相關(guān)專(zhuān)利申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求于2014年12月5日提交的名稱(chēng)為“用于全柱成像檢測(cè)毛細(xì)管等電聚焦的設(shè)備和方法(apparatusandmethodforwholecolumnimagingdetectioncapillaryisoelectricfocusing)”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)no.62088353的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。

本公開(kāi)總體涉及用于分離諸如蛋白質(zhì)或其他兩性生物分子的分子的毛細(xì)管等電聚焦的技術(shù)領(lǐng)域，并且更具體地涉及用于全柱成像檢測(cè)(wcid)毛細(xì)管等電聚焦(cief)的設(shè)備和方法。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)和其他兩性生物分子的分離和表征在生命科學(xué)研究和工業(yè)中是重要的。等電聚焦(ief)是高分辨率和高濃度分離技術(shù)。ief基于蛋白質(zhì)和其他生物分子的表面電荷分離蛋白質(zhì)和其他生物分子。在ief中，兩性化合物在電場(chǎng)下沿著載體兩性電解質(zhì)混合物產(chǎn)生的ph梯度遷移，直到它們的表面凈電荷接近于零，并聚焦到局部ph等于它們的等電點(diǎn)(pi)的區(qū)帶中。ief用于蛋白質(zhì)分離并且用作二維復(fù)合蛋白質(zhì)分離的第一維。例如，ief結(jié)合十二烷基硫酸鈉(sds)凝膠電泳(分離機(jī)制基于其分子量)，稱(chēng)為二維凝膠電泳(2-de)，已被用于蛋白質(zhì)組學(xué)中的蛋白質(zhì)分離和定量。結(jié)合兩種正交分離技術(shù)的二維凝膠電泳(2-de)增加了復(fù)合生物分子的分離分辨率。然而，通常在聚丙烯酰胺板凝膠中實(shí)行2-de，這是勞動(dòng)密集、耗時(shí)且難以重現(xiàn)的。

基于全柱成像檢測(cè)(wcid)的毛細(xì)管等電聚焦(cief)有助于將等電聚焦從傳統(tǒng)的勞動(dòng)密集且耗時(shí)的板凝膠形式演變?yōu)樽詣?dòng)和高通量的自由溶液毛細(xì)管形式。根據(jù)檢測(cè)方案，存在兩種cief技術(shù)。當(dāng)在接近分離毛細(xì)管的一個(gè)末端的點(diǎn)處檢測(cè)時(shí)，其是單點(diǎn)檢測(cè)(spd)。當(dāng)在全部的分離毛細(xì)管上檢測(cè)時(shí)，其是wcid。毛細(xì)管等電聚焦(cief)在單點(diǎn)檢測(cè)(spd)中分兩步進(jìn)行。首先，在整個(gè)分離毛細(xì)管長(zhǎng)度中注入蛋白質(zhì)和載體兩性電解質(zhì)混合物。將分離毛細(xì)管的一個(gè)端部和高壓電源的陽(yáng)極浸入裝注有酸性溶液的小瓶中，并且將分離毛細(xì)管的另一個(gè)端部和陰極浸入裝注有堿溶液的小瓶中。在該第一聚焦步驟中，分離并聚焦兩性分子。然后，在聚焦完成后，使聚焦的穩(wěn)定的兩性分子轉(zhuǎn)移以通過(guò)檢測(cè)點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)?？梢酝ㄟ^(guò)向電解液小瓶施加壓力或通過(guò)改變陽(yáng)極電解液或陰極電解液來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。將陽(yáng)極電解液改變?yōu)榉羌兯嵝匀芤簩⒁鹁劢沟膮^(qū)帶朝向陽(yáng)極遷移，并且將陰極電解液改變?yōu)榉羌儔A溶液將引起聚焦的區(qū)帶朝向陰極遷移。然而，在利用spd的常規(guī)cief中，轉(zhuǎn)移步驟經(jīng)常在聚焦步驟中干擾建立的ph梯度。另外，利用慢轉(zhuǎn)移和較小的內(nèi)徑毛細(xì)管以最小化在聚焦步驟中實(shí)現(xiàn)的分辨率的損失，這降低了分析通量和光學(xué)檢測(cè)靈敏度。

與spdcief相比，wcidcief簡(jiǎn)化了方法開(kāi)發(fā)，并且提高了分析通量，而無(wú)需轉(zhuǎn)移。然而，目前wcidcief不可以通過(guò)將分離的蛋白質(zhì)洗脫直接引入諸如質(zhì)譜(ms)的分析工具提供直接異構(gòu)蛋白質(zhì)峰表征。另外，可用的膜毛細(xì)管的內(nèi)徑(id)限制了分離毛細(xì)管的選擇。這些缺點(diǎn)限制了wcidcief在蛋白質(zhì)分離和定量中的更廣泛的應(yīng)用，并且妨礙其在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用。

uv吸收檢測(cè)器通常在wcidcief中作為檢測(cè)裝置使用。uv吸收檢測(cè)器的靈敏度與檢測(cè)波長(zhǎng)處的樣品吸光度和光路長(zhǎng)度成正比。通常在280nm進(jìn)行檢測(cè)，其中蛋白質(zhì)或其他生物兩性分子具有相對(duì)弱的吸收性。由于檢測(cè)靈敏度低，常規(guī)的wcidcief需要高的樣品濃度。高蛋白質(zhì)樣品濃度不僅會(huì)導(dǎo)致更多的樣品消耗，而且會(huì)導(dǎo)致更快速的蛋白質(zhì)沉淀。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本公開(kāi)描述用于執(zhí)行化學(xué)和生物分子分離的設(shè)備和方法。在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供用于執(zhí)行全柱成像檢測(cè)(wcid)毛細(xì)管等電聚焦(cief)的設(shè)備和方法。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開(kāi)提供用于分離混合物的設(shè)備。該設(shè)備包括具有分離內(nèi)徑和分離外徑的分離毛細(xì)管；基座，其中將分離毛細(xì)管附接到基座；具有入口內(nèi)徑和入口外徑的入口傳送毛細(xì)管；以及具有出口內(nèi)徑和出口外徑的出口傳送毛細(xì)管。入口傳送毛細(xì)管、分離毛細(xì)管和出口傳送毛細(xì)管經(jīng)配置彼此流體連通。分離內(nèi)徑大于出口內(nèi)徑。

分離毛細(xì)管可以包括多孔材料。在一個(gè)實(shí)施例中，分離毛細(xì)管包括熔融二氧化硅。分離毛細(xì)管可以包括涂層。例如，分離毛細(xì)管可以包括具有涂層的熔融二氧化硅。涂層可以是疏水的或親水的。

分離內(nèi)徑可以大于入口內(nèi)徑。在一些實(shí)施例中，分離內(nèi)徑可以是入口內(nèi)徑的至少兩倍、至少三倍或至少四倍。分離內(nèi)徑可以約等于或大于入口外徑。例如，分離內(nèi)徑可以是入口外徑的至少兩倍或至少三倍。

分離內(nèi)徑可以大于出口內(nèi)徑。例如，分離內(nèi)徑是出口內(nèi)徑的至少兩倍、至少三倍、至少四倍或至少五倍。分離內(nèi)徑可以約等于或大于出口外徑。例如，分離內(nèi)徑可以是出口外徑的至少兩倍、至少三倍或至少四倍。

可以將入口傳送毛細(xì)管連接到分離毛細(xì)管的第一端部以提供入口連接。例如，可以將入口傳送毛細(xì)管插入分離毛細(xì)管的第一端部中。將出口傳送毛細(xì)管連接到分離毛細(xì)管的第二端部以提供出口連接。例如，可以將出口傳送毛細(xì)管插入分離毛細(xì)管的第二端部中?？梢杂煤＞d材料獨(dú)立地填充入口連接和出口連接。海綿材料可以是導(dǎo)電的、離子傳導(dǎo)的或兩者。海綿材料可以包括聚合物材料。海綿材料可以在原位形成?？梢杂弥T如環(huán)氧膠的粘合劑獨(dú)立地穩(wěn)定入口連接和出口連接。

設(shè)備可以進(jìn)一步包括用于容納第一電解液的第一儲(chǔ)液器和用于容納第二電解液的第二儲(chǔ)液器。第一儲(chǔ)液器可以與入口連接流體連通。第二儲(chǔ)液器可以與出口連接流體連通。

設(shè)備可以進(jìn)一步包括第一電極和第二電極。第一電極經(jīng)配置與第一電解液電連通。第二電極經(jīng)配置與第二電解液電連通。

設(shè)備可以進(jìn)一步包括電源，所述電源經(jīng)配置與第一電極和第二電極電連通，因此經(jīng)配置在分離毛細(xì)管兩端提供電壓。

可以將分離毛細(xì)管、第一儲(chǔ)液器和第二儲(chǔ)液器粘附到基座以提供盒?；梢圆扇“宓男螤??；梢杂砂ㄌ沾?、玻璃、聚合物、塑料、金屬或它們的組合的材料制成?？梢詫⒎蛛x毛細(xì)管粘合到基座上。

出口傳送毛細(xì)管可以與分析儀器、分離裝置或它們的組合流體連通。分析儀器可以包括ms、ir、uv、拉曼光譜儀或它們的組合。分離裝置可以包括蛋白質(zhì)分級(jí)裝置。

在另一方面，本公開(kāi)提供包括上述設(shè)備并且進(jìn)一步包括圖像傳感器的系統(tǒng)。成像傳感器可以包括線性電荷耦合裝置、線性互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體傳感器或兩者。成像傳感器可以經(jīng)配置與圖像分析裝置進(jìn)行電子通信。系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括與入口傳送毛細(xì)管流體連通的樣品注射裝置和/或與出口傳送毛細(xì)管流體連通的分析儀器。

可以由計(jì)算機(jī)化處理器獨(dú)立地或集中控制圖像分析裝置、樣品注射裝置和通信裝置。替代地或另外，也可以由計(jì)算機(jī)化處理器獨(dú)立地或集中控制電源、分離裝置和分析儀器。

從以下結(jié)合附圖對(duì)其優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)描述，本公開(kāi)的目的和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)。

附圖說(shuō)明

現(xiàn)在將參照附圖描述根據(jù)本公開(kāi)的實(shí)施例，其中類(lèi)似的參考標(biāo)號(hào)表示類(lèi)似的元件。

圖1示出根據(jù)本公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施例的用于高靈敏度uv吸收wcid的示例設(shè)備的示意圖。

圖2示出圖1的放大的分離毛細(xì)管連接區(qū)域。

圖3示出示例wcidcief的檢測(cè)靈敏度，其中分離毛細(xì)管分別具有100μm和200μm的內(nèi)徑。

圖4示出在具有內(nèi)徑為200μm的分離毛細(xì)管的示例wcidcief內(nèi)的聚焦的蛋白質(zhì)峰朝向用于esims的具有內(nèi)徑為50μm的出口傳送毛細(xì)管的移動(dòng)。

圖5示出具有esi-ms的wcidcief的示例設(shè)備。

具體實(shí)施方式

通過(guò)參考本公開(kāi)的某些實(shí)施例的以下詳細(xì)描述可以更容易地理解本公開(kāi)。

貫穿本申請(qǐng)，在引用出版物的情況下，這些出版物的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本申請(qǐng)中，以更全面地描述本公開(kāi)所涉及的現(xiàn)有技術(shù)。

本公開(kāi)提供具有克服與傳統(tǒng)等電聚焦技術(shù)相關(guān)聯(lián)的缺點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)的分離設(shè)備和方法。

在一方面，提供用于分離混合物的設(shè)備。混合物可以是諸如蛋白質(zhì)分子的兩性生物分子的混合物。示例蛋白質(zhì)分子可以包括但不限于抗體或酶。設(shè)備包括具有分離內(nèi)徑和分離外徑的分離毛細(xì)管；基座，其中將分離毛細(xì)管附接到基座；具有入口內(nèi)徑和入口外徑的入口傳送毛細(xì)管；以及具有出口內(nèi)徑和出口外徑的出口傳送毛細(xì)管。入口傳送毛細(xì)管、分離毛細(xì)管和出口傳送毛細(xì)管經(jīng)配置彼此流體連通。分離內(nèi)徑大于出口內(nèi)徑。

分離毛細(xì)管可以具有大于30mm、50mm、100mm或200mm的長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施例中，分離毛細(xì)管可以具有約10mm至約500mm、約50mm至約300mm或約100mm至約200mm的長(zhǎng)度。在一個(gè)示例中，分離毛細(xì)管具有約53mm的長(zhǎng)度。

分離毛細(xì)管包括多孔材料。在一個(gè)實(shí)施例中，分離毛細(xì)管包括熔融二氧化硅。分離毛細(xì)管可以具有涂層。在一個(gè)實(shí)施例中，分離毛細(xì)管包括具有涂層的熔融二氧化硅。涂層可以是疏水的或親水的。示例涂層包含但不限于碳氟化合物、聚丙烯酰胺、二甲基硅氧烷或它們的組合。涂層可以是分子層涂層、粘結(jié)涂層或接枝到毛細(xì)管內(nèi)表面的涂層。在一個(gè)實(shí)施例中，涂層基本上不含甲基纖維素添加劑。

涂層可以具有不大于0.5μm的厚度。在一些實(shí)施例中，涂層可以具有約0.01μm至約1μm的厚度或約0.05μm至約0.2μm的厚度。在一個(gè)示例中，涂層可以具有約0.1μm的厚度。

分離內(nèi)徑可以為至少約30μm或至多約1000μm。在一些實(shí)施例中，分離內(nèi)徑可以為約50μm至約400μm或約100μm至約300μm。在一個(gè)實(shí)施例中，分離內(nèi)徑可以為約100μm。在另一實(shí)施例中，分離內(nèi)徑可以為約200μm。

分離外徑可以為至少50μm或至多為2000μm。在一些實(shí)施例中，分離外徑可以為約100μm至約600μm，約200μm至約500μm或約300μm至約400μm。在一個(gè)實(shí)施例中，分離外徑為約200μm至1000μm。

分離內(nèi)徑可以大于入口內(nèi)徑。例如，分離內(nèi)徑可以是入口內(nèi)徑的至少兩倍、至少三倍、至少四倍。分離內(nèi)徑可以約等于或大于入口外徑。例如，分離內(nèi)徑可以是入口外徑的至少兩倍或至少三倍。

入口內(nèi)徑可以為至少10μm或至多500μm。在一些實(shí)施例中，入口內(nèi)徑可以為約20μm至約200μm或約50μm至約150μm。例如，入口內(nèi)徑為約100μm至800μm。入口外徑可以為至少30μm或至多500μm。在一些實(shí)施例中，入口外徑為約30μm至300μm或50μm至200μm。在一個(gè)示例中，入口外徑為約100μm至800μm。

入口傳送毛細(xì)管可以具有大于約30mm或約100mm的長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施例中，入口傳送毛細(xì)管可以具有約100mm至約300mm的長(zhǎng)度。例如，入口傳送毛細(xì)管具有約10mm至500mm的長(zhǎng)度。

分離內(nèi)徑可以大于出口內(nèi)徑。在一些實(shí)施例中，分離內(nèi)徑可以是出口內(nèi)徑的至少兩倍、至少三倍、至少四倍或至少五倍。分離內(nèi)徑可以約等于或大于出口外徑。在一些實(shí)施例中，分離內(nèi)徑是出口外徑的至少兩倍、至少三倍或至少四倍。

出口內(nèi)徑可以為至少10μm或至多500μm。在一些實(shí)施例中，出口內(nèi)徑為約30μm至約200μm、約50μm至約100μm或約30μm至250μm。在一個(gè)示例中，出口內(nèi)徑為約30μm至100μm。出口外徑可以為至少30μm或至多500μm。在一些實(shí)施例中，出口外徑為約30μm至300μm或約50μm至約200μm。在一個(gè)示例中，出口外徑為約100μm至400μm。

在一些實(shí)施例中，出口傳送毛細(xì)管具有大于30mm、50mm、100mm、200mm、300mm或400mm的長(zhǎng)度。在一些實(shí)施例中，出口傳送毛細(xì)管具有約30mm至約600mm或約100mm至約600mm的長(zhǎng)度。在一個(gè)示例中，出口傳送毛細(xì)管具有約10mm至1000mm的長(zhǎng)度。

分離毛細(xì)管的長(zhǎng)度可以等于、長(zhǎng)于、短于出口傳送毛細(xì)管的長(zhǎng)度。在一些實(shí)施例中，出口傳送毛細(xì)管的長(zhǎng)度約等于、至少兩倍于、至少三倍于或至少四倍于分離毛細(xì)管的長(zhǎng)度。

可以將入口傳送毛細(xì)管連接到分離毛細(xì)管的一個(gè)端部以提供入口連接。在一個(gè)示例中，可以將入口傳送毛細(xì)管插入分離毛細(xì)管中以提供零死體積入口連接?？梢詫⒊隹趥魉兔?xì)管連接到分離毛細(xì)管的另一端部以提供出口連接。例如，可以將出口傳送毛細(xì)管插入分離毛細(xì)管中以提供零死體積出口連接。

可以用海綿材料獨(dú)立地填充入口連接和出口連接。海綿材料可以包括聚合物材料，包括但不限于纖維素、乙酸纖維素、多孔玻璃料、銅銨rc或它們的組合。例如通過(guò)使堿性溶液與乙酸纖維素凝膠接觸以提供再生纖維素海綿，可以在原位形成海綿材料。

可以用粘合劑獨(dú)立地穩(wěn)定入口連接和出口連接。在一個(gè)示例中，粘合劑可以是環(huán)氧膠。

設(shè)備可以進(jìn)一步包括用于容納第一電解液的第一儲(chǔ)液器。第一儲(chǔ)液器可以與入口連接流體連通。設(shè)備還可以包括經(jīng)配置與第一電解液電連通的第一電極。設(shè)備可以進(jìn)一步包括用于容納第二電解液的第二儲(chǔ)液器。第二儲(chǔ)液器可以與出口連接流體連通。設(shè)備還可以包括經(jīng)配置與第二電解液電連通的第二電極。第一電解液和第二電解液可以獨(dú)立地是酸性或堿性溶液。示例酸性溶液包括但不限于乙酸溶液。示例堿性溶液包括但不限于銨溶液。

在一個(gè)實(shí)施例中，可以在入口連接和出口連接上構(gòu)造儲(chǔ)液器。例如，第一儲(chǔ)液器可以是裝注有酸性溶液的陰離子儲(chǔ)液器，并且例如，第二儲(chǔ)液器可以是裝注有堿性溶液的陰極儲(chǔ)液器。入口連接和出口連接處的海綿材料可以是離子傳導(dǎo)的、導(dǎo)電的或兩者，因此允許分離毛細(xì)管和電解液之間的電連接，同時(shí)限制分離毛細(xì)管和電解液儲(chǔ)液器之間的總體流動(dòng)。在入口連接和出口連接都浸入它們相應(yīng)的電解液儲(chǔ)液器中的情況下，當(dāng)電壓施加到第一電解液儲(chǔ)液器內(nèi)部的第一電極和第二電解液儲(chǔ)液器內(nèi)部的第二電極時(shí)，可以在分離毛細(xì)管內(nèi)部實(shí)現(xiàn)聚焦蛋白質(zhì)?？梢杂弥T如線性電荷耦合裝置(ccd)或線性互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(cmos)傳感器的成像傳感器監(jiān)測(cè)分離毛細(xì)管。

基座可以由諸如陶瓷、玻璃、聚合物、塑料、金屬或它們的組合的材料制成。可以將分離毛細(xì)管粘合到基座上。在一個(gè)示例中，基座可以包括光學(xué)孔，并且分離毛細(xì)管可以與光學(xué)孔對(duì)準(zhǔn)以允許觀測(cè)分離毛細(xì)管。也可以將第一儲(chǔ)液器或第二儲(chǔ)液器粘附到基座以提供盒。

出口傳送毛細(xì)管可以與分析儀器、分離裝置或它們的組合流體連通。示例分離裝置可以包括蛋白質(zhì)分級(jí)裝置或在線酶消化裝置。示例分析儀器可以包括但不限于ms(例如，包括esims或maldims)、ir、uv、拉曼光譜儀或它們的組合。所公開(kāi)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)中的一個(gè)是可以將設(shè)備耦合到質(zhì)譜(ms)。

在另一方面，本公開(kāi)提供用于分離混合物的系統(tǒng)。系統(tǒng)包括如上所述的設(shè)備和成像傳感器。成像傳感器經(jīng)配置監(jiān)測(cè)分離毛細(xì)管。成像傳感器可以包括但不限于線性電荷耦合裝置或線性互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體傳感器。成像傳感器可以經(jīng)配置與圖像分析裝置進(jìn)行電子通信。

系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括與入口傳送毛細(xì)管流體連通的樣品注射裝置、與出口傳送毛細(xì)管流體連通的分析儀器或兩者。可以由計(jì)算機(jī)集中控制系統(tǒng)。例如，圖像分析裝置、樣品注射裝置和通信裝置可以經(jīng)配置與中央處理器進(jìn)行電子通信。

在另一方面，本公開(kāi)提供使用該設(shè)備和系統(tǒng)的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，方法包括以下步驟：將第一電解液置于第一儲(chǔ)液器中，將第二電解液置于第二儲(chǔ)液器中，將混合物加載到分離毛細(xì)管中，以及在第一電極和第二電極上施加電壓?；旌衔锟梢允切枰蛛x的任何混合物，包括蛋白質(zhì)混合物或其他兩性生物分子混合物。方法可以進(jìn)一步包括用圖像傳感器監(jiān)測(cè)分離毛細(xì)管、分析來(lái)自圖像傳感器的數(shù)據(jù)、將分離的樣品移動(dòng)到諸如ms的分析儀器中進(jìn)行分析或表征、使用分級(jí)裝置收集分離的樣品，或者包括這些步驟的任何組合。

在另一方面，本公開(kāi)提供用于制造該設(shè)備和系統(tǒng)的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，方法包括將分離毛細(xì)管粘附在基座上、將入口傳送毛細(xì)管連接到分離毛細(xì)管的一個(gè)端部以提供入口連接，以及將出口傳送毛細(xì)管連接到分離毛細(xì)管的另一端部以提供出口連接。入口傳送毛細(xì)管、分離毛細(xì)管和出口傳送毛細(xì)管經(jīng)配置彼此流體連通。方法可以進(jìn)一步包括在入口連接處、出口連接處或兩者處原位形成海綿膜、用粘合劑密封出口連接、用粘合劑密封入口連接、在入口連接上構(gòu)造第一儲(chǔ)液器或在出口連接上構(gòu)造第二儲(chǔ)液器。可以以任何組合和以任何組合的順序執(zhí)行步驟。

在一個(gè)示例中，設(shè)備是盒的形式，以有助于電連接、光學(xué)對(duì)準(zhǔn)、溫度控制、毛細(xì)管處理和光學(xué)成像檢測(cè)。圖1示出設(shè)備101的一個(gè)實(shí)施例。將具有長(zhǎng)度為55mm、內(nèi)徑為200μm和外徑為350μm的熔融二氧化硅的分離毛細(xì)管105粘合到基座110，基座110包括一塊陶瓷的、玻璃或塑料板。分離毛細(xì)管105與基座110的光學(xué)孔對(duì)準(zhǔn)并且粘合到基座110。至少部分地由于陶瓷板的物理強(qiáng)度、良好的導(dǎo)熱性和更大的表面積，使用陶瓷板的優(yōu)點(diǎn)中的一個(gè)在于為分離毛細(xì)管105提供支撐和熱沉。將約150mm長(zhǎng)的具有約100μm內(nèi)徑和約180μm外徑的兩個(gè)毛細(xì)管插入到分離毛細(xì)管105的每個(gè)端部中約0.5mm深，分別作為入口傳送毛細(xì)管115和出口傳送毛細(xì)管120。將適量的丙酮中的乙酸纖維素溶液滴入連接中，使得凝膠填充并覆蓋分離毛細(xì)管105的較大內(nèi)徑和入口傳送毛細(xì)管115的較小外徑之間的空間，以及分離毛細(xì)管105的較大內(nèi)徑和出口傳送毛細(xì)管120的較小外徑之間的空間。短暫干燥后，將1m氫氧化鈉溶液滴在凝膠上，將乙酸纖維素轉(zhuǎn)化為再生纖維素(rc)海綿125。將環(huán)氧膠130施加到連接外部的rc海綿125以防止其移動(dòng)。在圖2中詳細(xì)示出該連接。

將圓形玻璃或塑料槽135粘合到基座110以覆蓋兩個(gè)連接并且作為用于電解液的儲(chǔ)液器。當(dāng)將電解液140裝注到槽中時(shí)，它們通過(guò)rc海綿125與樣品混合物隔離。橫跨浸入在槽135中的兩個(gè)電極145連接電壓供應(yīng)。rc海綿125的現(xiàn)場(chǎng)形成的優(yōu)點(diǎn)包括但不限于在連接處的毛細(xì)管之間的基本上零死體積、分離毛細(xì)管和傳送毛細(xì)管尺寸的多選擇、獨(dú)立于膜毛細(xì)管(其在常規(guī)wcidcief中使用)的商業(yè)可用性以及現(xiàn)場(chǎng)海綿125的期望阻擋特性的選擇。雖然rc海綿125由乙酸纖維素制成，但是用于形成膜的其他技術(shù)，例如現(xiàn)場(chǎng)多孔玻璃料形成、銅銨rc和利用聚合物材料的其他膜形成可以用于相同的目的。

圖3示出由于代表性設(shè)備中較大內(nèi)徑分離毛細(xì)管產(chǎn)生的檢測(cè)靈敏度改善。用聚丙烯酰胺涂覆分離毛細(xì)管以最小化毛細(xì)管壁上的蛋白質(zhì)吸附和電滲流。將蛋白質(zhì)與4％aeslyte^tm(例如，載體兩性電解質(zhì))ph3-10的載體兩性電解質(zhì)混合至200μl含水溶液以提供蛋白質(zhì)樣品混合物。離心后，將蛋白質(zhì)樣品混合物注射到盒的毛細(xì)管中，所述盒固定在全柱檢測(cè)cief儀器ceinfinite^tm中。當(dāng)在毛細(xì)管兩端施加可編程電壓時(shí)，兩性分子遷移直到它們的表面電荷在局部ph等于它們的等電點(diǎn)的地方失去。通過(guò)分離毛細(xì)管掃描的光線和來(lái)自分離毛細(xì)管的光強(qiáng)度變化通過(guò)高分辨率成像透鏡被收集到線性cmos成像傳感器。用ceinsight控制軟件處理收集的數(shù)據(jù)，并以沿著分離毛細(xì)管的長(zhǎng)度的吸光度顯示。

本文公開(kāi)的設(shè)備有若干優(yōu)點(diǎn)。具有不同直徑的毛細(xì)管可以用作分離毛細(xì)管。例如，當(dāng)使用200μm內(nèi)徑分離毛細(xì)管時(shí)，與100μm內(nèi)徑分離毛細(xì)管相比，其提供100％靈敏度改善，并且與50μm內(nèi)徑分離毛細(xì)管相比，其提供300％靈敏度改善。在公開(kāi)的wcidcief盒中，傳送毛細(xì)管，即入口傳送毛細(xì)管和出口傳送毛細(xì)管比分離毛細(xì)管長(zhǎng)得多。因此，樣品混合物的大部分在入口毛細(xì)管和出口毛細(xì)管中。當(dāng)使用50μm內(nèi)徑毛細(xì)管作為傳送毛細(xì)管時(shí)，200μm內(nèi)徑分離毛細(xì)管的注射樣品值與50μm或100μm內(nèi)徑分離毛細(xì)管的注射樣品值約相同。另外，由于檢測(cè)靈敏度改善，較大的分離毛細(xì)管中的蛋白質(zhì)濃度可以較低，除其他之外，這導(dǎo)致諸如降低蛋白質(zhì)沉淀的風(fēng)險(xiǎn)以及改善分離的優(yōu)點(diǎn)。

盒形式的設(shè)備可以有助于電連接、光學(xué)對(duì)準(zhǔn)、溫度控制、毛細(xì)管處理和ms連接。盒的構(gòu)造基本上類(lèi)似于圖1所示的示例設(shè)備。使用約55mm長(zhǎng)的內(nèi)徑為200μm且外徑為350μm的毛細(xì)管作為分離毛細(xì)管。使用約150mm長(zhǎng)的內(nèi)徑為50μm且外徑為180μm的毛細(xì)管作為入口傳送毛細(xì)管。使用約750mm長(zhǎng)的內(nèi)徑為50μm且外徑為180μm的毛細(xì)管作為出口傳送毛細(xì)管。將蛋白質(zhì)與0.5％、ph6-9的aeslyte^tm載體兩性電解質(zhì)含水溶液混合以提供蛋白質(zhì)樣品混合物，將該蛋白質(zhì)樣品混合物注射到分離毛細(xì)管中。將2％乙酸作為陽(yáng)極電解液裝注到陽(yáng)極儲(chǔ)液器中，并且將2％乙二胺作為陰極電解液裝注到陰極儲(chǔ)液器中。電壓電源連接各自浸入儲(chǔ)液器中的兩個(gè)電極。在蛋白質(zhì)樣品注射后將入口傳送毛細(xì)管連接到harvardapparatus注射器泵中的裝注有2％乙酸的50μl注射器。將毛細(xì)管的出口端部連接到ms的esi源。在施加電壓時(shí)，兩性分子遷移，直到它們的表面電荷在局部ph等于它們的等電點(diǎn)的地方失去。cmos成像相機(jī)以諸如1秒至60秒的時(shí)間間隔監(jiān)測(cè)分離毛細(xì)管。一旦觀測(cè)到期望的蛋白質(zhì)分辨率，以0.05μl/min的流速開(kāi)啟注射器泵。同時(shí)，調(diào)節(jié)電壓使得蛋白質(zhì)區(qū)帶依次朝向出口傳送毛細(xì)管移動(dòng)，保持分離分辨率。圖3示出依次從分離毛細(xì)管中移出的兩個(gè)蛋白質(zhì)峰。使用該盒，分離毛細(xì)管的內(nèi)徑是出口傳送毛細(xì)管內(nèi)徑的約4倍。當(dāng)推動(dòng)1mm的蛋白質(zhì)區(qū)帶從分離毛細(xì)管進(jìn)入出口傳送毛細(xì)管中時(shí)，其長(zhǎng)度將占據(jù)約16mm。將小區(qū)域的聚焦的蛋白質(zhì)傳送到長(zhǎng)得多的區(qū)域中的過(guò)程有效地最小化了傳送毛細(xì)管內(nèi)分離的蛋白質(zhì)的潛在再混合。分離毛細(xì)管和cief的電壓電源形成閉路。傳送毛細(xì)管與高壓源有效隔離，防止施加到cief過(guò)程的電壓對(duì)施加到esi源的電壓的干擾。這種電氣隔離有助于cief過(guò)程與esi過(guò)程的耦合。

壓力轉(zhuǎn)移可以與化學(xué)轉(zhuǎn)移組合，以將聚焦的蛋白質(zhì)區(qū)帶推動(dòng)到傳送毛細(xì)管中。蛋白質(zhì)聚焦后，可以將陰極電解液改變?yōu)榉羌儔A溶液，這將引起聚焦的蛋白質(zhì)區(qū)帶根據(jù)電場(chǎng)朝向陰極遷移。將壓力轉(zhuǎn)移和化學(xué)轉(zhuǎn)移組合也可以將分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶傳送到傳送毛細(xì)管中和傳送到ms的esi源。

圖5示出類(lèi)似于圖1的示例設(shè)備的示例設(shè)備500，示例設(shè)備500進(jìn)一步包括分離盒的陰極側(cè)的第三儲(chǔ)液器510。傳送毛細(xì)管120可以通過(guò)一個(gè)膜毛細(xì)管520連接到具有相同外徑(od)的另一個(gè)傳送毛細(xì)管120。膜毛細(xì)管520的內(nèi)徑不大于傳送毛細(xì)管120的內(nèi)徑，并且用于連接到esi源530。向儲(chǔ)液器510裝注乙酸溶液，并且乙酸溶液將通過(guò)多孔膜毛細(xì)管520泄漏到出口傳送毛細(xì)管120中。蛋白質(zhì)與乙酸溶液的混合將esi源中促進(jìn)蛋白質(zhì)電離。

圖5所示的示例設(shè)備可以用于蛋白質(zhì)分級(jí)和點(diǎn)樣到maldi靶板。一旦聚焦和分離蛋白質(zhì)，可以以0.05-0.1μl/min的流速打開(kāi)具有裝注有陽(yáng)極電解液的50μl注射器的注射器泵。200μm內(nèi)徑分離毛細(xì)管內(nèi)聚焦的蛋白質(zhì)區(qū)帶將被連續(xù)推出50μm內(nèi)徑出口傳送毛細(xì)管。在注射器轉(zhuǎn)移期間，可以調(diào)節(jié)電場(chǎng)以保持分離分辨率。分離毛細(xì)管的內(nèi)徑與傳送毛細(xì)管的內(nèi)徑之間的差異使分離的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的再混合最小化。因此，將基本上保持在cief期間實(shí)現(xiàn)的分辨率。較長(zhǎng)和較小的傳送毛細(xì)管與分離毛細(xì)管和傳送毛細(xì)管之間的電隔離組合有助于將所公開(kāi)的wcidcief可靠地應(yīng)用于諸如但不限于蛋白質(zhì)分級(jí)和將分離的蛋白質(zhì)洗脫點(diǎn)樣到maldi靶板的領(lǐng)域。

本公開(kāi)在蛋白質(zhì)和其他兩性生物分子的毛細(xì)管等電聚焦分離技術(shù)領(lǐng)域。它可以在一般的生命科學(xué)領(lǐng)域中使用，例如包括細(xì)胞系選擇、穩(wěn)定性研究、配方研究、蛋白質(zhì)異構(gòu)體表征、批量釋放質(zhì)量控制和蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

所公開(kāi)的技術(shù)有若干優(yōu)點(diǎn)，包括但不限于：具有不同直徑的分離毛細(xì)管的更多選擇；較大的內(nèi)徑分離毛細(xì)管的檢測(cè)靈敏度較高；毛細(xì)管盒的構(gòu)造不受膜毛細(xì)管的商業(yè)可用性的限制；使樣品攜帶最小化的分離毛細(xì)管和傳送毛細(xì)管的零死體積連接；設(shè)備首次允許將wcid直接耦合到esims、偶合到maldims，以及高分辨率蛋白質(zhì)分級(jí)。

雖然已經(jīng)參考具體實(shí)施例描述了本公開(kāi)，但是應(yīng)當(dāng)理解，實(shí)施例是說(shuō)明性的，并且公開(kāi)范圍不限于此。本公開(kāi)的替代實(shí)施例對(duì)于本公開(kāi)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將變得顯而易見(jiàn)。這樣的替代實(shí)施例被認(rèn)為包含在本公開(kāi)的保護(hù)范圍內(nèi)。因此，本公開(kāi)的保護(hù)范圍由所附權(quán)利要求限定，并且由前述描述支持。

實(shí)施例僅用于說(shuō)明本公開(kāi)，并不旨在限制本公開(kāi)的保護(hù)范圍。對(duì)于技術(shù)領(lǐng)域的人員來(lái)說(shuō)應(yīng)該理解，在不脫離本公開(kāi)的原理的情況下，可以進(jìn)行且應(yīng)該在本公開(kāi)的保護(hù)下考慮某些修改和改進(jìn)。