一種殼聚糖磁性納米粒子固定普魯蘭酶的方法
【專利摘要】一種采用殼聚糖磁性納米粒子固定普魯蘭酶的方法，包括如下步驟：（1）殼聚糖磁性納米粒子的制備；（2）磁性納米粒子表面氨基化處理；（3）氨基化處理后的磁性納米粒子與普魯蘭酶在交聯(lián)劑的存在下形成共價鍵，普魯蘭酶被固定。與傳統(tǒng)的固定化普魯蘭酶相比較，本發(fā)明首次采用殼聚糖水凝膠誘導(dǎo)法制備的載體用來固定化普魯蘭酶，較傳統(tǒng)方法步驟簡單，條件溫和，為一種環(huán)境友好型的綠色方法。
【專利說明】一種殼聚糖磁性納米粒子固定普魯蘭酶的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種利用水凝膠誘導(dǎo)方法制備的殼聚糖 磁性納米粒子來固定普魯蘭酶的新方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 普魯蘭酶（Pullulanase，EC 3. 2. 1.41)是一種脫支酶，在以淀粉為原料的食品加 工業(yè)中有著重要的用途，其能將最小單位的支鏈分解，最大限度的利用淀粉原料。目前在工 業(yè)中主要是應(yīng)用在提高高葡糖漿及超高麥芽糖漿的產(chǎn)量和純度；提高啤酒糖漿的麥芽糖含 量；增加馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、甘薯淀粉中抗消化淀粉的含量以及生產(chǎn)高直連淀粉等。
[0003] 與游離的酶相比，固定化酶具有很多優(yōu)點(diǎn)，所以近幾十年來關(guān)于各種固定化酶技 術(shù)和載體材料的研究應(yīng)運(yùn)而生。與傳統(tǒng)的材料相比，磁性納米顆粒是一種新型的復(fù)合材料， 具有超順磁性及良好的生物相容性，使其在生物、醫(yī)藥和環(huán)保領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。用磁性 納米顆粒為載體固定化酶，可實(shí)現(xiàn)在外加磁場下快捷的與產(chǎn)物分離，使工業(yè)化連續(xù)化生產(chǎn) 成為可能，且分離比較徹底，簡化了后續(xù)的產(chǎn)物分離過程，因此磁性納米顆粒作為載體固定 化酶的研究成為生物催化領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
[0004] 近年來，最普遍使用的磁性納米粒子是磁性四氧化三鐵納米粒子。然而，由于其自 身的不穩(wěn)定性，它們在水溶液中容易發(fā)生聚集，導(dǎo)致使用價值降低。研究表明，在磁性納米 顆粒表面包裹一層生物相容性聚合物可以達(dá)到提高其穩(wěn)定性，減少聚集的作用。殼聚糖是 除了纖維素、淀粉外生物界廣泛存在的第三大類生物相容性天然聚合物大分子，由于其無 毒性，可降解性以及粘附性，引起了越來越多的關(guān)注，已應(yīng)用在金屬吸附、固定化酶、蛋白質(zhì) 吸附和藥物的控制釋放等行業(yè)；并且殼聚糖表面還有大量功能性基團(tuán)，如氨基，羥基等，是 進(jìn)行酶固定化的良好載體。研究報道已有一些酶固定在殼聚糖/四氧化三鐵納米顆粒上， 并取得了較為理想的效果。
[0005] 目前，磁性殼聚糖/四氧化三鐵納米粒子的合成主要是采用微乳液及乳液聚合 法，但這些合成方法仍然存在工藝繁瑣，條件苛刻(較高溫度和壓力、需保護(hù)氣氛、有機(jī)溶劑 和有機(jī)表面活性劑等）的問題；并且這些合成方法大多是在水/油系統(tǒng)中進(jìn)行，然而由于大 多數(shù)實(shí)際生產(chǎn)采用的是水系統(tǒng)，因此這也可能會限制其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本 申請人:提供了一種殼聚糖磁性納米粒子固定普 魯蘭酶的方法。與傳統(tǒng)的固定化普魯蘭酶相比較，本發(fā)明首次采用殼聚糖水凝膠誘導(dǎo)法制 備的載體用來固定化普魯蘭酶，較傳統(tǒng)方法步驟簡單，條件溫和，為一種環(huán)境友好型的綠色 方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種采用殼聚糖磁性納米粒子固定普魯蘭酶的方法，包括如下步驟： (1)殼聚糖磁性納米粒子的制備； (2)磁性納米粒子表面氨基化處理； (3 )氨基化處理后的磁性納米粒子與普魯蘭酶在交聯(lián)劑的存在下形成共價鍵，普魯蘭 酶被固定。
[0008] 具體步驟為： (1) 殼聚糖磁性納米粒子的制備方法： 將殼聚糖粉末加入到乙酸溶液中，配制成質(zhì)量百分比濃度為3~5%均一的淡黃色殼 聚糖溶液；將濃度為25%的戊二醛溶液緩慢加入到上述殼聚糖溶液中，繼續(xù)勻速攪拌 15?30min，再靜置12?24h，得到殼聚糖水凝膠；將水凝膠依次浸泡在0· 05?0· 2mol/L Fe3+的 水溶液、水、0.02~0. lmol/L Fe2+的水溶液中，循環(huán)四次；然后將含有鐵離子的殼聚糖水凝膠 浸泡在1~1.5 mol/L的NaOH溶液中堿化處理12~24h，得到黑色的水凝膠，將此水凝膠采用 乙酸及過氧化氫溶液水解即得到黑色的具有磁響應(yīng)的納米粒子，在外加磁場下收集磁響應(yīng) 物質(zhì)，然后用蒸餾水漂洗至中性；所得到的磁性納米粒子分散性良好，直徑在5~12nm左右； (2) 磁性納米粒子表面氨基化處理的方法： 稱取已制備好的殼聚糖磁性納米粒子，于甲醇或甲苯溶液中超聲分散0. 5~1. 5 h，然后 再將溶液調(diào)為堿性，在機(jī)械攪拌下緩慢加入硅烷偶聯(lián)劑，50°C下攪拌反應(yīng)4~8h;反應(yīng)后的 產(chǎn)物用磁場收集，分別用無水乙醇和去離子水洗滌數(shù)次，洗滌過的固體在室溫下干燥，得到 氨基化的殼聚糖磁性納米粒子； (3) 氨基化處理后的磁性納米粒子固定普魯蘭酶的方法： 將干燥的氨基化的殼聚糖磁性納米粒子超聲分散在磷酸緩沖液中，振蕩3~5小時，經(jīng) 磁場分離，然后再分散到磷酸緩沖溶液中，于室溫攪拌反應(yīng)條件下緩慢加入交聯(lián)劑溶液，攪 拌反應(yīng)l~15h，再在外加磁場下收集磁性納米粒子，并用去離子水多次洗滌以除去殘留的交 聯(lián)劑；處理好的載體按1:2~1:4 (mg:ml)的比例加入到普魯蘭酶溶液中，于25~40°C水浴振 蕩器中，振蕩固定12~36h ;所述普魯蘭酶溶液的濃度為15~50μ g/mL，pH值為3. 5~5. 4。
[0009] 步驟（1)中所述戊二醛溶液的用量為每100ml乙酸溶液中加入0. 2?lml。步驟（2) 中所述硅烷偶聯(lián)劑為3-氨基丙基三乙氧基硅烷或3- (2-氨基乙基氨基）丙基甲基二甲氧 基娃燒。
[0010] 步驟（2)中所述已制備好的殼聚糖磁性納米粒子與硅烷偶聯(lián)劑的比例為 18:11111?18 :81111。步驟（2)、（3)中，使用似0!1、1(0!1、似!1〇)3或氨水將溶液調(diào)為堿性。
[0011] 步驟（3)中所述普魯蘭酶的濃度為50μ g/mL。步驟（3)中所述交聯(lián)劑為戊二醛、 碳二亞胺或環(huán)氧氯丙烷中的至少一種；加入交聯(lián)劑后溶液中戊二醛的濃度為〇. 5~15%，碳 二亞胺的濃度為l(T2〇〇mM，環(huán)氧氯丙烷的濃度為5?15%。
[0012] 步驟（3)中使用戊二醛和/或碳二亞胺做交聯(lián)劑時，加入硼氫化鈉或氰基硼氫化 鈉后再震蕩反應(yīng)lh。使用戊二醛和/或碳二亞胺做交聯(lián)劑時，加入硼氫化鈉或氰基硼氫化 鈉，將酶與載體形成的亞胺還原為更為穩(wěn)定的伯胺；加入的硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉與普 魯蘭酶液的比例為0. 5:f3:l (mg:ml)。
[0013] 本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于： 本發(fā)明克服了以往固定化磁性材料制備繁雜、成本高、團(tuán)聚嚴(yán)重、固定化效率不高、制 備過程復(fù)雜的缺點(diǎn)，提供的普魯蘭酶固定化的方法保留酶活高且穩(wěn)定性好。本發(fā)明中主要 通過殼聚糖表面的氨基基團(tuán)與溶液中的鐵離子發(fā)生螯合作用，誘導(dǎo)四氧化三鐵晶體的形 成，然后將殼聚糖水凝膠進(jìn)行水解，就可以得到分散性較好、納米級別的殼聚糖包裹的四氧 化三鐵納米粒子。
[0014] 本發(fā)明提供的殼聚糖載體具有良好的生物相容性及分散性，該載體表面存在大量 的官能團(tuán)，酶分子能與載體充分的結(jié)合，制備出的固定化酶便于回收利用。這種水凝膠誘導(dǎo) 無機(jī)合成為磁性納米粒子的制備提供了新途徑，是一種步驟簡單、環(huán)境友好型的綠色方法。
[0015] 由于普魯蘭酶做為一種重要的工業(yè)用酶，提高其穩(wěn)定性具有較大的經(jīng)濟(jì)意義，因 此本發(fā)明通過將普魯蘭酶固定在水凝膠誘導(dǎo)的殼聚糖磁性納米粒子上，使得所得的酶具有 較高的熱穩(wěn)定性及重復(fù)使用性，在60°c條件下水浴5h后仍保留有81%的酶活，而游離酶只 有50%的酶活，增大了其使用價值。
[0016] 本發(fā)明制備的固定化酶的最適pH值發(fā)生酸性偏移，由4. 4偏移到3. 5,比傳統(tǒng)的固 定化酶更耐受酸性環(huán)境，也就是說本發(fā)明制備的固定化酶相比于游離酶有更寬泛的pH值 耐受性。在pH 2. 5及3.0的環(huán)境下，游離酶幾乎全部失活，而固定化酶仍然保留有12. 8% 及71. 1%的酶活。其活性達(dá)到游離酶活性的90%以上。
[0017] 本發(fā)明制備的固定化酶回收利用步驟簡單，在外加磁場下即可實(shí)現(xiàn)酶的回收利 用；酶活回收率高，酶活回收率達(dá)到90%以上；且重復(fù)穩(wěn)定性較好，重復(fù)使用8次后的酶活 力保留達(dá)70%。
[0018] 本方法操作簡單，成本低廉，制備的固定化酶在工業(yè)連續(xù)化淀粉加工等領(lǐng)域具有 廣泛應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為殼聚糖磁性納米粒子的制備及固定化普魯蘭酶的工藝流程圖。
[0020] 圖2為實(shí)施例1制備的殼聚糖磁性納米粒子在水溶液中的分散性及外加磁場下 的磁響應(yīng)性。
[0021] 圖3為實(shí)施例3制備的固定化酶的重復(fù)使用性。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖1，對本發(fā)明進(jìn)行具體描述。
[0023] 實(shí)施例1 : 將3g殼聚糖粉末加入到100ml 2%乙酸溶液中，攪拌至殼聚糖完全溶解；緩慢加入 0. 4ml 25%的戊二醛溶液，繼續(xù)勻速攪拌15min，再靜置24h，得到殼聚糖水凝膠；將水凝膠 依次浸泡在〇· 15mol/L的Fe3+水溶液、水、0.075mol/L的Fe2+水溶液中，循環(huán)四次，此時殼 聚糖氨基基團(tuán)與鐵及亞鐵離子發(fā)生螯合；將含有鐵離子的殼聚糖水凝膠浸泡在1. 25 mol/L NaOH溶液中堿化處理12h，得到黑色的水凝膠，將此水凝膠采用3%乙酸及5%過氧化氫溶液 水解即得到黑色的具有磁響應(yīng)的納米粒子。
[0024] 在外加磁場下收集磁響應(yīng)物質(zhì)，殼聚糖磁性粒子在10s內(nèi)發(fā)生聚集，倒掉上清液， 然后再用蒸餾水重復(fù)漂洗至中性；所得到的磁性納米粒子分散性良好，直徑為l〇nm。圖2 為殼聚糖磁性納米粒子在水溶液中的分散性及外加磁場下的磁響應(yīng)性。從圖中可以看出殼 聚糖磁性納米粒子在水溶液中分散性良好，并且具有很好的磁響應(yīng)性，在外加磁場(磁鐵） 存在下，l〇s內(nèi)發(fā)生聚集。
[0025] 稱取已制備好的殼聚糖磁性納米粒子（以下稱為載體)，載體與甲醇按l:60(g:ml) 的比例于甲醇中超聲lh，然后再按載體與氨水為1:6 (g:ml)的比例加入25%氨水溶液再 超聲lOmin，在機(jī)械攪拌下緩慢加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液（lg :2ml)，5(TC下攪拌 反應(yīng)4h。反應(yīng)后的產(chǎn)物用磁場收集，分別用無水乙醇和去離子水洗滌數(shù)次，洗滌過的固體室 溫下干燥。
[0026] 取氨基化的殼聚糖磁性納米粒子超聲分散在的磷酸緩沖液中（65 mM，pH 7.8)， 振蕩3小時，經(jīng)磁場分離，然后再分散到磷酸緩沖溶液中，于室溫攪拌反應(yīng)條件下緩慢加入 終濃度為3. 5%的戊二醛溶液，攪拌反應(yīng)8h，收集磁性納米粒子，并用去離子水多次洗滌以 除去殘留的戊二醛。將處理好的載體按1:2 (mg:ml)的比例與15yg/mL的普魯蘭酶溶液 (PH4. 0)混合，于25°C水浴振蕩器反應(yīng)24h，然后加入硼氫化鈉（2mg : lml)后再震蕩反應(yīng)1 h〇
[0027] 實(shí)施例2 : 將4 g殼聚糖粉末加入到100ml 2%乙酸溶液中，攪拌至殼聚糖完全溶解；緩慢加入0.6 ml戊二醛溶液，繼續(xù)勻速攪拌20min，再靜置12h，得到殼聚糖水凝膠；將水凝膠依次浸泡在 0. 2mol/L的Fe3+水溶液、水、0. lmol/L的Fe2+水溶液中，循環(huán)四次；然后將含有鐵離子的 殼聚糖水凝膠浸泡在1.5 mol/L NaOH溶液中堿化處理12h，得到黑色的水凝膠，將此水凝 膠采用2%乙酸及4%過氧化氫溶液水解即得到黑色的具有磁響應(yīng)的納米粒子，在外加磁場 下收集磁響應(yīng)物質(zhì)，殼聚糖磁性粒子在10 s內(nèi)發(fā)生聚集，倒掉上清液，然后再用蒸餾水重復(fù) 漂洗至中性；所得到的磁性納米粒子分散性良好，直徑為8nm。
[0028] 稱取已制備好的殼聚糖磁性納米粒子（以下稱為載體)，載體與甲苯按l:60(g:ml) 的比例超聲30 min，然后再按載體與NaOH溶液為1:3 (g:ml)的比例加入lmol/1 NaOH溶 液再超聲l〇min，在機(jī)械攪拌下緩慢加入3- (2-氨基乙基氨基）丙基甲基二甲氧基硅烷溶 液（lg :4ml)，50°C下攪拌反應(yīng)8h。反應(yīng)后的產(chǎn)物用磁場收集，分別用二甲亞砜、無水乙醇 和去離子水洗滌數(shù)次，洗滌過的固體室溫下干燥。
[0029] 稱取干燥的殼聚糖磁性納米粒子超聲分散在磷酸緩沖液中（65mM，pH 7. 8)，振蕩 4小時，經(jīng)磁場分離，然后再分散到磷酸緩沖溶液中，于室溫攪拌反應(yīng)條件下緩慢加入終濃 度為100 mM的碳二亞胺溶液，攪拌反應(yīng)4h，收集磁性納米粒子，并用去離子水多次洗滌以 除去殘留的碳二亞胺。將處理好的載體按1:3 (mg:ml)的比例與30 μ g/mL的普魯蘭酶溶 液（pH4. 8)混合，于40°C水浴振蕩器中反應(yīng)12h，然后加入氰基硼氫化鈉 （lmg : lml)后再震 蕩反應(yīng)1 h。
[0030] 實(shí)施例3 : 將5 g殼聚糖粉末加入到100ml 3%乙酸溶液中，攪拌至殼聚糖完全溶解；緩慢加入0.8 ml的戊二醛溶液，繼續(xù)勻速攪拌30min，再靜置24h，得到殼聚糖水凝膠；將水凝膠依次浸泡 在0· 2mol/L的Fe3+水溶液、水、0· lmol/L的Fe2+水溶液中，循環(huán)四次；將含有鐵離子的殼 聚糖水凝膠浸泡在1.25 mol/L NaOH溶液中堿化處理12h，得到黑色的水凝膠，將此水凝膠 采用4%乙酸及8%過氧化氫溶液水解即得到黑色的具有磁響應(yīng)的納米粒子，在外加磁場下 收集磁響應(yīng)物質(zhì)，殼聚糖磁性粒子在10 s內(nèi)發(fā)生聚集，倒掉上清液，然后再用蒸餾水重復(fù)漂 洗至中性；所得到的磁性納米粒子分散性良好，直徑為12nm。
[0031] 稱取已制備好的殼聚糖磁性納米粒子（以下稱為載體)，載體與甲醇按l:60(g:ml) 的比例于甲醇中超聲1.5h，然后再按載體與NaHC03溶液為1:6 (g:ml)的比例加入lmol/ 1 NaHC03溶液再超聲30min，在機(jī)械攪拌下緩慢加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液（lg :6ml)，50°C下攪拌反應(yīng)8h。反應(yīng)后的產(chǎn)物用磁場收集，分別用無水乙醇和去離子水洗滌數(shù) 次，室溫干燥。
[0032] 稱取干燥的殼聚糖磁性納米粒子超聲分散在磷酸緩沖液中（65 mM，pH 7. 8)，振 蕩5小時，經(jīng)磁場分離，然后再分散到磷酸緩沖溶液中，于室溫攪拌反應(yīng)條件下緩慢加入終 濃度為5%的環(huán)氧氯丙烷溶液，攪拌反應(yīng)15 h，收集磁性納米粒子，分別用二甲亞砜、無水乙 醇和去離子水洗滌數(shù)次。將處理好的載體按1:4 (mg:ml)的比例與50 μ g/mL的普魯蘭酶 溶液（pH5. 4)混合，于30°C水浴振蕩器中反應(yīng)36h。
[0033] 將固定化普魯蘭酶（2u/g?10u/g)與2%普魯蘭糖溶液按1:200 (g:ml)的比例在 50°C條件下反應(yīng)60min后，在外加磁場下收集固定化酶，棄去普魯蘭糖溶液，然后再重新加 入普魯蘭糖溶液繼續(xù)反應(yīng)60min，然后再棄去普魯蘭糖溶液，以上步驟重復(fù)8次，實(shí)現(xiàn)固定 化酶的重復(fù)使用，得到圖3,固定化酶的重復(fù)使用性。
[0034] 結(jié)果顯示，固定化酶有較好的重復(fù)使用性，在使用8次后，還保留了 70%酶活力。固 定化酶的酶分子構(gòu)象較穩(wěn)定，不易受外界條件的干擾，因此能夠重復(fù)多次使用，與游離酶相 比較有很好的經(jīng)濟(jì)效益。
【權(quán)利要求】
1. 一種采用殼聚糖磁性納米粒子固定普魯蘭酶的方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 殼聚糖磁性納米粒子的制備； (2) 磁性納米粒子表面氨基化處理； (3) 氨基化處理后的磁性納米粒子與普魯蘭酶在交聯(lián)劑的存在下形成共價鍵，普魯蘭 酶被固定。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定普魯蘭酶的方法，其特征在于具體步驟為： (1) 殼聚糖磁性納米粒子的制備方法： 將殼聚糖粉末加入到乙酸溶液中，配制成質(zhì)量百分比濃度為3~5%均一的淡黃色殼 聚糖溶液；將濃度為25%的戊二醛溶液緩慢加入到上述殼聚糖溶液中，繼續(xù)勻速攪拌 15?30min，再靜置12?24h，得到殼聚糖水凝膠；將水凝膠依次浸泡在0· 05?0· 2mol/L Fe3+的 水溶液、水、0.02~0. lmol/L Fe2+的水溶液中，循環(huán)四次；然后將含有鐵離子的殼聚糖水凝膠 浸泡在1~1.5 mol/L的NaOH溶液中堿化處理12~24h，得到黑色的水凝膠，將此水凝膠采用 乙酸及過氧化氫溶液水解即得到黑色的具有磁響應(yīng)的納米粒子，在外加磁場下收集磁響應(yīng) 物質(zhì)，然后用蒸餾水漂洗至中性；所得到的磁性納米粒子分散性良好，直徑在5~12nm左右； (2) 磁性納米粒子表面氨基化處理的方法： 稱取已制備好的殼聚糖磁性納米粒子，于甲醇或甲苯溶液中超聲分散0. 5~1. 5 h，然后 再將溶液調(diào)為堿性，在機(jī)械攪拌下緩慢加入硅烷偶聯(lián)劑，50°C下攪拌反應(yīng)4~8h;反應(yīng)后的 產(chǎn)物用磁場收集，分別用無水乙醇和去離子水洗滌數(shù)次，洗滌過的固體在室溫下干燥，得到 氨基化的殼聚糖磁性納米粒子； (3) 氨基化處理后的磁性納米粒子固定普魯蘭酶的方法： 將干燥的氨基化的殼聚糖磁性納米粒子超聲分散在磷酸緩沖液中，振蕩3~5小時，經(jīng) 磁場分離，然后再分散到磷酸緩沖溶液中，于室溫攪拌反應(yīng)條件下緩慢加入交聯(lián)劑溶液，攪 拌反應(yīng)l~15h，再在外加磁場下收集磁性納米粒子，并用去離子水多次洗滌以除去殘留的交 聯(lián)劑；處理好的載體按1:2~1:4 (mg:ml)的比例加入到普魯蘭酶溶液中，于25~40°C水浴振 蕩器中，振蕩固定12~36h ;所述普魯蘭酶溶液的濃度為15~50μ g/mL，pH值為3. 5~5. 4。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的固定普魯蘭酶的方法，其特征在于步驟（1)中所述戊二醛溶 液的用量為每l〇〇ml乙酸溶液中加入0. 2?lml。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的固定普魯蘭酶的方法，其特征在于步驟（2)中所述硅烷偶聯(lián) 劑為3-氨基丙基二乙氧基娃燒或3_(2_氨基乙基氨基）丙基甲基二甲氧基娃燒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的固定普魯蘭酶的方法，其特征在于步驟（2)中所述已制備好 的殼聚糖磁性納米粒子與娃燒偶聯(lián)劑的比例為lg: lml~lg:8ml。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的固定普魯蘭酶的方法，其特征在于步驟（2)、（3)中，使用 NaOH、KOH、NaHC03或氨水將溶液調(diào)為堿性。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固定普魯蘭酶的方法，其特征在于步驟（3)中所述普魯 蘭酶的濃度為50 μ g/mL。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的的固定普魯蘭酶的方法，其特征在于步驟（3)中所述交 聯(lián)劑為戊二醛、碳二亞胺或環(huán)氧氯丙烷中的至少一種；加入交聯(lián)劑后溶液中戊二醛的濃度 為0. 5?15%，碳二亞胺的濃度為l(T200mM，環(huán)氧氯丙烷的濃度為5?15%。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固定普魯蘭酶的方法，其特征在于步驟（3)中使用戊二 醛和/或碳二亞胺做交聯(lián)劑時，加入硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉后再震蕩反應(yīng)lh。
10.按照權(quán)利要求9所述的的固定普魯蘭酶的方法，其特征在于使用戊二醛和/或碳二 亞胺做交聯(lián)劑時，加入硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉，將酶與載體形成的亞胺還原為更為穩(wěn)定 的伯胺；加入的硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉與普魯蘭酶液的比例為〇. 5:1~3:1 (mg:ml)。
【文檔編號】B01J13/04GK104099317SQ201410343479
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】金征宇, 龍杰, 焦愛權(quán), 徐學(xué)明, 謝正軍, 田耀旗, 周星, 趙建偉, 楊哪, 王金鵬 申請人:江南大學(xué)