黃曲霉毒素b1適配體親和柱的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種黃曲霉毒素B1適配體親和柱的制備方法，屬于親和層析和真菌毒素分析領(lǐng)域。采用環(huán)氧活化瓊脂糖微球FF作為固相載體，與氨基修飾黃曲霉毒素B1適配體偶聯(lián)后，封閉載體中多余活性位點(diǎn)，填入微型小柱制成。所制備的適配體親和柱能與黃曲霉毒素B1特異性結(jié)合，其加標(biāo)回收率在70~110之間，至少可以重復(fù)使用五次。
【專(zhuān)利說(shuō)明】黃曲霉毒素B1適配體親和柱的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及親和層析及真菌毒素檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及黃曲霉毒素B1適配體 親和柱的制備方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 黃曲霉毒素B1均為黃曲霉菌、寄生曲霉菌產(chǎn)生的代謝物，具有致癌、致畸、致突變 的作用，是迄今發(fā)現(xiàn)的最穩(wěn)定的一種真菌毒素，一般食品加工條件都不易破壞，因此給消費(fèi) 者的飲食安全埋下了巨大的隱患。各國(guó)對(duì)食品中黃曲霉毒素殘留量現(xiàn)狀非常重視，制定了 相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)，如我國(guó)規(guī)定大米、食用油中黃曲霉毒素允許量標(biāo)準(zhǔn)為（Bl + B2 + G1 + G2) 10 ng /g〇
[0003] 目前，黃曲霉毒素B1的分析方法中，常用的有高效液相色譜、毛細(xì)管電泳、液質(zhì)聯(lián) 用等。這些儀器分析方法對(duì)樣品純度要求較高，需要經(jīng)過(guò)一些前處理，傳統(tǒng)的前處理技術(shù)有 免疫親和柱、多功能凈化柱等，這些凈化柱價(jià)格較貴，多為一次性的。建立高選擇、快速有效 的樣品前處理技術(shù)已成為黃曲霉毒素B1檢測(cè)分析中需要解決的重要問(wèn)題。 基于適配體親和層析是一種新型高效樣品前處理技術(shù)。它的原理是利用適配體對(duì)靶分 子選擇性吸附來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品中靶分子的提取和凈化處理，這種吸附是可逆的。適配體 的親和層析結(jié)合常規(guī)儀器分析已成為真菌毒素分析的一個(gè)發(fā)展方向，但目前尚未見(jiàn)其適配 體親和柱的制備方法及其應(yīng)用報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種黃曲霉毒素B1適配體親和柱的制備方法，所研制的 親和柱是將氨基修飾的黃曲霉毒素B1適配體與環(huán)氧活化的瓊脂糖6FF偶聯(lián)填充于固相萃 取柱中，用于純化含黃曲霉毒素B1的待測(cè)樣品。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種黃曲霉毒素B1適配體親和柱的制備方法，其步驟：1 活化：取60mg的環(huán)氧活化瓊脂糖微球FF在2mL去離子水中懸浮溶脹成凝膠1小時(shí)。用60mL 去離子水分三次洗滌凝膠，靜置5min后，移除清洗液；2偶聯(lián)：將氨基修飾的黃曲霉毒素B1 適配體溶于lmL20. Ommol/LpHlO. 0的磷酸鹽緩沖液中。將步驟1中溶脹凝膠懸浮于含適配 體的緩沖液中，在37°C的水浴中振搖16小時(shí)。反應(yīng)完后，再用3mL去離子水洗滌未反應(yīng)的適 配體，靜置5min后，移除清洗液；3封閉：將步驟（2)中凝膠懸浮到2mLlmol/LpH8. 0乙醇胺 溶液中，在50°C的水浴中振搖4小時(shí)，反應(yīng)完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0? lmol/LpH4.0 乙酸緩沖液和3mL含0. 5mol/LNaCl的pH8. 3偶聯(lián)緩沖液交替清洗，每次清洗2min，至少循 環(huán)3次；4裝柱：將步驟3的懸浮凝膠液移入固相萃取小柱（內(nèi)徑5. 0 mm，容積1. OmL)，避免 產(chǎn)生氣泡，用5mL0. lmol/LpH8. 0磷酸鹽緩沖液平衡小柱。
[0006] 其中步驟2中氨基修飾的黃曲霉毒素B1適配體為DNA合成公司商品化生產(chǎn)，黃曲 霉毒素B1 適配體的序列為：5'-ITT ITT GIT GGG CAC GTG ITG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA C-NH2-3，。
[0007] 本發(fā)明黃曲霉毒素B1適配體親和柱的應(yīng)用方法，按下述步驟進(jìn)行：a上樣：放掉柱 內(nèi)溶液，將提取的樣品用〇. lmol/LpH8.0磷酸鹽緩沖液溶解或稀釋?zhuān)蠘印Ｉ蠘訒r(shí)流速不超 過(guò)lmL/min，避免樣品流干。b淋洗：待樣品過(guò)柱后，用3 mL二次水淋洗柱床、棄去。c洗脫： 用3mL甲醇洗脫，在50°C下氮?dú)獯蹈?，用流?dòng)相定容待測(cè)。d再生：對(duì)于使用之后的凝膠，以 2?3 倍柱體積的含 0? 5mol/LNaCl 的 0? lmol/LpH8. 3Tris-HCl 和含 0? 5mol/LNaCl 的 0? lmol/ pH4. 5乙酸緩沖液交替沖洗2?3次。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明制備的適配體親和柱能夠與黃曲霉毒素B1特異性結(jié) 合，一次凈化能除去絕大部分干擾物。制備的適配體親和柱最大結(jié)合容量約為80 ng黃曲 霉毒素B1。采用的洗脫液為甲醇時(shí)，加標(biāo)回收率在70~110%之間。制備的適配體親和柱重 復(fù)使用5次，回收率不低于70%。

【具體實(shí)施方式】
[0009] 本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進(jìn)一步說(shuō)明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi) 容或范圍。下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0010] 實(shí)施例1黃曲霉毒素B1適配體親和柱的制備： 1活化：取60mg的環(huán)氧活化瓊脂糖微球FF在2mL去離子水中懸浮溶脹成凝膠1小時(shí)。 用60mL去離子水分三次洗滌凝膠，靜置5min后，移除清洗液； 2偶聯(lián)：將氨基修飾的黃曲霉毒素B1適配體溶于lmL20. Ommol/LpHlO. 0的磷酸鹽緩沖 液中。將步驟1中溶脹凝膠懸浮于含適配體的緩沖液中，在37°C的水浴中振搖16小時(shí)。反 應(yīng)完后，再用3mL去離子水洗漆未反應(yīng)的適配體，靜置5min后,移除清洗液； 3封閉：將步驟2中凝膠懸浮到2mLlmol/LpH8. 0乙醇胺溶液中，在50°C的水浴中振搖 4小時(shí)，反應(yīng)完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0?lmol/LpH4.0乙酸緩沖液和3mL含0.5mol/ LNaCl的pH8. 3偶聯(lián)緩沖液交替清洗，每次清洗2min，至少循環(huán)3次； 4裝柱：將步驟3的懸浮凝膠液移入固相萃取小柱（內(nèi)徑5. 0 mm，容積1. OmL)，避免產(chǎn) 生氣泡，用5mL0. lmol/LpH8. 0磷酸鹽緩沖液平衡小柱。
[0011] 其中步驟2中氨基修飾的黃曲霉毒素B1適配體為DNA合成公司商品化生產(chǎn)。
[0012] 本發(fā)明所述黃曲霉毒素B1適配體親和柱的性能評(píng)價(jià)方法： 實(shí)施例1所制備的親和柱最大結(jié)合容量的測(cè)定：分別用10mL20. 0ng/mL (200ng)過(guò)黃 曲霉毒素B1親和柱。上樣液每毫升收集一管，用HPLC-MS/MS測(cè)定每管中黃曲霉毒素B1含 量。根據(jù)下式計(jì)算：最大結(jié)合容量（即被吸附的黃曲霉毒素B1總量）等于上樣總量減去洗 下的黃曲霉毒素B1總量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，l~5mL上樣液只測(cè)出黃曲霉毒素B1，到5mL開(kāi)始無(wú)吸 附。因此，偶聯(lián)1.9 nmol/L黃曲霉毒素B1適配體的親和柱最大結(jié)合容量約為80 ng。
[0013] 實(shí)施例1所制備的親和柱加標(biāo)回收率和重復(fù)性測(cè)定：分別上樣20mL的0. 5ng/mL、 1.0 ng/mL、2. 0ng/mL三種不同濃度的黃曲霉毒素B1，每種濃度作三組平行。收集洗滌液后 用HPLC-MS/MS測(cè)定回收率。結(jié)果見(jiàn)表1，經(jīng)測(cè)定回收率均達(dá)到90%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差少于 10%。
[0014] 表1制備的黃曲霉毒素B1親和柱加標(biāo)回收率和重復(fù)性

【權(quán)利要求】
1. 一種黃曲霉毒素B1適配體親和柱的制備方法，其步驟：（1)活化：取60mg的環(huán)氧 活化瓊脂糖微球FF在2mL去離子水中懸浮溶脹成凝膠1小時(shí)，用60mL去離子水分三次 洗滌凝膠，靜置5min后，移除清洗液；（2)偶聯(lián)：將氨基修飾的黃曲霉毒素B1適配體溶于 lmL20. Ommol/LpHlO. 0的磷酸鹽緩沖液中，將步驟（1)中溶脹凝膠懸浮于含適配體的緩沖 液中，在37°C的水浴中振搖16小時(shí)，反應(yīng)完后，再用3mL去離子水洗滌未反應(yīng)的適配體，靜 置5min后，移除清洗液；（3)封閉：將步驟（2)中凝膠懸浮到2mLlmol/LpH8. 0乙醇胺溶液 中，在50°C的水浴中振搖4小時(shí)，反應(yīng)完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0? lmol/LpH4.0乙 酸緩沖液和3mL含0. 5mol/LNaCl的pH8. 3偶聯(lián)緩沖液交替清洗，每次清洗2min，至少循環(huán) 3次；（4)裝柱：將步驟（3)的懸浮凝膠液移入固相萃取小柱，避免產(chǎn)生氣泡，用5mL0. lmol/ LpH8. 0磷酸鹽緩沖液平衡小柱。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述黃曲霉毒素B1適配體親和柱的制備方法，其特征在于：其中步 驟（2)中氨基修飾的黃曲霉毒素B1適配體為DNA合成公司商品化生產(chǎn)，黃曲霉毒素B1適配 體的序列為：5，_ NH2-TIT ITT GIT GGG CAC GTG ITG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA C -3，。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述黃曲霉毒素B1適配體親和柱的制備方法，其特征在于：本發(fā)明 黃曲霉毒素B1適配體親和柱的應(yīng)用方法，按下述步驟進(jìn)行：（a)上樣：放掉柱內(nèi)溶液，將提 取的樣品用〇. lmol/LpH8. 0磷酸鹽緩沖液溶解或稀釋?zhuān)蠘?，上樣時(shí)流速不超過(guò)lmL/min， 避免樣品流干；（b)淋洗：待樣品過(guò)柱后，用3 mL去離子水淋洗柱床、棄去；（c)洗脫：用 3mL甲醇洗脫，在50°C下氮?dú)獯蹈?，用流?dòng)相定容待測(cè)；（d)再生：對(duì)于使用之后的凝膠，以 2?3 倍柱體積的含 0? 5mol/LNaCl 的 0? lmol/LpH8. 3Tris-HCl 和含 0? 5mol/LNaCl 的 0? lmol/ pH4. 5乙酸緩沖液交替沖洗2?3次。
【文檔編號(hào)】B01D15/38GK104399283SQ201410723990
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】廖且根, 羅林廣, 李偉紅, 胡麗芳 申請(qǐng)人:江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所