反應(yīng)中的擴(kuò)增。因此，泡形罩264中的PCR反應(yīng)可包括18個(gè)不同的引物對。
[0097]在替代性的熱啟動(dòng)方法中，袋210被制造為在泡形罩之一中(例如引物264)設(shè)置有引物。在一個(gè)實(shí)施例中，引物被單獨(dú)地凍結(jié)干燥，然后在制造期間被引入泡形罩264中作為易碎的小球。在第一級PCR之前，說明性地，樣本從泡形罩246中被洗提并且被推到泡形罩264以使引物小球復(fù)水。與泡形罩248和264相鄰放置的珀?duì)柼?86被加熱到48°C，并且PCR混合液被推到泡形罩248。在保持例如10秒(期間兩個(gè)泡形罩達(dá)到48°C )之后，泡形罩248和264之間的混合開始。因此，酶和dNTP保留在泡形罩248中，并且大多數(shù)樣本和引物保留在泡形罩264中，直到成分分別達(dá)到48°C。然而，應(yīng)該理解，48°C的選擇是為了與同時(shí)發(fā)生的第一級擴(kuò)增和利用AMV (其在高達(dá)50°C下具有活性)的RT —起使用而做出的。如果不需要RT或者使用更加耐熱的RT酶，則根據(jù)引物熔解溫度或特定的第一級擴(kuò)增規(guī)程中的其他因素，可將兩個(gè)泡形罩248和264中的一個(gè)或兩個(gè)加熱至58°C，甚至更高。應(yīng)該理解，此熱啟動(dòng)方法可與本發(fā)明的任何實(shí)施例一起使用。
[0098]在替代性實(shí)施例中，為了降低第一級PCR反應(yīng)的復(fù)雜性，泡形罩248可被劃分成兩個(gè)或多個(gè)泡形罩。通常認(rèn)為多重反應(yīng)的非特異性產(chǎn)物的數(shù)量按混合物中引物數(shù)量的二次方(或者可能是更高的冪)升高，而化驗(yàn)敏感度的損失是輸入樣本量的線性函數(shù)。因此，例如，將第一級PCR分成兩個(gè)反應(yīng)(每個(gè)反應(yīng)具有本實(shí)施例的單個(gè)反應(yīng)的一半量)會(huì)使敏感度降低至1/2，但非特異性反應(yīng)的量和復(fù)雜度會(huì)多至1/4。如果泡形罩248被劃分為或多個(gè)泡形罩，則泡形罩264可被劃分為數(shù)量等于泡形罩248的數(shù)量的泡形罩。每個(gè)相應(yīng)的泡形罩248將經(jīng)由各自的通道253連接到其各自的泡形罩264。每個(gè)泡形罩264將設(shè)置有包括一子組所有引物的小球。來自泡形罩246的樣本將橫跨每個(gè)泡形罩248被劃分，每個(gè)泡形罩248相對于所有其他泡形罩被密封，并且利用每對泡形罩248和264進(jìn)行熱循環(huán)，如上所述。在熱循環(huán)之后，樣本再次結(jié)合到泡形罩266中或者單獨(dú)被傳送到單獨(dú)組的第二級泡形罩。
[0099]在第一級PCR已進(jìn)行了期望數(shù)量的循環(huán)之后，可如以上參照圖5的實(shí)施例所論述的那樣稀釋樣本，通過迫使大多數(shù)樣本返回泡形罩248，僅留下少量，并添加來自腔292i的第二級PCR混合液。替代性地，來自292i的稀釋緩沖液可經(jīng)由通道249移動(dòng)到泡形罩266，然后通過在泡形罩264和266之間來回移動(dòng)流體而與泡形罩264中的擴(kuò)增樣本混合。在混合之后，迫使泡形罩264中剩余的一部分稀釋樣本進(jìn)入現(xiàn)在是廢物盛器的三瓣式泡形罩222。如果需要，可利用來自腔292j和292k的稀釋緩沖液重復(fù)進(jìn)行若干次稀釋，然后將來自腔292g的第二級PCR混合液添加到一些或所有稀釋的擴(kuò)增樣本中。應(yīng)該理解，可通過改變稀釋步驟的數(shù)量或通過改變在與稀釋緩沖液或第二級PCR混合液混合之前被丟棄的樣本的百分比，來調(diào)整稀釋水平。如果需要，在移動(dòng)到第二級泡形罩282以便進(jìn)行第二級擴(kuò)增之前，樣本和第二級PCR混合液的此混合物可在泡形罩264中被預(yù)加熱。如上所述，這種預(yù)加熱可使第二級PCR混合物中不再需要熱啟動(dòng)成分(抗體、化學(xué)品或其他)。
[0100]說明性的第二級PCR混合液是不完全的，缺少引物對，并且18個(gè)第二級泡形罩282中的每個(gè)預(yù)加載有特定的PCR引物對。如果需要，第二級PCR混合液可缺少其他反應(yīng)成分，然后也可將這些成分預(yù)加載到第二級泡形罩282中。如以上參照之前例子論述的，每個(gè)引物對可與第一級PCR引物對相同或者可嵌入第一級引物對內(nèi)。樣本從泡形罩264到第二級泡形罩的移動(dòng)使PCR反應(yīng)混合物完全。來自腔2921的對照樣本也經(jīng)由通道267移動(dòng)到對照泡形罩283。根據(jù)需要，對照樣本可以是陽性或陰性對照物。說明性地，每個(gè)袋將包含對照反應(yīng)，其驗(yàn)證過程中每個(gè)步驟的操作并證明陽性結(jié)果不是由之前擴(kuò)增的核酸的自身污染導(dǎo)致的。然而，這在許多規(guī)程中不實(shí)用，尤其是高度多重反應(yīng)。提供合適的對照物的一種說明性方法涉及利用諸如面包酵母物種的示蹤樣本。核酸從酵母中提取出，伴隨其他核酸。第一和第二級PCR反應(yīng)擴(kuò)增來自酵母基因組的DNA和/或RNA靶。說明性地，從拼接的mRNA前體得到的mRNA序列可用于通過布置引物序列以跨過內(nèi)含子而產(chǎn)生RNA特異性靶序列。針對參考標(biāo)準(zhǔn)對酵母拷貝數(shù)的定量分析允許實(shí)質(zhì)上確認(rèn)系統(tǒng)的每個(gè)成分都在工作。對于許多第二級化驗(yàn)中的每個(gè)的陰性對照反應(yīng)更加成問題。這可能需要以并行或單獨(dú)運(yùn)行來運(yùn)行對照反應(yīng)。
[0101]氣囊組件810的氣囊882的啟用將樣本密封到它們各自的第二級泡形罩282、283中，并且氣囊880的啟用對第二級泡形罩282、283提供輕柔的壓力，以迫使第二級泡形罩282,283與加熱器/冷卻器裝置接觸。位于第二級擴(kuò)增區(qū)280之上的窗口 847允許在PCR期間以及反應(yīng)產(chǎn)物的DNA熔解曲線分析期間熒光監(jiān)測陣列。
[0102]應(yīng)該注意，圖6的袋210具有若干未密封區(qū)域，諸如未密封區(qū)域255和未密封區(qū)域256。這些未密封區(qū)域形成不涉及此說明性實(shí)施例中的任何反應(yīng)的泡形罩。反而，這些未密封區(qū)域被設(shè)置在工作泡形罩和通道之間的空間中。在一些制造過程中，與在所有未使用區(qū)域都密封的袋相比，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)設(shè)置諸如255和256的未密封區(qū)域時(shí)有時(shí)產(chǎn)生更少的泄漏，可能是由于減少了薄膜材料中成問題的褶皺。對于任何袋實(shí)施例可選擇地提供這類未密封區(qū)域。
[0103]圖8示出可與袋210 —起使用的說明性設(shè)備800。儀器800包括可形成外殼壁或被安裝在外殼內(nèi)的支撐構(gòu)件802。儀器800還包括可選擇地可相對于支撐構(gòu)件802移動(dòng)的第二支撐構(gòu)件804，以允許插入和退出袋210?？梢苿?dòng)支撐構(gòu)件804可安裝在軌道上或科通過各種方式中的任一種相對于支撐構(gòu)件802移動(dòng)。說明性地，一旦袋210已被插入儀器800中，蓋805就配合在袋210上。在另一實(shí)施例中，通過其他機(jī)械裝置或通過氣動(dòng)壓力將袋210保持就位，可固定支撐構(gòu)件802和804兩者。
[0104]說明性地，氣囊組件810和氣動(dòng)閥組件808被安裝在可移動(dòng)構(gòu)件802上，而加熱器886和888被安裝在支撐構(gòu)件802上。然而，應(yīng)該理解，此布置僅是說明性的，并且可采用其他布置。由于氣囊組件810和氣動(dòng)閥組件808被安裝在可移動(dòng)支撐構(gòu)件804上，這些氣動(dòng)致動(dòng)器可朝向袋210移動(dòng)，從而使得氣動(dòng)致動(dòng)器設(shè)置為與袋210接觸。當(dāng)袋210被插入儀器800中并且可移動(dòng)支撐構(gòu)件804朝向支撐構(gòu)件802移動(dòng)時(shí)，袋210的各個(gè)泡形罩位于與氣囊組件810的各個(gè)氣動(dòng)氣囊和氣動(dòng)閥組件808的各個(gè)氣動(dòng)活塞相鄰的位置，從而使得啟用氣動(dòng)致動(dòng)器可從袋210的一個(gè)或多個(gè)泡形罩壓出液體或者可與袋210的一個(gè)或多個(gè)通道形成夾閥。下面參照圖9和10更詳細(xì)地論述袋210的泡形罩和通道與氣囊組件810和氣動(dòng)閥組件808的氣動(dòng)致動(dòng)器之間的關(guān)系。
[0105]每個(gè)氣動(dòng)致動(dòng)器具有一個(gè)或多個(gè)氣動(dòng)配件。例如，氣囊組件810的氣囊824具有氣動(dòng)配件824a，并且氣動(dòng)活塞843具有其相關(guān)的氣動(dòng)配件843a。在說明性實(shí)施例中，氣囊組件810的每個(gè)氣動(dòng)配件延伸通過可移動(dòng)支撐構(gòu)件804中的通路816，其中，軟管878經(jīng)由閥899將每個(gè)氣動(dòng)配件連接到壓縮空氣源895。在說明性實(shí)施例中，通路816不僅提供至壓縮空氣源895的入口，而且此通路還幫助對準(zhǔn)氣囊組件810的各個(gè)部件，從而使得氣囊與袋210的泡形罩正確地對準(zhǔn)。
[0106]類似地，氣動(dòng)閥組件808也被安裝在可移動(dòng)支撐構(gòu)件804上，但是應(yīng)該理解，可采用其他配置。在說明性實(shí)施例中，氣動(dòng)閥組件808上的銷858安裝在可移動(dòng)支撐構(gòu)件804上的安裝開口 859中，氣動(dòng)活塞843、852、853和862延伸通過可移動(dòng)支撐構(gòu)件804中的通道816，以接觸袋210。如圖所示，氣囊組件被安裝在可移動(dòng)支撐構(gòu)件804的第一側(cè)811上，而氣動(dòng)閥組件808被安裝在可移動(dòng)支撐構(gòu)件804的第二側(cè)812上。然而，由于氣動(dòng)活塞843、852、853和862延伸通過通道816，因此氣動(dòng)閥組件808的氣動(dòng)活塞和氣囊組件810的氣動(dòng)氣囊一起工作，以為袋210提供必要的氣動(dòng)致動(dòng)器。
[0107]如上所述，氣囊組件810和氣動(dòng)閥組件808的每個(gè)氣動(dòng)致動(dòng)器具有相關(guān)的氣動(dòng)配件。盡管圖8僅示出了若干軟管878，但是應(yīng)該理解，每個(gè)氣動(dòng)配件經(jīng)由軟管878連接到壓縮氣體源895。壓縮氣體源895可以是壓縮機(jī)，或替代性地，壓縮氣體源895可以是壓縮氣體氣缸，諸如二氧化碳?xì)飧?。?dāng)期望便攜性時(shí)，壓縮氣體氣缸尤其有用。其他壓縮氣體源在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0108]儀器810的若干其他部件也連接到壓縮氣體源895。被安裝在支撐構(gòu)件802的第一側(cè)813上的磁體850說明性地利用經(jīng)由軟管878來自壓縮氣體源895的氣體而伸展和收縮，但本領(lǐng)域已知移動(dòng)磁體850的其他方法。磁體850位于支撐構(gòu)件802的凹陷部851中。應(yīng)該理解，凹陷部851可以是通過支撐構(gòu)件802的通路，從而使得磁體850可接觸袋210的泡形罩246。然而，根據(jù)支撐構(gòu)件802的材料，應(yīng)該理解凹陷部851不必完全延伸通過支撐構(gòu)件802，只要當(dāng)磁體850伸展時(shí)，磁體850足夠靠近以在泡形罩246處提供足夠大的磁場，并且當(dāng)磁體850收縮時(shí)，磁體850不顯著影響存在于泡形罩246中的任何磁珠。盡管參照了收縮磁體850，但是應(yīng)該理解，可使用電磁體，并且可通過控制通過電磁體的電流來啟用和停用電磁體。因此，盡管本說明書論述了退回或收縮磁體，但是應(yīng)該理解，這些術(shù)語足夠廣義以包括撤銷磁場的其他方式。應(yīng)該理解，氣動(dòng)連接件可以是氣動(dòng)軟管或氣動(dòng)空氣歧管，由此減少所需的軟管或閥的數(shù)量。
[0109]被安裝在支撐件802上的氣動(dòng)活塞陣列869的各個(gè)氣動(dòng)活塞868也經(jīng)由軟管878連接到壓縮氣體源895。盡管僅示出了將氣動(dòng)活塞868連接到壓縮氣體源895的兩個(gè)軟管878,但是應(yīng)該理解,每個(gè)氣動(dòng)活塞868都連接到壓縮氣體源895。顯示了十二個(gè)氣動(dòng)活塞868。當(dāng)袋210被插入儀器800中時(shí)，十二個(gè)氣動(dòng)活塞868被放置用以啟用袋210的它們各自的十二個(gè)柱塞268。當(dāng)蓋805被關(guān)閉在袋210上時(shí)，蓋805上的邊緣806為配件290提供支撐件，從而使得當(dāng)啟用氣動(dòng)活塞868時(shí)，蓋805將配件290保持就位。應(yīng)該理解，用于配件290的其他支撐件在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0110]一對加熱/冷卻裝置，例如珀?duì)柼訜崞?，被安裝在支撐件802的第二側(cè)814上。第一級加熱器886被放置用以加熱和冷卻用于第一級PCR的泡形罩264的內(nèi)容物。第二級加熱器888被放置用以加熱和冷卻用于第二級PCR的袋210的第二級泡形罩282和283的內(nèi)容物。然而，應(yīng)該理解，這些加熱器也可以用于其他加熱目的，并且根據(jù)特定應(yīng)用的需要可包括其他加熱器。
[0111]如果需要，儀器800可包括反饋機(jī)構(gòu)(未示出)，用于提供關(guān)于樣本是否實(shí)際上受迫進(jìn)入特定泡形罩的反饋。說明性的反饋機(jī)構(gòu)包括溫度或壓力傳感器或光學(xué)檢測器，尤其是包括熒光或彩色染料時(shí)。說明性地，這類反饋機(jī)構(gòu)可被安裝在支撐構(gòu)件802或804上。例如，壓力傳感器可被安裝在支撐件802上，鄰近泡形罩264的位置。當(dāng)樣本可能移動(dòng)到泡形罩264時(shí)，如果壓力傳感器被按壓，則允許繼續(xù)進(jìn)行樣本處理。然而，如果壓力傳感器未被按壓，則樣本處理可能停止，或者在在屏幕892上顯示錯(cuò)誤信息。任意組合的泡形罩或所有泡形罩可具有反饋機(jī)構(gòu)，以提供關(guān)于樣本是否合適地移動(dòng)通過袋的反饋。
[0112]當(dāng)需要熒光檢測時(shí)，可設(shè)置光學(xué)陣列890。如圖8所示，光學(xué)陣列890包括光源898，例如過濾白光的過濾LED光源或激光照明，以及照相機(jī)896。通過可移動(dòng)支撐件804的窗口 847為光學(xué)陣列890提供到達(dá)袋210的第二級擴(kuò)增區(qū)280的入口。說明性地，照相機(jī)896具有多個(gè)光電檢測器，每個(gè)對應(yīng)于袋210中的第二級泡形罩282、823。替代性地，照相機(jī)896可拍攝包括所有第二級泡形罩282、283的圖像，并且圖像可被劃分為與第二級泡形罩282、283中的每個(gè)相對應(yīng)的單獨(dú)視域。根據(jù)配置，光學(xué)陣列890可以是靜止的，或者光學(xué)陣列890可以位于移動(dòng)器上，移動(dòng)器附接到一個(gè)或多個(gè)馬達(dá)并且移動(dòng)以從每個(gè)單個(gè)第二級泡形罩282、283獲得信號。應(yīng)該理解，可采用其他配置。
[0113]如圖所示，計(jì)算機(jī)894控制壓縮空氣源895的閥899，并由此控制儀器800的所有氣動(dòng)件。計(jì)算機(jī)894還控制加熱器886和888以及光學(xué)陣列890。這些部件中的每個(gè)都例如經(jīng)由線纜891電連接，但其他物理連接或無線連接在本發(fā)明的范圍內(nèi)。應(yīng)該理解，計(jì)算機(jī)894可容納在儀器890內(nèi)或者可以在儀器890外部。此外，計(jì)算機(jī)894可包括控制一些或所有部件的內(nèi)設(shè)電路板，并且還可包括用以接收和顯示來自光學(xué)陣列的數(shù)據(jù)的外部計(jì)算機(jī)，諸如臺(tái)式或膝上PC。接口 893，例如鍵盤接口，可被設(shè)置為包括用于輸入信息和變量(諸如溫度、循環(huán)次數(shù)等)的密鑰。說明性地，還提供顯示器892。顯示器892可以例如是LED、IXD或其他這種顯示器。
[0114]圖9示出在儀器800操作期間氣囊組件810和袋210之間的關(guān)系。氣囊組件包括子組件815、817、818、819和822。由于氣囊子組件815的氣囊809很大，因此氣囊子組件815例如具有兩個(gè)氣動(dòng)配件815a和815b。氣囊809用于相對于袋210的塑料薄膜部分217關(guān)閉腔292 (如圖6所示)。當(dāng)按壓柱塞268之一，氣動(dòng)配件815a和815b中的一個(gè)或兩個(gè)允許氣囊809放氣。在來自腔292之一的流體穿過之后，再次對氣囊809加壓，密封通道214、236、245和249。盡管說明性氣囊子組件815僅具有一個(gè)氣囊809，但是應(yīng)該理解，可采用其他配置，說明性地，通道214、236、245和249中的每個(gè)具有其自身相關(guān)的氣囊或氣動(dòng)活塞。氣囊子組件822說明性地包括三個(gè)氣囊824、826和828。如上所述，氣囊824、826和828驅(qū)動(dòng)三瓣式泡形罩222進(jìn)行細(xì)胞溶解。如圖所示，氣囊824、826和828稍大于它們相應(yīng)的泡形罩224、226和228。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在充氣時(shí)，氣囊的表面可變得稍微圓頂形，并且利用尺寸稍大的氣囊允許在相應(yīng)泡形罩的整個(gè)表面上良好地接觸，使得壓力更均勻并且更好地排空泡形罩。然而，在一些情況中，可能需要也可能不需要完全排空個(gè)別泡形罩，并且較大或較小尺寸的氣囊可用于控制泡形罩排空體積。氣囊子組件817具有四個(gè)氣囊。氣囊836用作通道236的夾閥，而氣囊844、848和866被配置為分別在泡形罩244、248和266上提供壓力。氣囊子組件818具有兩個(gè)氣囊846和864，其被配置為分別在泡形罩246和264上提供壓力。最后，氣囊子組件819控制第二級擴(kuò)增區(qū)280。氣囊865用作通道265和267的夾閥，而氣囊882向第二級泡形罩282和283提供輕柔的壓力，以迫使第二級泡形罩與加熱器888緊密接觸。盡管氣囊組件810設(shè)置有五個(gè)子組件，但是應(yīng)該理解，此配置僅是示例性的，并且可使用任意數(shù)量的子組件或者氣囊組件810可被設(shè)置為單個(gè)一體式組件。
[0115]圖10類似地示出儀器800操作期間氣動(dòng)閥組件808和袋210之間的關(guān)系。氣動(dòng)閥組件808具有四個(gè)氣動(dòng)活塞842、852、853和862，而非氣囊。這些各自由壓縮空氣驅(qū)動(dòng)的氣動(dòng)活塞842、852、853和862向通道242、252、253和262提供定向壓力。由于活塞的直徑相當(dāng)窄，因此它們可配合在氣囊子組件817和氣囊子組件818之間以為通道242、252、253和262提供夾閥，允許通道242、252、253和262相當(dāng)短。然而，如果需要，氣動(dòng)活塞842、852、853和862可被可包括在氣囊組件810中的氣囊替代，避免對氣動(dòng)閥組件808的需求。應(yīng)該理解，氣囊和氣動(dòng)活塞的任何組合都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。還應(yīng)該理解，本領(lǐng)域已知的在袋210的通道和泡形罩上提供壓力的其他方法在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0116]圖12示出與圖6的袋210類似的袋510。具有入口通道515a至5151的配件590類似于具有入口通道215a至2151的配件290。具有它們各自的通道538、543、552、553、562和565的泡形罩544、546、548、564和566類似于具有它們各自的袋210的通道238、243、252、253、262 和 265 的泡形罩 244、246、248、264 和 266。袋 210 的通道 245,247 和 249 在某種程度上被重新配置為袋510上的通道545a-c、547a-b和548a_c ；510的各個(gè)通道稍微短于它們在袋210上的對應(yīng)通道。然而，應(yīng)該理解，通道配置僅是示例性的，并且各種通道配置在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0117]圖12的袋510和圖6的袋210之間存在兩個(gè)主要區(qū)別。第一，三瓣式泡形罩222已被溶解泡形罩522替代。溶解泡形罩522被配置為用于經(jīng)由沖擊產(chǎn)生渦旋,該沖擊通過旋轉(zhuǎn)附接到電動(dòng)馬達(dá)19的葉片或槳葉21產(chǎn)生，如圖2b所示。由于此溶解方法不依賴于氣動(dòng)活塞上的交替壓力，因此僅示出單瓣式泡形罩。由于溶解泡形罩522僅具有單個(gè)瓣，因此通道514和536都通向溶解泡形罩522的單個(gè)瓣。應(yīng)該理解，溶解泡形罩522可用于本文描述的任何袋實(shí)施例。還應(yīng)該理解，說明性地，溶解組件810可被修改為利用被配置用于泡形罩522的單個(gè)氣囊替代氣囊子組件822的氣囊824、826和828。相反，在以上各個(gè)其他實(shí)施例中描述的三瓣式泡形罩可用于袋510。溶解泡形罩522可設(shè)置有可選的加強(qiáng)補(bǔ)片523，例如利用粘合劑或?qū)訅憾浇拥饺芙馀菪握?22的外表面。加強(qiáng)補(bǔ)片523有助于最小化由于與槳葉21反復(fù)接觸而導(dǎo)致的袋510的撕裂。圖13示出被安裝在第二支撐構(gòu)件804上的電動(dòng)馬達(dá)，例如Mabuchi RC-280SA-2865直流馬達(dá)(Chiba, Japan)。在一個(gè)說明性實(shí)施例中，馬達(dá)以 5，OOO 至 25，OOOrpm (具體地 10，000 至 20，OOOrpm,更具體地約 15，000 至 18，OOOrpm)轉(zhuǎn)動(dòng)。對于Mabuchi馬達(dá),已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7.2V為溶解提供足夠的rpm。然而,應(yīng)該理解，當(dāng)槳葉21沖擊袋510時(shí)，實(shí)際速率可稍低。根據(jù)使用的馬達(dá)和槳葉，可利用其他電壓和速率進(jìn)行溶解?？蛇x擇地，受控的少量空氣可提供到與溶解泡形罩522相鄰的氣囊。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在一些實(shí)施例中，利用一個(gè)或多個(gè)少量空氣部分地填充相鄰氣囊有助于在溶解過程期間放置和支撐溶解泡形罩。替代性地，其他結(jié)構(gòu)，例如剛性或柔順的墊圈或圍繞溶解泡形罩522的其他保持結(jié)構(gòu)，可在溶解期間用于約束袋510。
[0118]圖12的袋510和圖6的袋210之間的第二個(gè)主要區(qū)別是第二級擴(kuò)增區(qū)280的泡形罩281、282和283已被第二級擴(kuò)增區(qū)580中的高密度陣列581替代。高密度陣列581包括多個(gè)第二級井582，具體地50或更多個(gè)井，更具體地120或更多個(gè)井。具有更多個(gè)第二級井582，例如約200、約400甚至約500或更多個(gè)的實(shí)施例在本發(fā)明的范圍內(nèi)。其他配置也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可通過使井582更小、通過使陣列581的高密度更大或通過其組合來添加額外的第二級井582。對于第二級PCR，每個(gè)井可包含一對引物。應(yīng)該理解，一個(gè)或多個(gè)井可用于陽性或陰性對照。
[0119]當(dāng)井中填充有泡形罩566中的經(jīng)稀釋的第一級擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，井之間的交叉污染成為主要問題。在袋210中，通過經(jīng)由通道265的單獨(dú)分支填充每個(gè)第二級泡形罩，然后利用圖9所示的氣囊882進(jìn)行密封，來控制交叉污染。對于高密度陣列581，其中流體可填充泡形罩584中的一些或全部，也必須控制井之間的交叉污染。在一個(gè)實(shí)施例中，第二級PCR引物可共價(jià)地或非共價(jià)地結(jié)合到每個(gè)井的內(nèi)表面，因此很像PCR芯片起作用。然而，在許多實(shí)施例中，期望在不將PCR弓丨物束縛到井的情況下控制井之間的交叉污染。在來自泡形罩566的流體通過流過高密度陣列581的第一表面581a而移動(dòng)到井582的實(shí)施例中，控制井之間的交叉污染是困難的。
[0120]存在用于成功地加載第二級擴(kuò)增區(qū)580的若干期望特征。首先，期望從泡形罩566進(jìn)入的流體基本上將所有井580填充至基本相同的水平。未填充的井會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤的陰性信號。第二，期望填充井582的過程不會(huì)導(dǎo)致井中的引物漏出。從一個(gè)井中損失引物會(huì)限制該井中的PCR反應(yīng)效率并且會(huì)污染相鄰的井。第三，在井582已被填充并且開始PCR之后，期望井相對于彼此完全密封。擴(kuò)增子從一個(gè)井泄漏出來以及泄漏到另一個(gè)井會(huì)降低第一個(gè)井中的信號并升高第二個(gè)井中的信號，可能導(dǎo)致第一個(gè)井中的錯(cuò)誤陰性和第二個(gè)井中的錯(cuò)誤陽性。此外，對于某些種類的對照，重要的是在一個(gè)井中產(chǎn)生的擴(kuò)增子不會(huì)進(jìn)入其可能在其中被進(jìn)一步擴(kuò)增的另一個(gè)井。
[0121]此問題的解決方案包括使用屏障層。在一個(gè)例子中，屏障層是物理屏障，其被設(shè)置為允許快速加載井并允許相對于大量流體快速密封。在另一個(gè)例子中，使用組合的化學(xué)和物理屏障，其中，物理屏障用于密封井，并且隨后化學(xué)屏障有條件地將低聚核苷酸引物釋放到井溶液中，例如通過加熱、緩慢釋放或酶消解。井深度或至每個(gè)井的通道長度也可用于控制從井釋放試劑?？刹捎闷渌侄渭虞d高密度陣列581。
[0122]圖14示出利用物理屏障的第二級580的說明性實(shí)施例。具有井582的高密度陣列581夾在袋510的第一層518和第二層519之間。具有穿孔586的穿孔層585被設(shè)置在高密度陣列581的一側(cè)上，以用作物理屏障，并且第二層587被設(shè)置在高密度陣列581的相反側(cè)上以形成井582的底部。說明性地，穿孔層585和第二層587是已經(jīng)被密封到高密度陣列581的塑料薄膜，例如通過熱密封，但是應(yīng)該理解，可采用其他密封方法。還應(yīng)該理解，用于高密度陣列581的材料和用于穿孔層585和第二層587的材料應(yīng)該彼此兼容并且與密封方法和使用的化學(xué)過程兼容。當(dāng)用于PCR時(shí)，可用于高密度陣列581并且可被熱密封的兼容塑料的例子是PE、PP、Monprene?和其他嵌段共聚物彈性體。如果在檢測化學(xué)過程中使用熒光染料，則可能期望高密度陣列581由黑色或其他相對的熒光不透明的材料形成，以最小化從一個(gè)井582滲漏到其相鄰井的信號并且為了使層585和587中的至少一個(gè)相對地?zé)晒馔该?。對于穿孔?85和第二層587，可使用諸如Mylar?或PET的堅(jiān)固工程塑料與諸如PE、PP和Dupont Surlyn?的可熱密封塑料層的層壓構(gòu)件。對于基于粘合劑的系統(tǒng)，諸如PET或聚碳酸酯的剛性工程塑料可用于形成高密度陣列581，然后PCR兼容塑料薄膜用作穿孔層585和第二層587。在一個(gè)說明性實(shí)施例中，高密度陣列581由黑色PE形成，復(fù)合聚乙烯/PET層壓件(或Xerox? PN 104702熱層壓袋材料)用于被熱密封到高密度陣列581的穿孔層585和第二層587，并且復(fù)合聚丙烯/PET用于袋510的第一層518和第二層519。
[0123]應(yīng)該理解，穿孔586與井582對準(zhǔn)。還應(yīng)該理解，穿孔586足夠小，在缺少一定力時(shí)，流體不易流過穿孔586。說明性的穿孔可為0.001-0.1mm,更具體地0.005-0.02mm,更具體地約0.001_。在說明性實(shí)施例中，第二級擴(kuò)增區(qū)580被設(shè)置在真空下，從而使得當(dāng)從泡形罩566接收流體時(shí)，真空將流體抽吸通過穿孔586進(jìn)入每個(gè)井582。一旦井582被充滿，就不再存在迫使流體流入或流出井582的力。然后可啟用與第二級擴(kuò)增區(qū)580相鄰的氣囊(未示出，但與氣囊880/882類似地就位)，以相對于高密度陣列581按壓第一層518并將流體密封到井582中。盡管袋510的第一層518用于密封井582，但是應(yīng)該理解，可在穿孔層585和第一層518之間設(shè)置可選的密封層。
[0124]在一個(gè)說明性例子中，可如下地制備第二級擴(kuò)增區(qū)580?？赏ㄟ^首先沖孔、模制或以其他方式在塑料片(說明性地，0.1至Imm厚)中形成一陣列井582。井可形成需要的任何規(guī)則或不規(guī)則陣列，并且可具有例如0.05μ I至20μ I的體積，更具體地0.1 μ I至4μ I。然后將層585或587之一層壓到高密度陣列581的第一表面581a，例如通過熱或粘合劑。如圖15所示，穿孔層585被應(yīng)用于第一表面581a。然后，手動(dòng)地通過移液器或自動(dòng)地(例如利用可x/y定位的例如針式點(diǎn)樣器的點(diǎn)樣器、點(diǎn)陣打印機(jī)、小體積自動(dòng)移液器或微流體微接觸式點(diǎn)樣器(micro-fluidic micro-contact spotter))將試劑589 (例如該陣列的化學(xué)過程的獨(dú)特要素，諸如PCR引物對)點(diǎn)樣到井中。下面在例子4中論述用于點(diǎn)樣試劑的說明性裝置。當(dāng)每個(gè)井582中的試劑589已經(jīng)干燥之后，將第二層585或587應(yīng)用到陣列581的第二表面581b。利用一陣列小直徑針對層585進(jìn)行穿孔，以形成穿孔586?？稍趯?85已被固定到陣列581之前或之后形成穿孔586。應(yīng)該理解，可在層585上在穿孔之前或之后完成點(diǎn)樣或在層587上完成點(diǎn)樣。對具有預(yù)先穿孔的孔的陣列進(jìn)行點(diǎn)樣未顯示明顯的泄漏，并且提供以下優(yōu)點(diǎn)，即，用于穿孔的針不會(huì)由于接觸點(diǎn)樣試劑而被污染。替代性地，為了最小化泄漏的可能，并且為了將點(diǎn)樣試劑放置在陣列中最遠(yuǎn)的位置，期望將試劑589點(diǎn)樣到第二層587，利用層585密封陣列581，然后對層585進(jìn)行穿孔。在說明性例子中，利用GeSiM A060-324 Nano-Plotter 2.1/E (Grosserkmannsdorf, Germany)或以下在例子4 中論述的點(diǎn)樣器將試劑點(diǎn)樣到第二層587上。利用這種點(diǎn)樣器，可同時(shí)點(diǎn)樣多個(gè)陣列。
[0125]一旦被點(diǎn)樣和穿孔，陣列581就位于袋510的層518和519內(nèi)并被密封就位，例如通過熱密封、利用粘合劑、超聲焊接、機(jī)械封閉或?qū)㈥嚵?81封閉在袋510中泡形罩584內(nèi)的其他手段。應(yīng)該理解，泡形罩584經(jīng)由通道565流體連接到泡形罩566，并且液體可從通道565流到泡形罩584中并流過穿孔586。在一個(gè)說明性例子中，當(dāng)形成泡形罩584時(shí)，注意留出空氣逸出的路徑。這可通過在與第二級擴(kuò)增區(qū)580相鄰的第一層518的內(nèi)表面上“形成華夫格”完成，以使薄膜材料壓印有稍微突起的紋理的式樣。這使得空氣和液體可沿穿孔層585的表面穿過并且更好地使得液體可到達(dá)并填充所有井582。然后，袋510被放置在真空腔內(nèi)并被排空。說明性地，當(dāng)壓力已達(dá)到約0.3毫巴時(shí)，真空腔內(nèi)的氣動(dòng)氣缸被啟動(dòng)，將柱塞向下驅(qū)動(dòng)到配件590中以密封通道567，由此阻斷來自密封袋內(nèi)的陣列和真空腔的通道。多個(gè)其他柱塞也被驅(qū)動(dòng)到配件590中以密封多個(gè)入口通道515。袋從真空腔被取出并且可被封裝以便長期存儲(chǔ)在真空袋中。
[0126]可以與袋210類似的方式使用袋510。由于陣列581被封裝在真空那個(gè)中，因此，當(dāng)液體從泡形罩566移動(dòng)到第二級擴(kuò)增區(qū)580時(shí)，液體樣本被抽吸通過穿孔586并進(jìn)入井582中。通過在陣列上方對氣動(dòng)氣囊充氣驅(qū)走過量的液體，并且如上所述地完成熱循環(huán)，例如通過加熱和冷卻壓靠陣列一側(cè)的珀?duì)柼?br> [0127]如上所述，穿孔層585可被各種合適的物理或化學(xué)屏障替代。在利用化學(xué)屏障的一個(gè)說明性實(shí)施例中，省略穿孔層585，并且試劑589被點(diǎn)樣到井582中溶解相對緩慢的緩沖液中。說明性地，包含合適濃度的聚合物(諸如PEG、聚蔗糖、聚山梨醇酯20)或糖(諸如蔗糖、海藻糖或甘露糖醇)的試劑589將與第二級PCR反應(yīng)兼容并且可比單獨(dú)點(diǎn)樣在水或Tris/EDTA中的引物更慢地溶解。點(diǎn)樣在這些緩沖液之一中的弓I物在井582中被風(fēng)干，如上所述(應(yīng)該理解，在這種實(shí)施例中，第二層587被固定到高密度陣列581以便點(diǎn)樣)。這些相同聚合物可用于冷凍干燥酶試劑(例如在PCR中使用的酶和緩沖液)以形成包含穩(wěn)定的酶的開口基質(zhì)。因此，被點(diǎn)樣在這些緩沖液中的引物可在井582中的合適位置冷凍干燥，引起相比風(fēng)干更慢但可能更完全的復(fù)水。當(dāng)使用袋510時(shí)，來自泡形罩566的流體通過真空或壓力被驅(qū)入井中并開始溶解引物混合物。通過選擇適當(dāng)緩慢地溶解的緩沖液，當(dāng)啟用與第二級擴(kuò)增區(qū)580相鄰的氣囊時(shí)，每個(gè)井582的內(nèi)容物在發(fā)生任何實(shí)質(zhì)交叉污染之前被密封在其中。
[0128]另一個(gè)實(shí)施例采用直到第二級擴(kuò)增區(qū)580被加熱至預(yù)定溫度以上才溶解的基質(zhì)。這種基質(zhì)的一個(gè)例子是低熔點(diǎn)瓊脂糖，諸如GenePure LowMelt Agarose (ISCB1express)。在一個(gè)例子中，此瓊脂糖的5%溶液在65°C熔化并且在24_28°C膠化。在點(diǎn)樣之前，試劑589可例如升溫至50°C并且與已經(jīng)熔化的此瓊脂糖混合，然后少量地(例如，100至500nl)被點(diǎn)樣到井582中。為了在點(diǎn)樣期間保持混合物呈液態(tài)，這可能必須在被加熱至瓊脂糖的熔化溫度以上的小室中完成。替代性地，可以用移液管稀釋瓊脂糖溶液，而不需熔化。在點(diǎn)樣瓊脂糖/試劑混合物之后，干燥高密度陣列581。這可以是簡單的風(fēng)干，或者引物瓊脂糖混合物可包含以上列出的糖和聚合物，從而可以冷凍干燥試劑。當(dāng)袋510用于PCR時(shí)，當(dāng)來自泡形罩566的流體移動(dòng)到高密度陣列581時(shí)，第二級擴(kuò)增區(qū)580可被加熱至例如55°C。在此溫度下，瓊脂糖未熔化，因此引物未被釋放到溶液中。一旦高密度陣列581被充滿，就使相應(yīng)的氣囊充氣以密封井。當(dāng)在第一 PCR循環(huán)的第一變性步驟中溫度升高至65°C以上時(shí)，包含引物的瓊脂糖熔化，將引物釋放到混合液中。說明性地，熱循環(huán)從不降低到60°C (或瓊脂糖的其他熔化溫度)以下，使得瓊脂糖在熱循環(huán)期間不會(huì)膠化。此外，在圖8的說明性儀器800中，通過位于袋一側(cè)上的加熱器888進(jìn)行反復(fù)的溫度循環(huán)。預(yù)期橫跨井582中的PCR溶液通常存在溫度梯度，這應(yīng)當(dāng)通過對流的流體流有助于引物的混合。在類似實(shí)施例中也可以使用蠟。
[0129]在另一實(shí)施例中，引物可有條件地結(jié)合到井581，在井581已被充滿之后隨即將引物釋放到溶液中。根據(jù)引物如何附接到塑料基板上，可利用熱(例如在PCR反應(yīng)的第一個(gè)循環(huán)期間)、光(例如通過窗口 847輻射的光)、化學(xué)品(例如，雙硫腙連同熱將降低可以用于將引物聯(lián)結(jié)到井的二硫鍵)或酶(例如，位點(diǎn)特異性蛋白酶，諸如Tissue PlasminogenActivator，可用于使將引物附接到基板的合適的連接肽裂開)使引物裂開。
[0130]在另一實(shí)施例中，在擴(kuò)增之后，脫氧核糖核酸酶可以被注入第二級擴(kuò)增區(qū)580，以進(jìn)一步最小化任何潛在的污染風(fēng)險(xiǎn)。
[0131]應(yīng)該理解，本文已經(jīng)描述了用于與PCR使用的第二級擴(kuò)增區(qū)580。然而，袋510和第二級擴(kuò)增區(qū)580的其他用途在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，應(yīng)該理解，可以在具有或不具有核酸提取物和第一級PCR擴(kuò)增區(qū)的情況下使用第二級擴(kuò)增區(qū)580。最后，應(yīng)該理解，第二級擴(kuò)增區(qū)580可與本文描述的任何袋實(shí)施例一起使用。
[0132]例子1:巢式多重PCR
在為袋110配置的與儀器800類似的儀器上，在圖5的袋110中進(jìn)行一組反應(yīng)。為了示出細(xì)胞溶解和兩級核酸擴(kuò)增的有效性，在對數(shù)期將各50 μ L的釀酒酵母和粟酒裂殖酵母的活培養(yǎng)菌與來自健康捐獻(xiàn)者的100 μ L鼻咽抽出物樣本混合以形成樣本,然后與200 μ L溶解緩沖液(6Μ鹽酸胍、15%TritonX 100，3M醋酸鈉)混合。然后，將溶解緩沖液中的400 μ L樣本中的300 μ L注入袋110的腔192a。
[0133]袋110被制造為具有被密封在三瓣式泡形罩122中的0.25g ZS珠。如下所述，在制造袋110期間第二級引物也被點(diǎn)樣到泡形罩181和182中。袋110被加載如下:
115a樣本和溶解緩沖液，如上所述，
115b在溶解緩沖液中的磁珠，
115d-e沖洗緩沖液(1mM檸檬酸鈉)
115g 洗提緩沖液(1mM Tris,0.1mM EDTA),
115h第一級PCR緩沖液:
0.2mM dNTP
0.3μΜ每個(gè)引物:
Scl:被配置為用于擴(kuò)增結(jié)合到RNA并結(jié)合到釀酒酵母的ΜΕΧ67ρ的YRAl核酸蛋白質(zhì)的一部分的引物。所述引物被配置為橫跨內(nèi)含子進(jìn)行擴(kuò)增，從而使得cDNA (經(jīng)由M-MLV逆轉(zhuǎn)錄的mRNA)的擴(kuò)增產(chǎn)生180bp擴(kuò)增子。
Sc2:被配置為用于擴(kuò)增釀酒酵母的MRKl糖原合成酶激酶3 (GSK-3)同源物的cDNA的121bp區(qū)域的引物。
Sc3:被配置為用于擴(kuò)增釀酒酵母的RUBl泛素樣蛋白的cDNA的213bp區(qū)域的引物。Spl:被配置為用于擴(kuò)增粟酒裂殖酵母的sucl依賴細(xì)胞周期蛋白的蛋白激酶調(diào)節(jié)亞基的cDNA的200bp區(qū)域的引物。
Sp2:被配置為用于擴(kuò)增粟酒裂殖酵母的secl4胞質(zhì)體因子家族的cDNA的180bp區(qū)域的引物。
具有3mM 1%(:12的PCR緩沖液(不具有BSA) 50 單位 M-MLV 4.5單位Taq:抗體 100單位重組核糖核酸 115j-k第二級PCR緩沖液 0.2mM dNTP
IX LC Green? Plus (Idaho Technology)
具有2mM 1%(:12的PRC緩沖液(具有BSA)
4.5單位Taq
1151具有第一級擴(kuò)增子的樣本的第二級PCR緩沖液。
[0134]在制造期間，第二級泡形罩181和182被點(diǎn)樣有巢式第二級引物。每個(gè)泡形罩被點(diǎn)樣有一個(gè)引物對，引物對的量在利用第二級PCR緩沖液復(fù)水時(shí)產(chǎn)生約0.3 μ M的最終濃度。第二級巢式引物如下:
Scl:被配置為用于擴(kuò)增Scl cDNA第一級擴(kuò)增子的80bp部分的引物。
Sc2:被配置為用于擴(kuò)增Scl cDNA第一級擴(kuò)增子的121bp部分的引物。
Sc3:被配置為用于擴(kuò)增Scl cDNA第一級擴(kuò)增子的93bp部分的引物。
Spl:被配置為用于擴(kuò)增Scl cDNA第一級擴(kuò)增子的99bp部分的引物。
Sp2:被配置為用于擴(kuò)增Scl cDNA第一級擴(kuò)增子的96bp部分的引物。
[0135]對于任何靶，第一級和第二級引物對之間都不存在重疊。每對引物被點(diǎn)樣到一個(gè)陰性對照泡形罩181和兩個(gè)第二級泡形罩182中，使得每個(gè)第二級擴(kuò)增運(yùn)行兩次，并且每個(gè)復(fù)制品具有陰性對照。
[0136]在加載之后，與入口通道115a相關(guān)聯(lián)的柱塞的啟用將樣本移動(dòng)到三瓣式泡形罩122、與入口通道115b相關(guān)聯(lián)的柱塞的啟用將磁珠移動(dòng)到儲(chǔ)存器101，與入口通道115d-e相關(guān)聯(lián)的柱塞的啟用將沖洗緩沖液移動(dòng)到儲(chǔ)存器102和103，與入口通道115g相關(guān)聯(lián)的柱塞的啟用將洗提緩沖液移動(dòng)到儲(chǔ)存器104，與入口通道115h相關(guān)聯(lián)的柱塞的啟用將第一級PCR緩沖液移動(dòng)到儲(chǔ)存器105，與入口通道115j-k相關(guān)聯(lián)的柱塞的啟用將第二級PCR緩沖液移動(dòng)到儲(chǔ)存器106和107，以及與入口通道1151相關(guān)聯(lián)的柱塞的啟用將陽性對照物(具有預(yù)先制備的第一級擴(kuò)增子的第二級PCR緩沖液)移動(dòng)到儲(chǔ)存器108。在此例子中，在將袋110加載到儀器中之前，按壓與入口通道115a和115b相關(guān)聯(lián)的柱塞。在運(yùn)行期間按順序按壓儀器中的所有其他柱塞，并且根據(jù)需要將流體移動(dòng)到儲(chǔ)存器102至108。
[0137]—旦袋110被放置到儀器中，就在存在ZS珠的情況下敲擊10分鐘，如上所述。一旦細(xì)胞溶解完成，就壓縮儲(chǔ)存器101并且迫使來自儲(chǔ)存器101的核酸結(jié)合磁珠進(jìn)入三瓣式泡形罩122，其中，輕柔地混合珠并允許培養(yǎng)5分鐘。
[0138]然后將樣本-珠混合物移動(dòng)到泡形罩144，在該處，經(jīng)由啟用磁體俘獲磁珠。一旦磁體伸展，就對與泡形罩144相鄰的氣囊加壓，以迫使流體返回三瓣式泡形罩122。然后利用來自儲(chǔ)存器102和103的沖洗溶液如上所述地沖洗被俘獲的珠。在沖洗之后，經(jīng)由啟用磁體再次俘獲珠在泡形罩144中，并且將存儲(chǔ)在儲(chǔ)存器104中的洗提緩沖液移動(dòng)到泡形罩144，在該處，在2分鐘的培養(yǎng)之后，隨后將從珠洗提的核酸移動(dòng)到泡形罩161，如上所述。
[0139]在泡形罩161中，核酸樣本與來自儲(chǔ)存器105的第一級PCR混合液混合。然后使樣本保持處于40°C下10分鐘(在此期間M-MLV將mRNA轉(zhuǎn)化為cDNA)，之后保持處于94°C下2分鐘(以使M-MLV失活并從taq去除抗體)。然后熱循環(huán)是20個(gè)循環(huán)的94°C下10秒和65。。下 20 秒。
[0140]在第一級擴(kuò)增之后，利用來自儲(chǔ)存器106的第二級PCR混合液將樣本稀釋約100倍。然后將樣本移動(dòng)到如上所述地預(yù)先被點(diǎn)樣有第二級引物的泡形罩182。第二級PCR緩沖液從儲(chǔ)存器181被移動(dòng)到陰性對照泡形罩181，并且陽性對照混合物從儲(chǔ)存器108被移動(dòng)到泡形罩183。樣本在94°C下變性30秒，然后擴(kuò)增94°C下5秒和69°C下20秒的45個(gè)循環(huán)。
[0141]如圖11中可見，所有靶擴(kuò)增子和陽性對照顯示擴(kuò)增，而陰性對照都未顯示擴(kuò)增。每個(gè)樣本被復(fù)制。復(fù)制品各自顯示類似的擴(kuò)增(數(shù)據(jù)未示出)。
[0142]應(yīng)該理解，釀酒酵母和粟酒裂殖酵母靶僅是說明性的，并且其他靶在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0143]例子2:高密度PCR
以上例子使用圖5的袋110。袋110具有5個(gè)陰性對照泡形罩181、5個(gè)陽性對照泡形罩183和10個(gè)小體積樣本泡形罩182。圖6的袋210將小體積樣本泡形罩282的數(shù)量增加至18個(gè)。然而，圖12所示的袋510的高密度陣列581可具有120個(gè)或更多個(gè)第二級井582。第二級反應(yīng)數(shù)量的這種增加使得可進(jìn)行寬泛組的可能性診斷和人物識別應(yīng)用，而不需要增大袋及其儀器的尺寸。這里描述了各種例子。
[0144]在一個(gè)例子中，已知用于常見的呼吸道病毒的標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)熒光免疫化驗(yàn)?zāi)軌驒z測七種病毒:腺病毒、PIV1、PIV2、PIV3、RSV、流感A和流感B。更完整的組(panel)說明性地將可包括對于另外五種病毒的化驗(yàn):冠狀病毒、人類偏肺病毒、博卡病毒、鼻病毒和非HRV腸病毒。對于高度可變病毒，諸如腺病毒或HRV，期望使用多個(gè)引物以針對病毒譜系的所有分支(例如，分別4個(gè)外部和4個(gè)內(nèi)部引物組)。對于其他病毒，諸如冠狀病毒，存在不隨季節(jié)交替改變的4個(gè)不同譜系(229E、NL63、0C43、HKU1)，但是它們差異足夠大，以致需要單獨(dú)的引物組。說明性的完全的呼吸道病毒組還針對SARS冠狀病毒，可能針對禽流感HA和N子類并且可能針對其他。最后，一些呼吸道病毒示出這種高速率的順序變化，這將有益于對每個(gè)這種病毒產(chǎn)生多于一個(gè)巢式PCR化驗(yàn)，由此最小化引物作用下由順序變化導(dǎo)致的錯(cuò)誤陰性結(jié)果的機(jī)會(huì)。當(dāng)包括本文描述的所有引物組時(shí)，在第二級擴(kuò)增中，這種呼吸道病毒組可具有80個(gè)或更多個(gè)特異性擴(kuò)增子。高密度陣列581可容易地將這種組容納在單個(gè)袋510中。
[0145]袋510的高密度陣列581的第二個(gè)應(yīng)用將是確定從受感染患者隔離出的多種耐藥細(xì)菌的特性和耐抗生素范圍。目前的方法需要培養(yǎng)組織若干天并根據(jù)經(jīng)驗(yàn)測試各個(gè)耐藥性概況。在等待結(jié)果期間，醫(yī)生將通常開出寬范圍的抗生素，這導(dǎo)致增加多種耐藥細(xì)菌。PCR引物已被研制用于檢測耐抗生素性的基因確定因素(耐抗生素性基因自身)。然而，由于這些基因中的一些的大量變異體，需要大量擴(kuò)增子來完全確定耐性概況。Hujer等人描述了一組62個(gè)PCR化驗(yàn)，用以識別不動(dòng)桿菌分離菌中存在的耐性基因。同樣，高密度陣列581可容易地將這種組容納在單個(gè)袋中。
[0146]高密度陣列的使用的第三個(gè)例子是人物識別領(lǐng)域，例如用于遺體法醫(yī)學(xué)鑒定和親子鑒定。人物識別的大部分市場由分析短串聯(lián)重復(fù)序列(STRs)的系統(tǒng)占據(jù)。此分析通常需要利用例如毛細(xì)管電泳根據(jù)尺寸分離重復(fù)序列。用于此目的的專用實(shí)驗(yàn)室設(shè)備通常不是實(shí)地便攜式的。人們對利用單核苷酸多態(tài)性(SPN)進(jìn)行識別測試越來越感興趣，因此存在大量用于識別SPN的技術(shù)并且這些技術(shù)中的一些能夠?qū)嵉厥褂?。Sanchez等人已經(jīng)出版了一組52個(gè)良好特征化的SNP，這共同使得兩個(gè)人偶然匹配的概率非常低(平均匹配概率至少為5.0X 10_19)。在實(shí)踐中，每個(gè)SNP需要兩個(gè)擴(kuò)增子以準(zhǔn)確地確定每個(gè)基因座的類型(見例如Zhou等人)。因此，具有104個(gè)第二級井582的一個(gè)袋510可完全地測定一個(gè)人的所有52個(gè)SNP基因座的類型。
[0147]應(yīng)該理解，通過將不同診斷應(yīng)用的化驗(yàn)結(jié)合到一個(gè)袋中可獲得成本和工作流程上的優(yōu)點(diǎn)。例如，完整的呼吸道病毒組可與細(xì)菌識別組結(jié)合。這些結(jié)合可簡化制造，因?yàn)榻M裝的袋的種類較少。這還可簡化最終使用者的工作，因?yàn)樾枰獌?chǔ)備在診所的袋的特定種類較少，并且還降低對于特定臨床樣本使用錯(cuò)誤的袋的可能。對于一些應(yīng)用，這些優(yōu)點(diǎn)可補(bǔ)償制造具有更多數(shù)量的引物對的袋的成本。因此，具有100個(gè)或更多個(gè)第二級井582的一個(gè)袋510可用于容納多個(gè)化驗(yàn)組。
[0148]例子3:過程對照
對高度多重化驗(yàn)的對照可存在很多問題，尤其是在品質(zhì)必須與每個(gè)測試的成本競爭的臨床診斷設(shè)施中。袋510的高密度陣列582可能加劇此問題，因?yàn)榭稍趩蝹€(gè)運(yùn)行中化驗(yàn)的診斷靶的數(shù)量增加。這里論述各種類型的對照。
[0149]說明性的過程對照包括將完整的組織，例如包含RNA靶的組織，混合到患者樣本中(在將樣本注入袋中之前)。這種靶可以是完整的RNA噬菌體(MS2或Qi3 )或完整的植物RNA病毒(煙草花葉病毒)或存在于完整的酵母中的mRNA。專用于RNA靶的外部引物將存在于第一級PCR中，并且包含內(nèi)部引物的井582將存在于高密度陣列中。對此井582中的擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測確認(rèn)過程的所有步驟正確地運(yùn)作。后第二級擴(kuò)增熔解曲線也可用于核實(shí)制成正確的特定產(chǎn)物。根據(jù)擴(kuò)增曲線確定的交叉點(diǎn)(“Cp”)可用于定量測量試劑的完整性。例如，Cp可與來自在不同時(shí)刻運(yùn)行的相同批的其他的袋的Cp相比較。盡管使用了完整的組織，但是應(yīng)該理解，如果測試溶解不重要的話，可使用提純的或分離出的核酸。在其他情形中，可能期望僅利用對照組測試分析的后面步驟。例如，將天然或合成核酸模板與同類引物一起加入高密度陣列的井中可用于測試第二級PCR反應(yīng)，并且將核酸模板加入具有第一級PCR擴(kuò)增混合物中的合適引物的第一級PCR和第二級擴(kuò)增反應(yīng)區(qū)的井582中將測試第一和第二級PCR反應(yīng)兩者。
[0150]如上所述的過程對照組不測試靶擴(kuò)增子專用的引物的完整性。測試特異性引物的完整性的陽性對照的一個(gè)例子使用核酸混合物，例如合成RNA，因?yàn)橥ǔ？筛玫乜刂品€(wěn)定性和可變性并且這些序列由于環(huán)境污染而不能存在，其中，混合物包含用于存在于特定袋中的每個(gè)引物的核酸。在診斷設(shè)施中，此陽性對照可在用于測試患者樣本的袋的運(yùn)行的結(jié)束處使用?；旌衔锟杀蛔⑷氪?，例如從與用于患者樣品批相同的批，并且由所有靶擴(kuò)增子都提供陽性結(jié)果來定義成功。陰性對照可以用相同方式完成；在用于測試患者樣本的袋的運(yùn)行的結(jié)束處，可將水或緩沖液注入袋中，并且由所有靶擴(kuò)增子都提供陰性結(jié)果來定義成功。
[0151]診斷實(shí)驗(yàn)室中的各個(gè)工作流程和規(guī)程可用于確定在運(yùn)行上述對照袋之前運(yùn)行的患者樣本袋的數(shù)量。無論對比袋頻繁或不頻繁地運(yùn)行，這些對照組增加了總系統(tǒng)的時(shí)間和成本。為此，在袋內(nèi)進(jìn)行對照將是有用的。高密度陣列581的結(jié)構(gòu)允許用于陰性對照的以下新穎方法。在本例子中，核酸，例如，合成擴(kuò)增子，被加入高密度陣列581的井之一 582a中。擴(kuò)增此序列的引物被加入此井582a并被加入橫跨陣列間隔開的另外兩個(gè)井582b和582c中。說明性地，擴(kuò)增子序列和引物是人造的并被設(shè)計(jì)為使得使用的引物都不會(huì)偶然擴(kuò)增另一靶。
[0152]當(dāng)干凈的未被污染的袋510在儀器800中運(yùn)行時(shí)，包含合成靶的井582a將產(chǎn)生擴(kuò)增子并由此被稱作陽性。包含相應(yīng)的引物的另外兩個(gè)井582a、582b不應(yīng)該擴(kuò)增樣本中的任何東西并因此被稱作陰性。為了額外的對照，可進(jìn)一步處理袋510。說明性地，然后對使高密度陣列靠著加熱器888的氣囊880/882減壓，并混合井582的內(nèi)容物。在一個(gè)說明性方法中，如下混合井582的內(nèi)容物:加熱器888用于將高密度陣列的溫度短時(shí)間地循環(huán)到緩沖液的沸點(diǎn)以上和以下(例如，85°C 10秒、然后105°C 20秒的三個(gè)循環(huán))。在高密度陣列581的井582中產(chǎn)生的蒸汽泡應(yīng)該迫使井582的內(nèi)容物進(jìn)入第二級擴(kuò)增區(qū)泡形罩580?？蛇x擇地，通過利用氣囊將液體從袋510的一端移動(dòng)到另一端，第二級擴(kuò)增區(qū)580的內(nèi)容物可與袋510的剩余內(nèi)容物混合。這些步驟的目的是將特異性污染對照擴(kuò)增子與貫穿袋的任何特異性靶擴(kuò)增子混合在一起。
[0153]如果在袋已經(jīng)以此方式運(yùn)行之后使用者意外地打開袋，則將釋放特異性靶擴(kuò)增子和污染對照擴(kuò)增子兩者。如果微量的這種核酸污染之后的袋運(yùn)行，則儀器可檢測到污染事件，因?yàn)閮H包含專用于合成擴(kuò)增子的引物的井582b、582c將被記作陽性。儀器中的軟件將警告使用者并且運(yùn)行結(jié)果將被標(biāo)注為疑似。
[0154]在對照污染的另一方法中，在運(yùn)行結(jié)束時(shí)，可添加DNA降解化學(xué)品或酶以破壞第一和第二級PCR反應(yīng)的幾乎所有DNA產(chǎn)物。說明性地，這可通過與上述污染檢測方法類似的方法完成，即，通過將第二級陣列的內(nèi)容物加熱至局部沸點(diǎn)溫度以上，由此將擴(kuò)增樣本從陣列851的井582中抽出，將加熱的液體與第一級反應(yīng)的稀釋內(nèi)容物混合，添加一等份DNA降解物質(zhì)(例如通過入口通道515k)，冷卻或不冷卻混合物，以及允許培養(yǎng)DNA降解反應(yīng)物直到PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的幾乎所有DNA都被破壞。如本領(lǐng)域已知的，這可利用脫氧核糖核酸酶、酸或氧化劑來實(shí)現(xiàn)。
[0155]應(yīng)該理解，在此描述的污染對照組中的任一個(gè)可單獨(dú)地或以其任意組合使用。
[0156]例子4:陣列加載
圖16示出高密度陣列的另一實(shí)施例。高密度陣列681的配置與高密度陣列581的配置類似。在此說明性實(shí)施例中，高密度陣列681設(shè)置有布置為圓形圖案的102個(gè)二級井682。如圖所示，陣列681還設(shè)置有固定到其上的層687，層687類似于上述第二層587，但是陣列681未設(shè)置穿孔層。盡管陣列681是用于本例子的說明性陣列，但是應(yīng)該理解，陣列581和其他布置的高密度陣列在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0157]如上所述，商用點(diǎn)樣器，諸如GeSiM A060-324 Nano-Plotter 2.1/E(Grosserkmannsdorf, Germany),可用于加載高密度陣列581。替代性地,可利用可x/y定位的點(diǎn)樣器，諸如針式點(diǎn)樣器、點(diǎn)陣打印機(jī)、小體積自動(dòng)移液器或微流體微接觸式點(diǎn)樣器，點(diǎn)樣高密度陣列681。
[0158]圖17-19示出說明性的點(diǎn)樣器600。點(diǎn)樣器600設(shè)置有底座601。泵陣列620附接到底座601。加載陣列630與泵陣列620相鄰。說明性的加載陣列630被配置為接收96個(gè)井的板，但其他板配置在本公開的范圍內(nèi)，包括384個(gè)井的板、1536個(gè)井的板和其他配置的板。還應(yīng)該理解，其他配置的一個(gè)或多個(gè)小瓶或儲(chǔ)存器可用于提供待點(diǎn)樣的流體。如在圖19中最佳可見的，說明性的96個(gè)井的板636位于加載平臺(tái)635上，96個(gè)井的板636遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)微量滴定板，以提供用于點(diǎn)樣多個(gè)陣列的較大儲(chǔ)存器。但是，如圖20所示，可使用標(biāo)準(zhǔn)的96個(gè)井的板。加載平臺(tái)635可以通過臂634的動(dòng)作升高或降低。
[0159]在圖19中，示出板636處于降低位置。在此位置，板636的頂部633不與吸管641的尖端642接觸或重疊，允許容易地插入和移出板636。如圖20所示，加載平臺(tái)635處于升高位置。多個(gè)吸管638延伸通過支撐件640并進(jìn)入板636的每個(gè)井637。吸管638是從支撐件640上方延伸到每個(gè)井637底部的管子。在說明性實(shí)施例中，吸管638是25 口徑不銹鋼。然而，可使用與待點(diǎn)樣到陣列681的流體兼容的任何材料。優(yōu)選地，用于吸管638的材料是剛性的或半剛性的，以便延伸到井637的底部，從而幾乎可使用板636中的所有流體。為了幫助使用盡可能多的流體，以一定角度切割每個(gè)吸管638的尖端642，以防止吸管638相對于井637密封。說明性地，可以以30-60°角，更具體地以45°角，切割尖端642，但是應(yīng)該理解，角度的選擇可取決于井637的形狀。例如，如果井637具有平坦底部，則顯著小于30°的角度可能是有用的，而大體圓錐形的井637可需要更大的角度。替代性地，在相對于井637密封是成問題的這些配置中，尖端642可具有凹口或凹槽，或者可設(shè)置有不與井637的底部一致的任何形狀。
[0160]每個(gè)吸管638向上延伸通過其各自的在支撐件640中的孔口 641。如在說明性實(shí)施例中示出，孔口 641被配置為與井637對準(zhǔn)，并且每個(gè)孔口的尺寸形成為允許吸管638在孔口 641內(nèi)自由移動(dòng)。重物639被固定到每個(gè)相應(yīng)吸管638的頂部。每個(gè)重物639相對于井637的底部偏壓尖端642。在所示實(shí)施例中使用圓柱形黃銅重物。然而應(yīng)該理解，這僅是說明性的并且可使用其他形狀和材料。期望重物639的尺寸大于孔口 641，從而使得當(dāng)移除板636時(shí)重物639靜置在支撐件640上并保持每個(gè)相應(yīng)吸管638就位，以當(dāng)下一個(gè)板升高就位時(shí)進(jìn)入其各自的井。
[0161]在說明性實(shí)施例中，每個(gè)吸管638延伸通過其各自的重物639并連接到柔性管644。然而應(yīng)該理解，吸管638和管644可在重物639正下方或其內(nèi)連接，或者吸管638可將成分從更硬材料改變?yōu)楦洸牧?。說明性地，管644是內(nèi)徑為0.012英寸、外徑為0.025英寸的彈性體材料，例如硅酮或聚氨酯。然而應(yīng)該理解，根據(jù)具體應(yīng)用，可使用其他尺寸的各種材料。說明性地，柔性管644是彈性體材料，但足夠柔韌而不會(huì)破裂或破碎的其他材料在本公開的范圍內(nèi)。
[0162]如在圖17中最佳可見的，多個(gè)管644延伸通過平行布置的泵陣列620，并延伸到打印頭660。圖21示出泵陣列620的橫截面圖，其中第一氣動(dòng)密封件623更靠近加載陣列630放置，并且第二氣動(dòng)密封件624更靠近打印頭660放置。管644被夾在頂部支撐件621和底部支撐件622之間。底部支撐件設(shè)置有三個(gè)氣動(dòng)元件。第一氣動(dòng)密封件623和第二氣動(dòng)密封件624操作作為管644上的夾閥，以根據(jù)需要打開和關(guān)閉管644，從而允許流體從井637流過管644達(dá)到打印頭660。蠕動(dòng)泵626設(shè)置有稍微偏離由虛線631指示的機(jī)械中心的泵頭625，由此沿打印頭方向壓迫流體，尤其是當(dāng)密封件623關(guān)閉并且密封件624打開時(shí)?？蛇x擇地，可以以一定角度(未示出)設(shè)置泵626，從而使得泵頭625首先與更靠近密封件623的管644接觸，由此朝向密封件624壓迫流體。在圖17中最佳可見的，開口 627、628和629連接到管子612、613、614，然后管子612、613、614連接到壓縮氣體源616。壓縮氣體源616可以是壓縮機(jī)，或替代性地，壓縮氣體源616可以是壓縮氣體氣缸。彈簧(未示出)可用于沿與壓縮氣體源移動(dòng)方向相反的方向偏壓密封件和泵頭，由此使得管可以在較小阻力下恢復(fù)其初始形狀。在說明性實(shí)施例中，需要約50psi或更小來調(diào)節(jié)合適量的流體。在說明性實(shí)施例中，通過單個(gè)蠕動(dòng)泵626同時(shí)泵送所有管644中的流體，由此通過每個(gè)管644移動(dòng)基本相同量的流體。在說明性實(shí)施例中，管644對準(zhǔn)為平行布置，并且密封件623和624以及泵626沿直線布置。然而，其他布置在本公開的范圍內(nèi)。
[0163]應(yīng)該理解，通過管644流到打印頭660的流體的量將由管644的直徑、泵頭625的寬度和泵626施加在管644上的壓力大小確定。調(diào)節(jié)這些參數(shù)在本公開的范圍內(nèi)。此外，通過本領(lǐng)域已知的其他裝置(例如輥、液壓泵、機(jī)電泵及其他計(jì)量供給裝置)泵送流體通過管644在本公開的范圍內(nèi)。
[0164]打印頭660設(shè)置有與高密度陣列681中的102個(gè)井682對準(zhǔn)的102個(gè)位置662。每個(gè)管644連接到一個(gè)位置662。96個(gè)井的板636是96個(gè)井637的矩形陣列，而高密度陣列681是102個(gè)井682的大體圓形陣列。通過將柔性管子用于管644，可布置僅通過將特定管644固定到打印頭660中的特定位置而將來自板636中任何井637的流體傳送到高密度陣列681中的任何井682。如圖17-18所示，具有96個(gè)管644，使打印頭660上的六個(gè)位置662是空的。當(dāng)流體被傳送到陣列681時(shí)，六個(gè)井682將仍是空的，見圖18中的六個(gè)未填充井682。然而應(yīng)該理解，若干吸管638可附接到單個(gè)重物639，從而使得板636中的一個(gè)井637為打印頭660上的多于一個(gè)位置供料。如果在陣列681中運(yùn)行兩次或三次反應(yīng)，則科期望在板636的每個(gè)井637中放置兩個(gè)或三個(gè)吸管638，但是在板636中使用更少的井637。應(yīng)該理解，具有102個(gè)井的板可用于傳送流體通過吸管638。重新配置在本公開的范圍內(nèi)，并且當(dāng)點(diǎn)樣器600用于多個(gè)不同的陣列681時(shí)，可期望進(jìn)行重新配置。此外，應(yīng)該理解，打印頭660和相應(yīng)的陣列681的配置僅是說明性的，并且打印頭和陣列的其他配置在本公開的范圍內(nèi)，只要打印頭與部分或所有陣列基本對準(zhǔn)。例如，如圖15所示，與陣列581對準(zhǔn)的打印頭將在本公開的范圍內(nèi)。此外，對于井非常小的密度非常高的陣列，不能形成足夠小的以致在打印頭上時(shí)不接觸的滴。在這種情形中，可能期望使用兩個(gè)或更多個(gè)打印頭，并使用每個(gè)打印頭加載陣列的單個(gè)部分。
[0165]如在圖19中最佳可見的，每個(gè)管644延伸通過打印頭660，從而使得每個(gè)管終止于打印頭660正下方的孔口 645中。在說明性實(shí)施例中，一小段金屬管子被設(shè)置在每個(gè)管644的端部處，其可以或可以不延伸通過打印頭660，以提供此孔口 645，例如與吸管638所使用的管子相同的金屬管子。說明性地，孔口 645的端部643被拋光為平坦光滑的表面，由此反射光并有助于顯示滴692，如下所述。在說明性實(shí)施例中，使用250微米的孔口，其尺寸形成為用以提供足夠的表面張力，以形成和支撐0.1至10.0 μ I，更具體地0.5至1.0 μ I的流體滴。然而，這僅是示例性的并且其他尺寸的孔口和滴在本公開的范圍內(nèi)。在圖27所示的替代實(shí)施例中，每個(gè)管644a可終止于打印頭660a處或其內(nèi)，并且打印頭660a可設(shè)置有突起677a，突起677a說明性地與打印頭主體一體形成。突起677a可被涂成黑色或其他顏色或者可設(shè)置有金屬涂層，以有助于顯示滴?？卓?645a可由能夠傳導(dǎo)所傳送的流體的材料制成或涂覆有這種材料。例如，如果流體含水，則可以使用由疏水材料制成的打印頭。在一個(gè)說明性實(shí)施例中，打印頭660a可由Teflon?制成或可由具有Tef1n?涂層的另一種材料制成，諸如不銹鋼。這類材料可用于孔口被設(shè)置在打印頭本身上的實(shí)施例中(圖27)，或每個(gè)管644延伸通過打印頭660的實(shí)施例中(圖19)，以減少向打印頭660傳送的流體。此夕卜，如圖25所示，可設(shè)置脫離子器680以減少靜電作用并有助于從打印頭660傳送滴。
[0166]在操作泵626時(shí)，流體從板636的井637移出，從而在經(jīng)由管644連接到其井637的每個(gè)孔口處形成滴692。如在圖17中最佳可見的，設(shè)置成像系統(tǒng)，例如包括光源和照相機(jī)。設(shè)置用以照亮滴692的光源672，例如高入射的燈，但可使用其他配置。例如被安裝在底座601中的開口 668正下方的照相機(jī)670對滴692進(jìn)行成像。圖22是打印頭660的底部表面661的顯示器695 (如圖26所示)上提供的屏幕截圖，示出了附著到與管644附接的96個(gè)孔口中的每個(gè)的滴692。由于在打印頭660上有102個(gè)位置662，并且說明性例子中每個(gè)井637僅使用一個(gè)吸管638，因此六個(gè)位置662沒有滴692，示出六個(gè)管孔口 645。其余96個(gè)孔口被它們各自的滴692阻擋。圖23類似于圖22，只是缺少二十個(gè)滴，如空位置691所示，展示了額外二十個(gè)管孔口。
[0167]照相機(jī)670連接到處理器694 (見圖26)，處理器694被編程以確定所有滴692是否足夠，例如通過估計(jì)體積(4/3 π r3)并與可接受體積范圍比較。編程還可包括檢測會(huì)使滴不足的氣泡。在一個(gè)說明性實(shí)施例中，可按以下步驟對處理器進(jìn)行編程:
(O向照相機(jī)670發(fā)信號以獲得滴形成之前打印頭的圖像，
(2)核查圖像以確保打印頭660上不存在滴，
(3)如果存在微滴，則軟件通知使用者，否則向點(diǎn)樣器發(fā)出信號以產(chǎn)生滴692，
(4)向照相機(jī)670發(fā)信號以獲得具有滴692的打印頭的第二個(gè)圖像，
(5)核查圖像以確保滴692的位置和尺寸合適，
(6)如果步驟(5)中的滴692經(jīng)核查不合格，則軟件通知使用者，否則向點(diǎn)樣器600發(fā)信號以打印陣列681，
(7)在打印陣列681之后，軟件向照相機(jī)670發(fā)信號以獲得沒有滴的打印頭660的第三個(gè)圖像，
(8)核查圖像以確保打印頭660上不存在滴，
(9)軟件通知使用者每個(gè)步驟(8)的核查情況。
[0168]用于在步驟2、5和8中核查滴存在和不存在的圖像分析依賴標(biāo)準(zhǔn)二進(jìn)制閾值技術(shù)。
[0169]作為步驟5中核查滴信息的一部分，在一個(gè)說明性實(shí)施例中，分析圖像以確定每個(gè)滴的位置和直徑(以像素計(jì))。軟件核查每個(gè)滴的中心位置在孔口 641的中心的規(guī)定距離內(nèi)。接著，軟件確定每個(gè)滴的半徑并核查這些大于下閾值以確保每個(gè)井中存在的引物量足以進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且小于上閾值以確保微滴不會(huì)沉積在陣列681的靶井682之外。下閾值和上閾值可以是1%、2%、5%、10%、15%,20%或從應(yīng)用中可接受的滴提供一定范圍的流體的任何其他百分比。
[0170]作為步驟5中滴形成的替代核查方案，當(dāng)成像時(shí)可掩蔽滴，每個(gè)滴具有圓形掩模。使用掩模而不利用半徑作為標(biāo)準(zhǔn)。如果滴完全填充圓并且不超出圓，則滴合格。如果滴未完全填充圓或超出圓的尺寸，則滴不合格。選擇圓的線條的寬度以提供閾值，較粗的圓線條提供較大的范圍，較細(xì)的圓線條提供較小的范圍。
[0171]替代性地，視覺觀察圖像可用于確定是否所有滴692都足夠。如果所有滴692都足夠，則可被傳送到陣列681。可能期望在流體中包括彩色或熒光染料，以幫助顯影。替代性地或額外地，可拋光孔口 641的端部643以反射光和幫助顯影。如果熒光染料用于PCR檢測，則可能期望顯影該染料或使用不與PCR的熒光相干擾的另一種顯影染料。例如，LCGreen?Plus可用于PCR檢測，而IRDye? (Licor, Lincoln, Nebraska)可用于滴顯影。本領(lǐng)域已知其他染料?？蛇x擇地，在傳送之后可對打印頭660、陣列681或兩者顯影，以確定是否已經(jīng)從打印頭660傳送了來自每個(gè)滴692的足夠量。
[0172]如果滴692由于不滿足預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)而不足夠，則滴可被傳送到陣列681，如上所述，但可丟棄陣列681。替代性地，可通過吸除或其他方式從打印頭660移除不足夠的滴692。
[0173]為了更好地觀察其他部件，從圖17和圖19的近側(cè)省略放置臂652。然而，在圖18、24和25中最佳地示出放置臂。放置臂652設(shè)置有用于接收陣列681的平臺(tái)653。陣列681設(shè)置有一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)或多個(gè)開口 655，對準(zhǔn)銷654可延伸通過開口 655。開口 655可被配置為卡扣到對準(zhǔn)銷654，以便更牢度地對準(zhǔn)。替代性地，可提供用以接收陣列681的凹陷部。應(yīng)該理解，將陣列681合適地放置到平臺(tái)653上的其他方法在本公開的范圍內(nèi)。如果滴由于滿足預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)而被確定為足夠，則向上移動(dòng)放置臂652，從而使得陣列681的每個(gè)井682被放置為與其各自的滴692接觸。一旦形成接觸，每個(gè)滴692及其各自的孔口 645之間的表面張力就被釋放，并且滴692被傳送到其各自的井682。然后可降低放置臂652，移除陣列681，并且重復(fù)該過程，只要板636的每個(gè)井637中具有足夠的流體。應(yīng)該理解，在傳送滴692之后，可相對于陣列581如上所述地處理陣列681，以使其成為本文描述的任何袋的第二級。
[0174]圖24-25示出一個(gè)說明性放置臂652的細(xì)節(jié)。在本例子中，放置臂652包括平面四桿機(jī)構(gòu)664，其中，聯(lián)接器連桿656將平臺(tái)653連接到旋轉(zhuǎn)臂659。聯(lián)接器連桿656在附接點(diǎn)649處附接到從動(dòng)件連桿658，并且在附接點(diǎn)648處附接到旋轉(zhuǎn)臂659。旋轉(zhuǎn)臂659在附接點(diǎn)647處附接到頂部結(jié)構(gòu)605，并且從動(dòng)件連桿658在附接點(diǎn)650處附接到頂部結(jié)構(gòu)605。短連桿669由附接點(diǎn)647和648之間的距離確定。頂部結(jié)構(gòu)605用作四桿機(jī)構(gòu)的接地連桿。在說明性實(shí)施例中，選擇連桿的長度，使得高密度陣列681跟隨在馬上接觸打印頭660之前豎直移動(dòng)的聯(lián)接器曲線。這種豎直移動(dòng)是期望的，從而使得每個(gè)滴692與其各自的井682接觸，同時(shí)最小化當(dāng)馬上接觸之前的移動(dòng)不是豎直的時(shí)可發(fā)生的交叉污染。此聯(lián)接器曲線移動(dòng)也是有用的，因?yàn)檎障鄼C(jī)670的開口 668可位于打印頭660正下方。壓印板663在旋轉(zhuǎn)接頭646處接合到聯(lián)接器連桿656。可調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)接頭646以提供陣列681和打印頭660之間的平面對準(zhǔn)。在對準(zhǔn)好之后，可以鎖定旋轉(zhuǎn)接頭646以提供持續(xù)的對準(zhǔn)。如圖19所示，提供兩個(gè)相同的平面四桿機(jī)構(gòu)664 (頂部結(jié)構(gòu)605的每側(cè)上提供一個(gè))并且被同步鎖定(該同步一起旋轉(zhuǎn)兩個(gè)驅(qū)動(dòng)器連桿657)以在打印頭660處合適地對準(zhǔn)陣列681，如圖25所示。應(yīng)該理解，平面四桿機(jī)構(gòu)664僅是說明性的，并且將陣列放置在打印頭660上的其他方法在本公開的范圍內(nèi)，包括其他手動(dòng)和自動(dòng)手段。
[0175]打印頭660被固定到泵板667,泵板667固定到泵陣列620。泵板667可相對于泵陣列620移動(dòng)，從而允許與照相機(jī)670對準(zhǔn)。替代性地，泵板667可設(shè)置有在泵陣列620上的多個(gè)附接位置，使得能夠橫向放置。這種橫向放置可選擇地允許通過單個(gè)泵頭660填充可在壓印板663上彼此相鄰地就位的多個(gè)陣列681，或者允許泵頭660通過先在一個(gè)位置打印，然后在第二位置打印來打印較大的陣列。
[0176]圖24-25示出照相機(jī)670的說明性布置。在本說明性實(shí)施例中，水平地安裝照相機(jī)670，并且鏡子674用于反射通過開口 668接收的圖像。然而應(yīng)該理解，其他布置在本公開的范圍內(nèi)，包括但不限于省略鏡子和將照相機(jī)670豎直地安裝在開口 668下方。提供底部外殼604以保護(hù)照相機(jī)670。可提供頂部外殼(未示出)以保護(hù)底座601上方的許多部件。然而，優(yōu)選的是，這種頂部外殼允許相對容易地插入和移出陣列681和板636。
[0177]返回圖22-23，存在被內(nèi)設(shè)到打印頭660的多個(gè)支座675，例如六個(gè)支座675，但可使用其他數(shù)量的支座。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)層687被固定到陣列681時(shí)，陣列681常常稍微彎曲。支座675用于在滴692被傳送到井682期間靠著壓印板663推平陣列681。
[0178]圖26是用于點(diǎn)樣陣列的系統(tǒng)698的框圖。系統(tǒng)698包括計(jì)算裝置696，其可包括一個(gè)或多個(gè)處理器694、存儲(chǔ)器(未示出)、計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)(未示出)、一個(gè)或多個(gè)HMI裝置(例如，輸入輸出裝置(未不出)、顯不器695、打印機(jī)(未不出)等)、一個(gè)或多個(gè)通信接口(未示出)等。計(jì)算裝置696可以可通信地聯(lián)接到點(diǎn)樣器600，點(diǎn)樣器600可聯(lián)接到壓縮氣體源616。計(jì)算裝置可控制系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)部件，包括泵陣列620、放置臂652、加載平臺(tái)635、成像系統(tǒng)676或任何組合。應(yīng)該理解，系統(tǒng)可被配置為使得可手動(dòng)地操作各個(gè)部件。
[0179]可通過插入其所有井637都包含清潔溶液的板636來清潔點(diǎn)樣器600，并且啟用泵626直到所有清潔溶液都已離開孔口 641。盛器可被放置在打印頭660下方以收集清潔溶液。
[0180]參考文獻(xiàn)
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[0181]盡管已經(jīng)參照優(yōu)選實(shí)施例詳細(xì)描述了本發(fā)明，但是改變和修改處于如在所附權(quán)利要求中描述和限定的本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于將多個(gè)流體點(diǎn)樣到陣列中的點(diǎn)樣器裝置，包括: 以第一配置設(shè)置的多個(gè)儲(chǔ)存器，每個(gè)儲(chǔ)存器保持其各自的流體， 具有以第二配置設(shè)置的多個(gè)位置的打印頭，所述第二配置不同于所述第一配置， 多個(gè)管，每個(gè)管被配置為從所述管的第一端處的儲(chǔ)存器到所述管的第二端處的打印頭中的位置提供流體連通，以及 泵，其用于通過所述管將流體從所述儲(chǔ)存器泵送到所述打印頭。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的點(diǎn)樣器裝置，進(jìn)一步包括: 被設(shè)置在所述儲(chǔ)存器上方的支撐件， 多個(gè)吸管，每個(gè)吸管連接到其各自的管的第一端，每個(gè)吸管從其各自的管的第一端延伸并通過所述支撐件到達(dá)儲(chǔ)存器，每個(gè)吸管具有定位在所述支撐件上方的重物以將所述吸管偏壓到所述吸管的各自的儲(chǔ)存器的底部。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的點(diǎn)樣器裝置，其中，在移除所述儲(chǔ)存器時(shí)，所述重物靜置在所述支撐件上。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的點(diǎn)樣器裝置，其中，所述吸管是剛性的或半剛性的，并且所述管是彈性體的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的點(diǎn)樣器裝置，其中，所述泵進(jìn)一步包括: 被配置為同時(shí)對所有管進(jìn)行泵送的泵。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的點(diǎn)樣器裝置，其中，所述泵是設(shè)置有偏置的泵頭的蠕動(dòng)泵。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的點(diǎn)樣器裝置，其中，每個(gè)管的第二端包括孔口，所述泵的啟用從所述儲(chǔ)存器移動(dòng)流體，從而在每個(gè)孔口處形成流體滴。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的點(diǎn)樣器裝置，其中，所述陣列設(shè)置有以所述第二配置設(shè)置的多個(gè)井。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的點(diǎn)樣器裝置，進(jìn)一步包括放置臂，其用于接收所述陣列并將所述陣列移動(dòng)到所述打印頭，從而將每個(gè)滴傳送到其各自的陣列井。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的點(diǎn)樣器裝置，進(jìn)一步包括定位為與所述打印頭視覺接觸的照相機(jī)，所述照相機(jī)進(jìn)一步能夠操作為提供所述滴的圖像。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的點(diǎn)樣器裝置，進(jìn)一步包括CPU，所述CPU具有被配置為分析所述圖像的軟件，所述軟件能夠操作為確定每個(gè)滴是否滿足預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的點(diǎn)樣器裝置，進(jìn)一步包括用以照亮所述滴的光源。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的點(diǎn)樣器裝置，其中，所述光源是高入射光源。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的點(diǎn)樣器裝置，其中，每個(gè)孔口具有被拋光成平坦光滑的表面的端部，該端部被配置為用于將來自所述光源的光反射回其各自的滴。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的點(diǎn)樣器裝置，其中，每個(gè)所述儲(chǔ)存器中的流體包含熒光染料，以幫助對所述滴成像。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的點(diǎn)樣器裝置，其中，所述管能夠移除地連接到所述打印頭，從而使得與管流體連通的任何預(yù)選定儲(chǔ)存器能夠被設(shè)定為將來自所述預(yù)選定儲(chǔ)存器的流體提供到所述打印頭上的任何位置。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的點(diǎn)樣器裝置，其中，所述多個(gè)儲(chǔ)存器是96個(gè)井的板中的井。
18.一種用于打印具有處于一配置的多個(gè)井的陣列的方法，包括: 將流體從多個(gè)儲(chǔ)存器同時(shí)泵送到打印頭上的多個(gè)位置，以在具有與所述陣列相同的配置的所述打印頭上形成多個(gè)滴， 移動(dòng)所述陣列以與所述滴接觸，以及 將每個(gè)相應(yīng)滴同時(shí)傳送到其各自的井中。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，進(jìn)一步包括: 對所述滴成像并且在移動(dòng)所述陣列以與所述滴接觸之前確定多個(gè)滴是否全部足夠。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，如果一個(gè)或多個(gè)滴被確定為不足夠，則丟棄所述陣列。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，如果所述滴中的一個(gè)或多個(gè)被確定為不足夠，則移動(dòng)吸除材料以與所述滴接觸，并且重復(fù)泵送和成像步驟。
22.一種通過權(quán)利要求18所述的方法生產(chǎn)的陣列。
23.一種用于將一個(gè)或多個(gè)液體傳送到多個(gè)井的預(yù)選定陣列中的系統(tǒng)，包括: 多個(gè)管，每個(gè)管具有與儲(chǔ)存器流體連通的第一端和終止于孔口中的第二端； 多個(gè)儲(chǔ)存器，所述儲(chǔ)存器相對于彼此以預(yù)定配置設(shè)置； 打印頭，其能夠操作為能夠移動(dòng)地保持每個(gè)孔口處于預(yù)定位置，從而使得每個(gè)孔口的位置對應(yīng)于井的預(yù)選定陣列中的井； 多個(gè)吸管，每個(gè)吸管具有將第一端連接到第二端的中空開口，該第一端流體連接到相應(yīng)的管的第一端并且該第二端與相應(yīng)的儲(chǔ)存器的底部能夠移除地接觸；以及 計(jì)量供給裝置，其能夠操作為將預(yù)選定量的流體從每個(gè)吸管的第二端推動(dòng)通過其相應(yīng)的管并從其相應(yīng)的孔口出來。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的系統(tǒng)，其中，所述計(jì)量供給裝置位于所述多個(gè)管的第一端和第二端之間。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的系統(tǒng)，進(jìn)一步包括多個(gè)井的陣列，每個(gè)井能夠操作為從相應(yīng)的孔口接收預(yù)選定量的液體。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的系統(tǒng)，其中，井的數(shù)量超過儲(chǔ)存器的數(shù)量。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的系統(tǒng)，其中，每個(gè)儲(chǔ)存器包括能夠操作為保持預(yù)定量的液體的底部，并且進(jìn)一步包括能夠操作為接收一個(gè)或多個(gè)吸管的頂部。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的系統(tǒng)，進(jìn)一步包括與每個(gè)管流體連通的一個(gè)或多個(gè)閥，所述一個(gè)或多個(gè)閥能夠操作為阻擋流體行進(jìn)通過每個(gè)管。
29.根據(jù)權(quán)利要求23所述的系統(tǒng)，其中，每個(gè)孔口包括內(nèi)腔和外表面，并且其中，所述孔口的尺寸和形狀形成為將預(yù)選定體積的液體的微滴保持為臨近其外表面，直到表面張力消失。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的系統(tǒng)，其中，多個(gè)井的預(yù)選定陣列能夠移除地被保持在可移動(dòng)平臺(tái)上，所述可移動(dòng)平臺(tái)具有相對于所述打印頭的第一位置和第二位置； 所述第一位置緊密接近所述打印頭，從而使得所述多個(gè)井中的每個(gè)與相應(yīng)的孔口所保持的微滴接觸；并且 所述第二位置遠(yuǎn)離所述打印頭，從而使得任何井和相應(yīng)的孔口所保持的任何微滴之間都不接觸。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)，其中，所述第一位置不使任何井與任何孔口接觸。
32.根據(jù)權(quán)利要求23所述的系統(tǒng)，其中，所述計(jì)量供給裝置是蠕動(dòng)泵。
33.根據(jù)權(quán)利要求23所述的系統(tǒng)，其中，兩個(gè)或多個(gè)孔口的位置對應(yīng)于井的預(yù)選定陣列中的單個(gè)井。
34.根據(jù)權(quán)利要求23所述的系統(tǒng)，進(jìn)一步包括: 成像系統(tǒng)，以及 計(jì)算裝置， 其中，所述計(jì)算裝置與所述成像裝置接口，以在傳送到井的陣列之前或之后在所述打印頭處接受或拒絕滴的陣列。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的系統(tǒng)，其中，所述成像系統(tǒng)確定每個(gè)滴的尺寸并且通過比較所述尺寸與標(biāo)準(zhǔn)來接受或拒絕每個(gè)滴。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的系統(tǒng)，其中，所述尺寸是半徑。
37.根據(jù)權(quán)利要求23所述的系統(tǒng)，進(jìn)一步包括: 脫離子器，其被配置為幫助將流體從打印頭傳送到井的陣列。
【文檔編號】B01L3/02GK104507577SQ201380031738
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月18日
【發(fā)明者】E. 瓊斯 D., M. 里里 K., C. 羅賓斯 T., D. 科佩內(nèi) E., B. 科克斯 C. 申請人:拜奧法爾診斷有限責(zé)任公司