本發(fā)明涉及微流控芯片制備的領(lǐng)域，具體涉及一種基于微流控技術(shù)的多層Transwell芯片制備方法。。

背景技術(shù)：

Transwell實(shí)驗(yàn)技術(shù)，傳統(tǒng)方法是將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細(xì)胞生長、運(yùn)動(dòng)等的影響。但Transwell實(shí)驗(yàn)僅能進(jìn)行簡單地靜態(tài)實(shí)驗(yàn)，不能實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，限制了它的應(yīng)用。

微流控芯片實(shí)驗(yàn)室又稱芯片實(shí)驗(yàn)室或微流控芯片，指的是把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測、細(xì)胞培養(yǎng)、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室的各種功能的一種技術(shù)。微流控芯片技術(shù)作為一門迅速發(fā)展起來的科學(xué)技術(shù)，已經(jīng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)了其獨(dú)特的優(yōu)勢，更因其同細(xì)胞尺寸匹配、環(huán)境同生理環(huán)境相近、在時(shí)間和空間維度上能夠提供更為精確的操控，易于通過靈活設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞功能研究等特點(diǎn)而成為新一代生物仿生和細(xì)胞研究的重要平臺(tái)。但微流控芯片又難以實(shí)現(xiàn)Transwell實(shí)驗(yàn)的功能，在藥物代謝、細(xì)胞侵襲等研究中受到了極大的限制。

細(xì)胞微環(huán)境能嚴(yán)重影響細(xì)胞的生理響應(yīng)，二維和三維環(huán)境之間的細(xì)胞功能，活力，形態(tài)學(xué)，蛋白表達(dá)，分化，遷移差異明顯。此外，細(xì)胞-細(xì)胞接觸和細(xì)胞 的空間排列方式是細(xì)胞共培養(yǎng)、構(gòu)建體外器官組織的一個(gè)重要問題。在構(gòu)建器官芯片的應(yīng)用中能夠模擬器官生物接口和屏障極其重要，模擬多個(gè)組織或器官的復(fù)雜相互作用。這就需要在微流控芯片上結(jié)合Transwell的優(yōu)勢。目前，利用結(jié)合Transwell技術(shù)的微流控芯片進(jìn)行相關(guān)研究分析還處于空白階段，如能實(shí)現(xiàn)在生物學(xué)研究及醫(yī)藥研發(fā)中具有極大的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于微流控技術(shù)的多層Transwell芯片制備方法，制得的微流控芯片同時(shí)具有Transwell小室和微流控芯片的功能優(yōu)勢，可應(yīng)用于藥物代謝、細(xì)胞侵襲等生物學(xué)研究。

本發(fā)明一種基于微流控技術(shù)的多層Transwell芯片制備方法，使用多孔濾膜通過不可逆封接上層芯片的下表面，封有上層芯片的多孔濾膜下表面通過PDMS與下層芯片的上表面粘合封接，制得的芯片主要由頂層芯片、多孔濾膜、中間層芯片、底層芯片組成。

所述芯片材料為可透光透氣的PDMS聚合物，PDMS單體與引發(fā)劑比例為5:1，多孔濾膜材料為聚碳酸酯膜，聚碳酸酯膜的孔徑為0.01um-10um。

所述中間層芯片數(shù)量可以為0-5個(gè)，中間層芯片的通道為上下通透型。

所述方法中每層芯片的下表面和多孔濾膜為不可逆封接，每層芯片的上表面和多孔濾膜為PDMS粘合。

所述不可逆封接方法為紫外活化1小時(shí)，硅烷化處理30分，氧等離子封接。

所述封有上層芯片的多孔濾膜下表面通過PDMS與下層芯片的上表面粘合封接為：使用單體與引發(fā)劑比例為20:1的PDMS聚合物，在玻片上甩10um-50um厚，芯片上表面蘸取PDMS后，與已不可逆封接有上層芯片的多孔濾膜對齊封接，放入80度烘箱，30分。

本發(fā)明提供的基于微流控技術(shù)的Transwell芯片的制備方法，不同層芯片可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)制成不同形狀、結(jié)構(gòu)的通道。

本發(fā)明提供的基于微流控技術(shù)的Transwell芯片的制備方法，制得的芯片可在不同層芯片根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)接種不同細(xì)胞。

本發(fā)明的方法制得的微流控芯片同時(shí)具Transwell小室和微流控芯片的功能，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞共培養(yǎng)、構(gòu)建體外器官組織的細(xì)胞-細(xì)胞接觸和細(xì)胞的空間排列方式，模擬細(xì)胞的仿生微環(huán)境，在構(gòu)建器官芯片的應(yīng)用中模擬器官生物接口和屏障，模擬多個(gè)組織或器官的復(fù)雜相互作用。可應(yīng)用于藥物代謝、細(xì)胞侵襲等生物學(xué)研究。在未來體外器官的構(gòu)建可以發(fā)揮重要的作用。

附圖說明

圖1本發(fā)明微流控芯片制作流程圖；a雙層芯片制作流程圖；b四層芯片制作流程圖；

圖2本發(fā)明微流控芯片實(shí)物圖；

其中1頂層芯片，2多孔濾膜，3底層芯片，4未固化PDMS，5中間層芯片A，6中間層芯片B，7底層芯片通道，8頂層芯片通道。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例將對本發(fā)明予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。

實(shí)施例1

雙層芯片制作

如圖1(a)所示，多孔濾膜2置于玻片上紫外活化1小時(shí)，硅烷化處理30分鐘，與頂層芯片1一同進(jìn)行氧等離子封接，置80度烘箱，30分鐘。使用單體與引發(fā)劑比例為20:1的PDMS聚合物4，在玻片上甩10um-50um厚，底層芯片3上表面蘸取薄PDMS后，與封接有頂層芯片1的多孔濾膜2對齊粘合，80度， 30分鐘固化完全。

實(shí)施例2

四層芯片制作

如圖1(b)所示，多孔濾膜2置于玻片上紫外活化1小時(shí)，硅烷化處理30分鐘，與頂層芯片1下表面一同進(jìn)行氧等離子封接，置80度烘箱，30分鐘。使用單體與引發(fā)劑比例為20:1的PDMS聚合物4，在玻片上甩10um-50um厚，中間層芯片A5上表面蘸取薄PDMS后，與封接有頂層芯片1的多孔濾膜2對齊粘合，80度，30分鐘固化完全。

多孔濾膜置于玻片上紫外活化1小時(shí)，硅烷化處理30分鐘，與中間層芯片A5下表面一同進(jìn)行氧等離子封接，置80度烘箱，30分鐘。使用單體與引發(fā)劑比例為20:1的PDMS聚合物4，在玻片上甩10um-50um厚，中間層芯片B6上表面蘸取薄PDMS后，與封接有中間層芯片A5的多孔濾膜對齊粘合，80度，30分鐘固化完全。

多孔濾膜置于玻片上紫外活化1小時(shí)，硅烷化處理30分鐘，與中間層芯片B6下表面一同進(jìn)行氧等離子封接，置80度烘箱，30分鐘。使用單體與引發(fā)劑比例為20:1的PDMS聚合物4，在玻片上甩10um-50um厚，底層芯片3上表面蘸取薄PDMS后，與封接有中間層芯片B6的多孔濾膜對齊粘合，80度，30分鐘固化完全。

實(shí)施例3

芯片的制作及表征

制作雙層芯片，通道結(jié)構(gòu)為長彎曲型。在頂層芯片通道8加入粉色染料，如圖2a所示。再在底層芯片通道7加入藍(lán)色染料，如圖2b所示。放置可見上下層通道染料發(fā)生混合，可以實(shí)現(xiàn)上下兩層空間的物質(zhì)交換。