一種抗體偶聯(lián)藥物的陽離子交換層析純化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抗體偶聯(lián)藥物(ADC)的陽離子交換層析純化方法，所述陽離子交換層析可選用結(jié)合-洗脫模式或過載模式進(jìn)行純化，可將ADC藥物的偶聯(lián)比（DAR)控制在目標(biāo)工藝范圍內(nèi)，同時起到去除多聚體的作用。這是一種新的ADC制備純化工藝，可降低生產(chǎn)的成本和風(fēng)險，同時實(shí)現(xiàn)對ADC藥物的小分子/抗體的摩爾偶聯(lián)比(DAR)和多聚體的控制，有助于開發(fā)可控性更強(qiáng)、成本和風(fēng)險更低的ADC生產(chǎn)工藝，以獲得質(zhì)量更高的產(chǎn)品，保證用藥安全和治療效果。
【專利說明】一種抗體偶聯(lián)藥物的陽離子交換層析純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分離純化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，本發(fā)明涉及一種抗體偶聯(lián)藥物 (ADC)的陽離子交換層析純化方法。
[0002] 技術(shù)背景
[0003] 抗體-小分子藥物偶聯(lián)物（Antibody-drug conjugate, ADC)是新一代抗體革巴 向治療藥物，主要應(yīng)用于癌癥腫瘤的治療。ADC藥物由小分子細(xì)胞毒性藥物（Drug)、抗體 (Antibody)以及連接抗體和化藥的接頭（Linker)三部分組成，小分子毒素通過化學(xué)偶聯(lián) 的方法結(jié)合到抗體蛋白上?？贵w會特異地識別并引導(dǎo)小分子藥物到達(dá)表達(dá)癌癥特異性抗 原的癌細(xì)胞靶點(diǎn)，并通過細(xì)胞內(nèi)吞效應(yīng)進(jìn)入癌細(xì)胞。接頭部分在胞內(nèi)低pH值環(huán)境或溶酶 體蛋白酶的作用下斷裂，釋放出小分子細(xì)胞毒素，從而達(dá)到特異殺死癌細(xì)胞而不損傷正常 組織細(xì)胞的作用。因此，ADC藥物同時結(jié)合了抗體的靶向?qū)Ｒ恍院托》肿佣舅貙Π┘?xì)胞的 高毒性的特點(diǎn)，大大擴(kuò)展了藥物的有效治療劑量窗口（Therapeutic window)。臨床研究 已證明，ADC抗體藥效高、在血液中相對穩(wěn)定，能有效地降低小分子細(xì)胞毒素(化藥）本身 對循環(huán)系統(tǒng)以及健康組織的毒性，是目前國際上抗癌藥物的研發(fā)熱點(diǎn)（Rachel S. Zolot， Satarupa Basu, Ryan P. Million. Antibody - drug conjugates. Nature reviews Drug Discovery. 2013， 12: 259-260)。
[0004] 目前國外已有兩個ADC藥物獲批上市銷售。2011年8月19日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)Seattle Genetics公司開發(fā)的Brentuximab Vedotin (商品名Adcetris)上市，用于治療CD30陽性 的霍杰金淋巴瘤（HL)和罕見疾病系統(tǒng)性間變性大細(xì)胞淋巴瘤（SALCL)。2013年2月22日， Genentech 公司開發(fā)的 ado-trastuzumab emtansine (T-DM1，商品名 Kadcyla)獲 FDA 批準(zhǔn) 上市銷售，主要用于治療Her2陽性晚期(轉(zhuǎn)移性)乳腺癌。另外，國際上還有超過30種ADC 藥物處在臨床開發(fā)階段（Asher Milliard. Maturing antibody-drug conjugate pipeline hits 30. Nature reviews Drug Discovery, 2013, 12: 329-332)〇
[0005] 目前ADC藥物常用的偶聯(lián)方式包括：賴氨酸偶聯(lián)、輕重鏈間還原性二硫鍵偶聯(lián)和 定點(diǎn)偶聯(lián)（Beck A, Reichert J M. Antibody-drug conjugates: Present and future. Mbs, 2014，6:15-17)。賴氨酸隨機(jī)偶聯(lián)平臺摶術(shù)利用雙功能閉奪聯(lián)試劑，對抗體的賴 氨酸殘基進(jìn)行隨機(jī)修飾，再與美登素衍生物DM1、DM4或其它類似物的巰基反應(yīng)實(shí)現(xiàn)偶 聯(lián)，已經(jīng)上市的T-DM1 (Kadcyla)即采用這一技術(shù)。輕重鏈間還原件二硫鍵偶聯(lián)則誦 過還原抗體鏈間的二硫鍵產(chǎn)生的半胱氨酸殘基，再與含多肽接頭的海兔毒素衍生物甲基 澳瑞他汀E (MMAE)、甲基澳瑞他汀F (MMAF)或其它類似物反應(yīng)實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)，另一種市售 的ADC藥物Adcetris則采用了這種平臺技術(shù)。定點(diǎn)偶聯(lián)模式目前還處于早期研發(fā)階段 (Siler Panowski, Sunil Bhakta, Helga Raab, Paul Polakis and Jagath R Junutula. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. MAbs, 2014, 6: 34 -45)。
[0006] 對于賴氨酸隨機(jī)偶聯(lián)技術(shù)，由于IgG單克隆抗體上有幾十個賴氨酸殘基可供修 飾，因此雙功能交聯(lián)試劑與賴氨酸殘基的連接是非特異的，小分子毒素與抗體結(jié)合數(shù)量和 位置呈隨機(jī)正態(tài)分布模式。而對于輕重鏈間還原性二硫鍵偶聯(lián)，如IgGl單抗中有8個鏈間 半胱氨酸可供偶聯(lián)。偶聯(lián)位點(diǎn)的多樣性導(dǎo)致了 ADC產(chǎn)品的異質(zhì)性，偶聯(lián)反應(yīng)得到的產(chǎn)品實(shí) 際是各種ADC的混合物，因此小分子藥物和抗體的摩爾偶聯(lián)比（Drug Antibody Ratio, DAR) 是十分重要的質(zhì)控參數(shù)。DAR值代表每個抗體上平均偶聯(lián)的小分子個數(shù)，DAR值過低則導(dǎo) 致ADC藥物未能達(dá)到預(yù)期的生物活性，而DAR值過高則會影響ADC藥物的安全性、穩(wěn)定性 及代謝特征，甚至藥效也有可能隨著DAR值的增加而降低（Hamblett KJ，Senter PD，Chace DF, et al. Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody drug conjugate. Clin Cancer Res，2004,10: 7063-7070)。對于目前已經(jīng)上 市的ADC藥物而言，理想的DAR值應(yīng)該控制在3?4之間，甚至更窄的范圍。另外，由于偶 聯(lián)工藝過程常涉及有機(jī)溶劑的加入以及攪拌操作，不可避免地導(dǎo)致抗體蛋白產(chǎn)生交聯(lián)物和 多聚體，這些與工藝相關(guān)的雜質(zhì)常可能引起免疫原性及其他副作用。
[0007] 鑒于DAR值和多聚體含量均為ADC藥物的關(guān)鍵質(zhì)控參數(shù)，因此需要從偶聯(lián)和純 化工藝著手，將DAR值控制在目標(biāo)范圍內(nèi)，確保批間生產(chǎn)的一致性和穩(wěn)定性，并盡可能控 制和去除產(chǎn)品中副產(chǎn)物聚集體的含量。修飾偶聯(lián)工藝非常復(fù)雜，尤其是隨機(jī)偶聯(lián)工藝。 如要將DAR值控制在很窄的范圍內(nèi)相當(dāng)具有難度，對工藝的要求極高。而偶聯(lián)工藝失敗 的概率高(主要體現(xiàn)在DAR值的控制方面)，若沒有很好的手段避免DAR值控制失敗的風(fēng) 險，則會使生產(chǎn)成本大量增加。對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)進(jìn)行檢索后發(fā)現(xiàn)，ADC藥物的純化工藝主 要涉及采用G25葡聚糖凝膠層析或切向流過濾（UF/DF)的方式去除未偶聯(lián)到抗體上的 小分子接頭和小分子毒素，其層析介質(zhì)和膜介質(zhì)均為非離子交換模式（CN 101267841 B; Brun MP, Gauzy-Lazo L. Protocols for lysine conjugation. Methods Mol Biol., 2013, 1045:173-87 ；Stefano JE, Busch M, Hou L, Park A, Gianolio DA. Micro- and mid-scale maleimide-based conjugation of cytotoxic drugs to antibody hinge region thiols for tumor targeting. Methods Mol Biol. , 2013, 1045:145-71 )〇 而陰 離子層析介質(zhì)在ADC藥物純化的應(yīng)用發(fā)面，也僅涉及采用流穿模式的陰離子層析方法進(jìn)行 多聚體的去除（CN 103254311 A)。通過純化手段控制DAR值的技術(shù)目前是空缺的。另外， 無論隨機(jī)偶聯(lián)還是定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)，均存在修飾偶聯(lián)反應(yīng)過程中蛋白質(zhì)聚集的問題。若能通 過純化的手段，降低抗體偶聯(lián)藥物的副產(chǎn)物，同時提高DAR值的可控性，對于提升ADC產(chǎn)品 質(zhì)量以及降低工藝風(fēng)險和成本而言，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0008]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對ADC藥物純化方面現(xiàn)有技術(shù)的不足和空缺，本發(fā)明提供了一種抗體偶聯(lián)藥物 (ADC)的陽離子交換層析純化方法，通過所述陽離子純化技術(shù)，同時實(shí)現(xiàn)對ADC藥物的小分 子/抗體的摩爾偶聯(lián)比（DAR)和多聚體的控制，這有助于開發(fā)可控性更強(qiáng)、成本和風(fēng)險更低 的ADC生產(chǎn)工藝，以獲得質(zhì)量更高的產(chǎn)品，保證藥物的安全性和治療效果。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明詳細(xì)的技術(shù)方案如下： 一種抗體偶聯(lián)藥物的陽離子交換層析純化方法，利用陽離子交換層析來純化抗體偶聯(lián) 藥物，控制小分子/抗體偶聯(lián)比（DAR)和多聚體，所述純化方法包括以下步驟： 調(diào)節(jié)ADC樣品及平衡緩沖液至pH 4-7、電導(dǎo)2-8 mS/cm，選用結(jié)合-洗脫模式或過載模 式進(jìn)行純化。
[0011] 進(jìn)一步的，所述的過載模式上樣量不低于300 mg/mL介質(zhì)；所述的過載模式的過 程包括：平衡緩沖液平衡層析介質(zhì)，然后進(jìn)行抗體偶聯(lián)藥物上樣，待ADC樣品吸附飽和繼而 開始流穿后，收集DAR值和多聚體含量符合要求的目標(biāo)蛋白流穿液，雜質(zhì)多聚體以及DAR值 偏高的蛋白質(zhì)則吸附在層析柱上。
[0012] 進(jìn)一步的，所述的結(jié)合-洗脫模式上樣量不超過層析介質(zhì)實(shí)際動態(tài)載量的90% ;所 述的結(jié)合-洗脫模式的過程包括：平衡緩沖液平衡層析介質(zhì)，然后進(jìn)行抗體偶聯(lián)藥物上樣， 并用洗脫緩沖液（pH 4-7,電導(dǎo)10-30 mS/cm)對結(jié)合的ADC抗體進(jìn)行梯度洗脫，分段收集洗 脫液，收集DAR值和多聚體含量符合要求的目標(biāo)蛋白洗脫液，而雜質(zhì)多聚體以及DAR值偏高 的蛋白質(zhì)則在其后洗脫出來。
[0013] 進(jìn)一步的，所述的平衡緩沖液和洗脫緩沖液選自但不限于醋酸鹽緩沖液、檸檬酸 鹽緩沖液、琥珀酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
[0014] 進(jìn)一步的，所述的陽離子交換層析介質(zhì)選自但不限于Eshmuno CPX (Millipore)、 P0R0S HS (AB)、P0R0S XS (AB)、Toyopearl Gigacap S-650M (T0S0H)、Toyopearl SP-650M (T0S0H)、Nuvia HR-S (Bio-Rad)和 SP S印harose (GE)，優(yōu)選 Eshmuno CPX 和 P0R0S XS 這 兩種新型的高載量陽離子層析介質(zhì)。
[0015] 進(jìn)一步的，所述的抗體偶聯(lián)藥物由小分子毒素通過接頭與抗體偶聯(lián)構(gòu)成，其中偶 聯(lián)比（DAR)為2-5。尤其適用于處理DAR值偏高（彡3. 7)的ADC樣品。
[0016] 進(jìn)一步的，所述的抗體為單克隆抗體，優(yōu)選的，所述的單克隆抗體為人源化單克隆 抗體。
[0017] 進(jìn)一步的，所述的小分子毒素選自但不限于美登素及其衍生物和海兔毒素及其衍 生物。
[0018] 進(jìn)一步的，所述的抗體偶聯(lián)藥物的偶聯(lián)方式包括但不限于賴氨酸偶聯(lián)、輕重鏈間 還原性二硫鍵偶聯(lián)和定點(diǎn)偶聯(lián)。
[0019] 收集的樣品分別采用紫外（UV)分光光度法進(jìn)行DAR值監(jiān)測，采用分子排阻液相色 譜法（SEC-HPLC)進(jìn)行多聚體含量監(jiān)測。
[0020] 本發(fā)明中，ADC樣品的定義為：將抗體通過接頭與小分子毒素進(jìn)行共價結(jié)合后所 形成的抗體偶聯(lián)藥物，涉及賴氨酸偶聯(lián)、輕重鏈間還原性二硫鍵偶聯(lián)和定點(diǎn)偶聯(lián)等不同的 偶聯(lián)方式。所述的抗體可為多克隆抗體或單克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體。小分子毒素可選 自美登素衍生物DM1 (N2' -脫乙酰-N2' -3-巰基-1氧代丙基）-美登素)、DM4 (N2' -脫 乙酰-N2' -4-甲基-4巰基-1氧代戊基）-美登素）及其類似物、海兔毒素衍生物MMAE (Monomethyl Auristatin E，甲基澳瑞他汀 E)、MMAF (Monomethyl Auristatin F，甲基澳 瑞他汀F)及其類似物。優(yōu)選的小分子毒素為DM1。所述的接頭優(yōu)選為SMCC (4- (N-馬來 酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯)。
[0021] 本發(fā)明通過pH 4-7、電導(dǎo)2-8 mS/cm范圍內(nèi)的動態(tài)載量D0E實(shí)驗(yàn)確定所述的陽離 子交換層析法的上樣條件。
[0022] 在本發(fā)明中，所述的過載陽離子交換層析法采用流穿模式，適用于大規(guī)模樣品的 處理，層析載量超過300 mg/mL介質(zhì)。
[0023] 在本發(fā)明中，所述的陽離子交換層析法采用結(jié)合-洗脫模式，上樣量不超過層析 介質(zhì)實(shí)際動態(tài)載量的90%。對于高載量陽離子層析介質(zhì)而言，通過控制收集范圍可將DAR值 維持在極窄的目標(biāo)范圍（3. 5±0. 1)內(nèi)。對于賴氨酸偶聯(lián)的ADC樣品，多聚體的去除率可達(dá) 到40%以上，回收率可維持在86%以上；對于半胱氨酸偶聯(lián)的ADC樣品，多聚體的去除率可 達(dá)到60%以上，回收率也可維持在79%以上。
[0024] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為： 1、 本發(fā)明提供了一種ADC制備和純化的新思路。ADC藥物的DAR值決定了產(chǎn)品的有效 性和毒性，因此需將其控制在一個穩(wěn)定的范圍內(nèi)。另外，作為工藝相關(guān)雜質(zhì)，多聚體的存在 會引起免疫原性，應(yīng)盡可能使產(chǎn)品中多聚體的含量降至最低。本發(fā)明通過一種純化的手段， 即采用陽離子交換層析的方法，對修飾偶聯(lián)工藝的關(guān)鍵中控指標(biāo)DAR值實(shí)施有效地控制和 糾偏，同時實(shí)現(xiàn)多聚體的大比例去除；本發(fā)明有別于傳統(tǒng)裸抗體的純化策略，首次將陽離子 交換層析應(yīng)用于ADC樣品的DAR值控制，擴(kuò)展了陽離子交換層析方法的應(yīng)用范圍和用途； 2、 本發(fā)明還提供過載模式與結(jié)合-洗脫模式這兩種不同的純化方案，在實(shí)際研發(fā)和生 產(chǎn)過程中，可根據(jù)工藝規(guī)模、處理量、產(chǎn)品的狀態(tài)靈活地選擇最適合的純化方式。如過載模 式尤其適用于大量ADC樣品的純化，因其受純化介質(zhì)的載量限制較少，而且操作簡便。而結(jié) 合-洗脫模式雖然處理量不如過載模式，但可通過控制收集范圍對DAR值和多聚體含量實(shí) 現(xiàn)更為精細(xì)的控制。綜上所述，本發(fā)明可起到降低ADC產(chǎn)品的生產(chǎn)成本和控制風(fēng)險、提高工 藝可控性和產(chǎn)品質(zhì)量的作用。
[0025]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為實(shí)施例5中三種層析介質(zhì)P0R0S HS (A)、P0R0S XS (B)和Eshmuno CPX (C)的動態(tài)載量（DBC)等高線圖，橫坐標(biāo)為pH，縱坐標(biāo)為電導(dǎo)。顏色越深的區(qū)域DBC越高， 亦即選用顏色越深的區(qū)域所對應(yīng)的pH和電導(dǎo)，介質(zhì)對樣品的吸附載量越高。D0E實(shí)驗(yàn)的考 察范圍為pH 4-7,電導(dǎo)2-8 mS/cm。
[0027] 圖2為實(shí)施例6中采用層析介質(zhì)P0R0S HS的過載模式進(jìn)行不同流速純化ADC樣 品的結(jié)果。其中圖A為AKTA譜圖，橫坐標(biāo)為ADC樣品的上樣量，縱坐標(biāo)為UV28Qnm處的吸收 值（mAU)，樣品吸附飽和后開始流穿，P1和P2分別為400 mM醋酸鈉緩沖液（pH 5,電導(dǎo)24 mS/cm)洗脫峰和0. 5 M NaOH洗脫峰。其中圖B為多聚體及DAR值的測定結(jié)果，橫坐標(biāo)為經(jīng) 純化的ADC樣品的合并收集量(mg)，左縱坐標(biāo)為收集的樣品合并后的多聚體含量與原液中 多聚體含量的比值（C/Q)，右縱坐標(biāo)為收集的樣品所對應(yīng)的合并后DAR值。先流穿出來的 ADC樣品，多聚體含量和DAR值均較低。不同流速下，DAR值曲線均呈上升趨勢，而C/Q曲 線上升的速率不同，低流速下C/Q到達(dá)平臺期更緩慢，有利于多聚體的去除。
[0028] 圖3-圖7均為實(shí)施例7中的結(jié)合-洗脫模式純化結(jié)果，其中圖3、圖4、圖5分別為 層析介質(zhì)P0R0S 50 HS (圖3)、P0R0S XS (圖4)和Eshmuno CPX (圖5)在賴氨酸偶聯(lián)ADC 樣品中的應(yīng)用，圖6、圖7分別為層析介質(zhì)P0R0S XS (圖6)和Eshmuno CPX (圖7)在半胱 氨酸偶聯(lián)ADC樣品中的應(yīng)用。其中A圖為純化AKTA色譜圖，橫坐標(biāo)為流出體積（mL)，左縱 坐標(biāo)為UV 28(tam處的吸收值（mAU)，右縱坐標(biāo)為溶液的電導(dǎo)值，ADC樣品隨著電導(dǎo)逐漸升高不 斷被洗脫下來。其中B圖為分段收集ADC樣品的多聚體（HMW)和DAR值測定結(jié)果，橫坐標(biāo) 為收集的體積，左縱坐標(biāo)為收集的樣品中多聚體含量與原液中聚體含量的比值（C/Q)，右 縱坐標(biāo)為收集的樣品所對應(yīng)的DAR值。先洗脫出來的樣品多聚體含量低，DAR值也較低；而 多聚體含量高、DAR值較高的組分則在其后洗脫下來，這樣就可達(dá)到分離多聚體組分和控制 樣品DAR值的目的。圖C為分子排阻色譜（SEC-HPLC)的色譜圖，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)出峰時間 (min)，縱坐標(biāo)為UV 28(lnm處的吸收值(mAU)，單體目標(biāo)蛋白在15-16 min出峰，多聚體在12-14 min出峰，后洗脫出來的樣品多聚體比例明顯升高。
[0029]

【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例1 一種抗體偶聯(lián)藥物的陽離子交換層析純化方法，利用陽離子交換層析來純化抗體偶聯(lián) 藥物，控制小分子/抗體偶聯(lián)比（DAR)和多聚體，所述純化方法包括以下步驟： 調(diào)節(jié)ADC樣品及平衡緩沖液至pH 4-7、電導(dǎo)2-8 mS/cm，選用結(jié)合-洗脫模式或過載模 式進(jìn)行純化。
[0031] 進(jìn)一步的，所述的過載模式上樣量不低于300 mg/mL介質(zhì)；所述的過載模式的過 程包括：平衡緩沖液平衡層析介質(zhì)，然后進(jìn)行抗體偶聯(lián)藥物上樣，待ADC樣品吸附飽和繼而 開始流穿后，收集DAR值和多聚體含量符合要求的目標(biāo)蛋白流穿液，雜質(zhì)多聚體以及DAR值 偏高的蛋白質(zhì)則吸附在層析柱上。
[0032] 進(jìn)一步的，所述的結(jié)合-洗脫模式上樣量不超過層析介質(zhì)實(shí)際動態(tài)載量的90% ;所 述的結(jié)合-洗脫模式的過程包括：平衡緩沖液平衡層析介質(zhì)，然后進(jìn)行抗體偶聯(lián)藥物上樣， 并用洗脫緩沖液（pH 4-7,電導(dǎo)10-30 mS/cm)對結(jié)合的ADC抗體進(jìn)行梯度洗脫，分段收集洗 脫液，收集DAR值和多聚體含量符合要求的目標(biāo)蛋白洗脫液，而雜質(zhì)多聚體以及DAR值偏高 的蛋白質(zhì)則在其后洗脫出來。
[0033] 進(jìn)一步的，所述的平衡緩沖液和洗脫緩沖液選自但不限于醋酸鹽緩沖液、檸檬酸 鹽緩沖液、琥珀酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
[0034] 進(jìn)一步的，所述的陽離子交換層析介質(zhì)選自但不限于Eshmuno CPX (Millipore)、 P0R0S HS (AB)、P0R0S XS (AB)、Toyopearl Gigacap S-650M (T0S0H)、Toyopearl SP-650M (T0S0H)、Nuvia HR-S (Bio-Rad)和 SP S印harose (GE)，優(yōu)選 Eshmuno CPX 和 P0R0S XS 這 兩種新型的高載量陽離子層析介質(zhì)。
[0035] 進(jìn)一步的，所述的抗體偶聯(lián)藥物由小分子毒素通過接頭與抗體偶聯(lián)構(gòu)成，其中偶 聯(lián)比（DAR)為2-5。尤其適用于處理DAR值偏高（彡3. 7)的ADC樣品。
[0036] 進(jìn)一步的，所述的抗體為單克隆抗體，優(yōu)選的，所述的單克隆抗體為人源化單克隆 抗體。
[0037] 進(jìn)一步的，所述的小分子毒素選自但不限于美登素衍生物和海兔毒素衍生物。
[0038] 進(jìn)一步的，所述的抗體偶聯(lián)藥物的偶聯(lián)方式包括但不限于賴氨酸偶聯(lián)、輕重鏈間 還原性二硫鍵偶聯(lián)和定點(diǎn)偶聯(lián)。
[0039] 收集的樣品分別采用紫外（UV)分光光度法進(jìn)行DAR值監(jiān)測，采用分子排阻液相色 譜法（SEC-HPLC)進(jìn)行多聚體含量監(jiān)測。
[0040] 本發(fā)明通過pH 4-7、電導(dǎo)2-8 mS/cm范圍內(nèi)的動態(tài)載量DOE實(shí)驗(yàn)確定所述的陽離 子交換層析法的上樣條件。
[0041] 實(shí)施例2抗體偶聯(lián)藥物（ADC)的制備 賴氨酸偶聯(lián)ADC樣品的制備：進(jìn)行修飾反應(yīng)前，將抗體(Ab)原液置換至修飾反應(yīng)緩沖 溶液中。加入雙功能交聯(lián)試劑SMCC (接頭)對賴氨酸進(jìn)行修飾，反應(yīng)持續(xù)2-3小時。修飾反 應(yīng)結(jié)束后，通過G25葡聚糖凝膠層析或切向流過濾（UF/DF)系統(tǒng)除去未與抗體連接的SMCC， 并將修飾后的中間產(chǎn)物Ab-MCC置換到偶聯(lián)緩沖液（pH 5-6)中。隨后加入小分子毒素 DM1， 與抗體上的接頭偶聯(lián)，反應(yīng)持續(xù)3-15小時，得到備用的賴氨酸偶聯(lián)ADC樣品（Ab-DMl )，紫外 分光光度法測得DAR值為3. 7-3. 8。
[0042] 半胱氨酸偶聯(lián)ADC樣品的制備：將Ab原液置換至反應(yīng)緩沖液中（pH 7-8)。加入還 原劑TCEP反應(yīng)1-2小時，使得抗體的鏈間二硫鍵被打開，形成游離的巰基。隨后加入連有 接頭的小分子毒素 MMAE (MC-VC-PAB-MMAE)，與抗體上被還原的巰基偶聯(lián)。反應(yīng)結(jié)束后，力口 入N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC)終止反應(yīng)。調(diào)節(jié)pH至5-6,得到備用的半胱氨酸偶聯(lián)ADC 樣品（Ab-MMAE)，紫外分光光度法測得DAR值為4. 1-4. 2。
[0043] 實(shí)施例3DAR值測定 實(shí)施例2制備所得的ADC樣品，采用紫外（UV)分光光度法測定小分子藥物/抗體的偶 聯(lián)比。根據(jù)抗體和藥物在不同波長處的消光系數(shù)不同，由二元一次方程求導(dǎo)藥物抗體偶聯(lián) t匕（DAR)。具體為：將抗體偶聯(lián)物稀釋至0. 3~0. 5 mg/mL，在230?330 nm波長內(nèi)對稀釋后 的ADC樣品進(jìn)行吸光度掃描。抗體的最大吸收峰在280 nm，小分子DM1的最大吸收峰在252 nm，小分子MMAE的最大吸收峰在248 nm。對于Ab-DMl樣品分別選取252 nm和280 nm處的 吸光度，對于Ab-MMAE樣品則分別選取248 nm和280 nm處的吸光度，按照文獻(xiàn)(于傳飛等. 一種抗體藥物偶聯(lián)物中藥物抗體偶聯(lián)比的測定.藥學(xué)學(xué)報，2014，49 (3): 363-367)所 述的方法，計算DAR值以及ADC樣品的濃度。
[0044] 實(shí)施例4多聚體檢測 實(shí)施例2制備所得的ADC樣品，通過分子排阻色譜法（SEC)測定其多聚體的含量。所 使用的液相色譜柱為TSKG3000SWXL，使用的高效液相系統(tǒng)為Agilent HPLC系統(tǒng)。流動相為 含15%異丙醇的磷酸鹽緩沖液（pH 7)，檢測波長為280 nm。充分平衡色譜柱，待基線穩(wěn)定 后進(jìn)樣。進(jìn)行等度洗脫，流速為0.5 mL/min，柱溫25°C。按照面積歸一法計算ADC樣品中 多聚體和單體所占的比例。
[0045] 實(shí)施例5不同的層析介質(zhì)中ADC樣品的動態(tài)載量 將實(shí)施例2中制得的ADC樣品置換到65 mM醋酸鈉緩沖液中（pH 5-6,電導(dǎo)5 mS/cm)。 置換后的樣品等分后，分別用1 Μ醋酸或1 M NaOH將ADC樣品的pH調(diào)整至4-7,用相應(yīng) pH的400 mM醋酸鈉緩沖液或純化水調(diào)節(jié)電導(dǎo)至2-8 mS/cm。分別將層析介質(zhì)P0R0S HS、 P0R0S XS和Eshmuno CPX裝填到層析柱中。利用AKTA Purifier 100層析系統(tǒng)，以相應(yīng)pH 和電導(dǎo)的醋酸鈉緩沖液（10倍柱體積以上）充分平衡層析柱后，以120 cm/hr的流速上樣， 通過UV28(tam處的吸收值監(jiān)測樣品的流穿情況。待UV28tol曲線上升趨于平緩，結(jié)束上樣。流 動相切換成400 mM醋酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫，最后用0.5 M NaOH溶液清洗層析柱。計算10% 穿透時的動態(tài)載量。利用JMP 10軟件，繪制不同的層析介質(zhì)、不同的pH和電導(dǎo)條件下測得 的ADC樣品動態(tài)載量結(jié)果的等高線圖，結(jié)果如附圖1所示。依此確定陽離子交換層析的上 樣條件，上樣載量控制為不超過層析介質(zhì)實(shí)際動態(tài)載量的90%。可以看到，Eshmuno CPX和 POROS XS這兩種新型的陽離子純化介質(zhì)具有較高的動態(tài)載量。
[0046] 實(shí)施例6采用過載模式的陽離子交換層析方法純化ADC樣品 將實(shí)施例2中制得的ADC樣品置換到90 mM醋酸鈉緩沖液中（pH 5,電導(dǎo)6 mS/cm)。將 層析介質(zhì)POROS 50HS裝填到層析柱中，利用AKTA Purifier 100層析系統(tǒng)進(jìn)行過載模式的 陽離子層析實(shí)驗(yàn)。用90 mM醋酸鈉緩沖液（pH 5,電導(dǎo)6 mS/cm)充分平衡層析柱后上樣，上 樣量為1100-1300 mg/mL介質(zhì)。為了考察流速對試驗(yàn)結(jié)果的影響，流速分別設(shè)定為120 cm/ hr和80 cm/hr。待ADC抗體吸附飽和繼而開始流穿后，按5-7 mL/管收集流穿液。待上樣 完成后，用90 mM醋酸鈉緩沖液（pH 5,電導(dǎo)6 mS/cm)沖洗平衡至基線，400 mM醋酸鈉緩 沖液（pH 5,電導(dǎo)24 mS/cm)洗脫，最后利用0.5 M NaOH溶液清洗層析柱。分段收集的樣品 分別采用實(shí)施例3的紫外（UV)分光光度法以及實(shí)施例4的分子排阻液相色譜（SEC-HPLC) 法進(jìn)行檢測。色譜圖、SEC和DAR值的測定結(jié)果參見附圖2。
[0047] 結(jié)果顯示，不同流速下收集的目標(biāo)蛋白C/Q均呈上升趨勢，說明先流穿出來的ADC 樣品多聚體含量低，可以達(dá)到去除多聚體的效果。不同流速下C/Q曲線上升的速率不同， 低流速下C/Q到達(dá)平臺期更緩慢，有利于多聚體的去除。不同流速下，DAR值曲線均呈上升 趨勢。在過載模式下，我們可以通過控制ADC樣品的上樣量實(shí)現(xiàn)DAR值的控制。過載模式 的處理量大,層析載量超過300 mg/mL介質(zhì)，適用于大規(guī)模ADC樣品的純化。而且通過流穿 模式收集樣品，操作相對簡單。
[0048] 實(shí)施例7采用結(jié)合-洗脫模式的陽離子交換層析方法純化ADC樣品 將實(shí)施例2中制得的ADC樣品置換到90 mM醋酸鈉緩沖液中（pH 5,電導(dǎo)6 mS/cm)。 分別裝填三種不同的層析介質(zhì)（POROS HS、POROS XS和Eshmuno CPX)的層析柱，利用AKTA Purifier 100層析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)合-洗脫模式的陽離子層析實(shí)驗(yàn)。首先用A液：90 mM醋酸鈉 緩沖液（pH 5,電導(dǎo)6 mS/cm)充分平衡層析柱后上樣，上樣量為60 mg/mL介質(zhì)，流速為120 cm/hr。待上樣完成后，用90 mM醋酸鈉緩沖液（pH 5,電導(dǎo)6 mS/cm)沖洗至基線。然后用 B液：400 mM醋酸鈉緩沖液（pH 5,電導(dǎo)24 mS/cm)按0 - 100% B液、20 CV的梯度進(jìn)行線 性洗脫，分段收集洗脫液。最后利用0.5 M NaOH溶液清洗層析柱。分段收集的樣品分別采 用實(shí)施例3的紫外（UV)分光光度法以及實(shí)施例4的分子排阻液相色譜（SEC-HPLC)法進(jìn)行 檢測。各層析介質(zhì)的色譜圖、SEC和DAR值的測定結(jié)果分別見附圖3-7及表1-5。
[0049] 如表1-5的結(jié)果所示，在結(jié)合-洗脫模式的陽離子交換層析中，合并不同階段收 集的樣品，可得到DAR值不同且多聚體去除率各異的樣品。尤其對于POROS XS和Eshmuno CPX這兩種新型的高載量陽離子層析介質(zhì)而言，通過控制收集范圍可將DAR值維持在較窄 的目標(biāo)范圍（3. 5±0. 1)內(nèi)。如表2和表3所不，對于通過賴氨酸偶聯(lián)的ADC樣品（Ab-DMl)， 多聚體的去除率可達(dá)到40%以上，回收率可保持在86%以上。如表4和表5所示，對于通過 半胱氨酸偶聯(lián)的ADC樣品（Ab-MMAE)，多聚體的去除率可達(dá)到60%以上，回收率也可保持在 79%以上。
[0050] 本發(fā)明能夠有效地去除ADC產(chǎn)品中的多聚體，提高ADC產(chǎn)品的質(zhì)量；也能夠有效地 控制ADC產(chǎn)品的DAR值，使得ADC產(chǎn)品的生產(chǎn)風(fēng)險和成本降低、工藝可控性提高。因此，本 發(fā)明對于ADC產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)具有重要的意義。
[0051] 表1層析介質(zhì)POROS HS的結(jié)合-洗脫模式純化結(jié)果(賴氨酸偶聯(lián)ADC樣品）

【權(quán)利要求】
1. 一種抗體偶聯(lián)藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，利用陽離子交換層析 來純化抗體偶聯(lián)藥物，控制小分子/抗體偶聯(lián)比（DAR)和多聚體，所述純化方法包括以下步 驟： 調(diào)節(jié)ADC樣品及平衡緩沖液至pH 4-7、電導(dǎo)2-8 mS/cm，選用結(jié)合-洗脫模式或過載模 式進(jìn)行純化。
2. 如權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，所述 的過載模式上樣量不低于300 mg/mL介質(zhì)； 所述的過載模式的過程包括：平衡緩沖液平衡層析介質(zhì)，然后進(jìn)行抗體偶聯(lián)藥物上樣， 待ADC樣品吸附飽和繼而開始流穿后，收集目標(biāo)蛋白流穿液，雜質(zhì)多聚體以及DAR值偏高的 蛋白質(zhì)則吸附在層析柱上。
3. 如權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，所述 的結(jié)合-洗脫模式上樣量不超過層析介質(zhì)實(shí)際動態(tài)載量的90% ; 所述的結(jié)合-洗脫模式的過程包括：平衡緩沖液平衡層析介質(zhì)，然后進(jìn)行抗體偶聯(lián)藥 物上樣，并用pH 4-7、電導(dǎo)10-30 mS/cm的洗脫緩沖液對結(jié)合的ADC抗體進(jìn)行梯度洗脫，收 集目標(biāo)蛋白洗脫液，而雜質(zhì)多聚體以及DAR值偏高的蛋白質(zhì)則在其后洗脫出來。
4. 如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的抗體偶聯(lián)藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在 于，所述的平衡緩沖液和洗脫緩沖液選自但不限于醋酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、琥珀酸 緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
5. 如權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，所 述的陽離子交換層析介質(zhì)選自但不限于Eshmuno CPX、POROS HS、POROS XS、Toyopearl Gigacap S-650M、Toyopearl SP_650M、Nuvia HR-S和 SP Sepharose。
6. 如權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，所述 的抗體偶聯(lián)藥物由小分子毒素通過接頭與抗體偶聯(lián)構(gòu)成，其中偶聯(lián)比（DAR)為2-5。
7. 如權(quán)利要求6所述的抗體偶聯(lián)藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，所述 的抗體為單克隆抗體。
8. 如權(quán)利要求7所述的抗體偶聯(lián)藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，所述 的單克隆抗體為人源化單克隆抗體。
9. 如權(quán)利要求6所述的抗體偶聯(lián)藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，所述 的小分子毒素選自但不限于美登素及其衍生物和海兔毒素及其衍生物。
10. 如權(quán)利要求6-9所述的抗體偶聯(lián)藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，所 述的抗體偶聯(lián)藥物的偶聯(lián)方式包括但不限于賴氨酸偶聯(lián)、輕重鏈間還原性二硫鍵偶聯(lián)和定 點(diǎn)偶聯(lián)。
【文檔編號】B01D15/36GK104208719SQ201410492940
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】劉慧芳, 黎曉維, 金春陽, 郜富權(quán), 謝晨穎, 李鋒 申請人:北京天廣實(shí)生物技術(shù)股份有限公司