本發(fā)明屬于半導(dǎo)體加工技術(shù)領(lǐng)域，具體地講，涉及一種微流控芯片及其制作方法。

背景技術(shù)：

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctcs)作為癌癥轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志，在癌癥早期由病灶處產(chǎn)生，經(jīng)外周血液向其他器官擴散的腫瘤細(xì)胞。靈敏地從外周血液細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)ctcs的存在對于早期腫瘤的診斷、預(yù)防有重要意義。高純度、高效率的捕獲并有效分析ctcs有望進(jìn)一步了解腫瘤的形成機理進(jìn)而從根源上阻止病變的發(fā)生。然而，由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的稀有性(1/10⁷)，大量雜質(zhì)細(xì)胞必將成為其高效、高純分離和捕獲過程中的障礙，如何從雜質(zhì)細(xì)胞中得到目標(biāo)細(xì)胞(即循環(huán)腫瘤細(xì)胞)成為現(xiàn)代醫(yī)療診斷的關(guān)鍵。

目前已有許多用于分離和捕獲的方法能夠?qū)tcs從血細(xì)胞中分離出來。其中一種是利用免疫磁珠法在磁場的作用下實現(xiàn)細(xì)胞分離和捕獲；另一種是微流控技術(shù)，不同于免疫磁珠法，微流控技術(shù)得益于微加工技術(shù)的發(fā)展，其能夠?qū)⒎蛛x捕獲的過程微型化，實現(xiàn)對細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)移、分離與捕獲等過程一步化，進(jìn)而實現(xiàn)對單個細(xì)胞的操控。

由于具有高靈敏、高效率、低成本等特點，微流控技術(shù)逐漸應(yīng)用于ctcs的分離與捕獲中來。常用的微流控技術(shù)依賴于目標(biāo)細(xì)胞區(qū)別于其他細(xì)胞的一種或多種特征(生物或物理特征)進(jìn)行分離和捕獲。

ctcs區(qū)別于其他血液細(xì)胞的物理特征包括細(xì)胞的大小及變形能力等。利用ctcs體積較大、變形能力弱的特點制成的微型篩、微流道等結(jié)構(gòu)在一定程度上滿足了高效分離的要求。ctcs的生物特性包括蛋白質(zhì)表達(dá)、突變性質(zhì)、生存能力等，其中利用細(xì)胞表面蛋白與其特異性抗體的結(jié)合的免疫吸附法實現(xiàn)細(xì)胞高效分離的技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。該方法充分利用了微流控芯片中流道比表面積較大的特點，使與細(xì)胞表面蛋白連接的抗體的數(shù)量增多，靶向細(xì)胞能夠與流道表面形成可靠的特異性的連接從而留在細(xì)胞表面，而不能與表面形成有力的連接的非靶向細(xì)胞則隨流體流出，分離成功。

免疫吸附：高度特異性的抗原、抗體或有特定物理化學(xué)親和力的物質(zhì)(配體)與吸附材料(載體)之間的吸附。免疫磁珠法基于細(xì)胞表面抗原與連接在磁珠上的特異性的抗體連接，在外磁場的作用下，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場中，而無抗原的細(xì)胞被分離。

此外，許多研究者將多種方法集合在同一芯片上。例如：結(jié)合磁珠法，其利用包覆抗體的微磁珠與細(xì)胞特異性結(jié)合，其中，當(dāng)細(xì)胞通過分離區(qū)時，在磁場作用下使連接有磁珠的靶向細(xì)胞與未連接磁珠的非靶向細(xì)胞分離，這種方法可在連續(xù)流體中實現(xiàn)高效分離且靈敏度較高；利用流體力學(xué)與免疫法相結(jié)合，其中，流體運動增加了細(xì)胞與流道親和性分子的接觸機會，同時流體的剪切力使非靶向細(xì)胞從表面脫離，從而提高了捕獲效率和捕獲純度。

然而，上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點包括：

一、在免疫磁珠法中，分離和捕獲過程復(fù)雜，分離成本高；并且批量處理使用的樣品量較大，分離效率較低。此外，免疫磁珠法需要對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中不可避免的造成了細(xì)胞損失，對于稀有細(xì)胞來說可能影響到檢測結(jié)果。再者，在免疫磁珠法中，雖使用熒光染料對不同細(xì)胞進(jìn)行區(qū)別，但由于細(xì)胞污染嚴(yán)重，對細(xì)胞識別、技術(shù)及細(xì)胞分析不利。

二、現(xiàn)有的僅通過物理方法進(jìn)行分離的微流控技術(shù)由于細(xì)胞在大小、變形等物理特征上沒有明顯差別，甚至部分特征區(qū)域重合，分離的純度往往較低，仍需要對細(xì)胞進(jìn)一步捕獲以得到特定細(xì)胞，而且只能針對一種或特定幾種細(xì)胞有效，對其他分離對象需要重新設(shè)計，增加了設(shè)計及制造成本。而篩狀結(jié)構(gòu)對細(xì)胞活性損害較大，且常常會造成應(yīng)為堵塞而造成結(jié)構(gòu)失效。

三、現(xiàn)有的將流體力學(xué)與免疫吸附相結(jié)合的微流控芯片，流體的剪切力破壞了非靶向細(xì)胞與流道表面的接觸、增加純度的同時，大大縮短吸附反應(yīng)的時間，使得吸附的效率下降。

綜上，在實際應(yīng)用中，根據(jù)實驗?zāi)康男枰獧?quán)衡純度與效率的重要性，很難找到能夠同時滿足高效率和高純度的流體剪切力，即在滿足捕獲高效率的同時有低純度的特點。

因此，現(xiàn)有技術(shù)有待改進(jìn)和發(fā)展。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種微流控芯片，其包括：基板；在所述基板上的插齒電極；在所述基板上且覆蓋所述插齒電極的絕緣層；在所述絕緣層中且與所述插齒電極電接觸的電極片；在所述絕緣層上的圖案化粘結(jié)件，其中，所述粘結(jié)件上圖案形成流道結(jié)構(gòu)；在所述圖案化粘結(jié)件上用蓋板封閉以完成流道構(gòu)型，其中，所述蓋板中具有進(jìn)孔和出孔，所述進(jìn)孔和所述出孔均與所述流道結(jié)構(gòu)連通。

進(jìn)一步地，所述開口的數(shù)量為兩個，所述出孔的數(shù)量為一個，其中，兩個所述開口設(shè)置于所述蓋板的一端，所述出孔設(shè)置于所述蓋板的另一端。

進(jìn)一步地，所述插齒電極由氧化銦錫制成。

進(jìn)一步地，所述電極片由金屬制成以接通電源并保護電極。

進(jìn)一步地，所述蓋板由聚二甲基硅氧烷制成。

本發(fā)明的另一目的還在于提供一種微流控芯片的制作方法，其包括：提供一基片；在所述基板上形成插齒電極；在所述基板上形成覆蓋所述插齒電極的絕緣層；在所述絕緣層中形成與所述插齒電極電接觸的電極片；在所述絕緣層上形成圖案化的粘結(jié)件形成流道結(jié)構(gòu)；在所述圖案化的粘結(jié)件上形成封閉所述流道結(jié)構(gòu)的蓋板；其中，所述蓋板中具有與所述流道結(jié)構(gòu)連通的進(jìn)孔和出孔。

進(jìn)一步地，利用打孔工藝在所述蓋板的一端形成兩個所述開口，且在所述蓋板的另一端形成一個所述出孔。

進(jìn)一步地，在所述基板上形成插齒電極的具體方法包括：在所述基板上形成氧化銦錫層；對所述氧化銦錫層進(jìn)行光刻、刻蝕工藝，以形成所述插齒電極。

進(jìn)一步地，在所述絕緣層中形成與所述插齒電極電接觸的電極片的具體方法包括：在所述絕緣層中形成通孔；其中，所述通孔將所述插齒電極的電極端口暴露；在所述通孔中填充金屬，以形成與所述電極端口電接觸的電極片。

本發(fā)明的有益效果包括：

一、將生物分子間親和性吸附捕獲細(xì)胞與介電泳原理相結(jié)合，模擬細(xì)胞在生理溶液中的液體環(huán)境，利用負(fù)向介電泳力克服細(xì)胞親和性捕獲過程中非特異性吸附力對吸附結(jié)果的干擾，在保存了對靶向細(xì)胞親和性吸附的高效性同時，也減少了非靶向細(xì)胞的吸附，提高分離吸附細(xì)胞高純度的特點；

二、細(xì)胞吸附過程簡單，操作容易，對設(shè)備要求不高，捕獲的成本較低，且不需對細(xì)胞樣品進(jìn)行復(fù)雜預(yù)處理，避免細(xì)胞損失；

三、采用圖案化的粘結(jié)件形成流道，制作方便、成本低廉；直流道設(shè)計，為提高通量，可大量集成，大大減小分離吸附速度；

四、產(chǎn)生介電泳力的微型電極的制作過程簡單，可根據(jù)不同的流道結(jié)構(gòu)設(shè)計電極結(jié)構(gòu)，改變電場的分布；介電泳力的作用距離有限，不會對干擾其他捕獲方法的實施，易于與其他捕獲方法結(jié)合，達(dá)到更好的捕獲效果；

五、分離的過程所用的交流電電壓較小，且流體一直處于流動狀態(tài)，避免了流體中的電效應(yīng)對細(xì)胞活性的損害，對細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白檢測等后續(xù)檢測有利。

附圖說明

通過結(jié)合附圖進(jìn)行的以下描述，本發(fā)明的實施例的上述和其它方面、特點和優(yōu)點將變得更加清楚，附圖中：

圖1是根據(jù)本發(fā)明的實施例的微流控芯片的立體圖；

圖2a至圖2f是根據(jù)本發(fā)明的實施例的微流控芯片的制作流程圖；

圖3是根據(jù)本發(fā)明的實施例的產(chǎn)生介電泳力的原理圖；

圖4是根據(jù)本發(fā)明的實施例的交流電頻率與細(xì)胞所受介電泳特性曲線圖；

圖5是根據(jù)本發(fā)明的實施例的細(xì)胞在受介電泳力作用情況下軌跡示意圖；

圖6是根據(jù)本發(fā)明的實施例的齒電極的電場強度的分布模擬圖；

圖7是根據(jù)本發(fā)明的實施例的利用微流控芯片進(jìn)行實驗的示意圖。

具體實施方式

以下，將參照附圖來詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例。然而，可以以許多不同的形式來實施本發(fā)明，并且本發(fā)明不應(yīng)該被解釋為限制于這里闡述的具體實施例。相反，提供這些實施例是為了解釋本發(fā)明的原理及其實際應(yīng)用，從而使本領(lǐng)域的其他技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的各種實施例和適合于特定預(yù)期應(yīng)用的各種修改。

首先，對以下的描述中即將用到的名詞進(jìn)行必要的解釋：

介電泳(dielectrophoresis，dep)：中性微粒在非均勻電場作用下發(fā)生極化 而產(chǎn)生移動的現(xiàn)象。介電泳力的大小與物體的大小、電學(xué)性質(zhì)、周圍介質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)及外加電場的場強梯度、頻率有關(guān)。當(dāng)溶液較微粒更易極化時，微粒將向著電場較弱的區(qū)域移動，這種現(xiàn)象叫做負(fù)向介電泳(negativedielectrophoresis，n-dep)。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctcs)：存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱。

上皮細(xì)胞吸附分子(epcam)：大多數(shù)ctcs細(xì)胞膜表達(dá)的一種跨膜蛋白，在人上皮腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，常見的ctcs捕獲配體。

在本發(fā)明中，將介電泳原理加入到利用生物分子親和性捕獲的微流控芯片中，利用介電泳力克服吸附過程中的非特異性吸附力，從而提高捕獲的純度，具體請閱讀以下的實施例。

圖1是根據(jù)本發(fā)明的實施例的微流控芯片的立體圖。圖2a至圖2f是根據(jù)本發(fā)明的實施例的微流控芯片的制作流程圖。在圖1中，為了便于圖示，未示出絕緣層和電極片。

參照圖1和圖2a，提供一基板10。在本實施例中，基板10可例如是玻璃基板，但本發(fā)明并不限制于此。

參照圖1和圖2b，在基板10上形成插齒電極20。這里，在基板10上形成插齒電極20的具體方法包括：首先，在基板10上形成一層氧化銦錫膜層；其次，對該氧化銦錫膜層進(jìn)行光刻、刻蝕工藝，以形成插齒電極20。

在本實施例中，插齒電極20包括間隔排列的多個齒電極21以及連接多個齒電極21且延伸形成電極端口22，但本發(fā)明并不限制于此。

參照圖1和圖2c，在基板10上形成覆蓋插齒電極20的絕緣層30。在本實施例中，絕緣層30有二氧化硅材料制成，但本發(fā)明并不限制于此。

參照圖1和圖2d，在絕緣層30中形成與插齒電極20電接觸的電極片40。這里，在絕緣層30中形成與插齒電極20電接觸的電極片40的具體方法包括：首先，利用光刻、刻蝕工藝在絕緣層30中形成通孔31；其中，該通孔31將插齒電極20的電極端口22暴露；其次，在通孔31中填充金屬，以形成與電極端口22電接觸的電極片40。

在本實施例中，利用金和鉻填充通孔31，以形成電極片40；但本發(fā)明并不限制于此，例如也可以采用鋁等金屬填充通孔31。

參照圖1和圖2e，在絕緣層30上形成圖案化的粘結(jié)件50；其中，該粘結(jié)件50具有中空結(jié)構(gòu)51。在本實施例中，粘結(jié)件50為膠帶，其厚度約為100μm，但本發(fā)明并不限制于此。

參照圖1和圖2f，在粘結(jié)件50上形成封閉中空結(jié)構(gòu)51的蓋板60，以形成圖案化流道結(jié)構(gòu)；其中，蓋板60中具有與中空結(jié)構(gòu)51連通的進(jìn)孔和出孔。在本實施例中，蓋板60由聚二甲基硅氧烷(pdms)固化成型而成。

在本實施例中，優(yōu)選地，利用打孔工藝在蓋板60的一端形成第一進(jìn)孔61和第二進(jìn)孔62，并且利用打孔工藝在蓋板60的另一端形成一個出孔63。需要說明的是，在本發(fā)明中，蓋板60中進(jìn)孔和出孔的數(shù)量并不以圖示所示為限，其可以根據(jù)實際需求設(shè)置。

根據(jù)本發(fā)明的實施例的微流控芯片利用生物親和性分子之間的特異性連接來捕獲細(xì)胞，其針對ctcs親和性捕獲應(yīng)用，選擇大多數(shù)ctcs表面表達(dá)的上皮細(xì)胞吸附分子的抗體(anti-epcamantibody)來處理基板10，即通過上皮細(xì)胞吸附分子(epcam)與其抗體之間的親和性連接提供細(xì)胞捕獲的特異性力。然而，在微流控芯片中，細(xì)胞與吸附表面不可避免的存在對細(xì)胞沒有選擇性的非特異吸附力，這種非特異吸附力造成了部分非靶向細(xì)胞的吸附，從而降低了吸附的純度。

為了消除非靶向細(xì)胞的吸附，在基板10上利用微加工方法形成微型插齒電極20，當(dāng)在插齒電極20上施加一定大小的交流電時，由封閉的中空結(jié)構(gòu)51形成的流道內(nèi)形成非均勻電場，細(xì)胞在非均勻電場的作用下發(fā)生極化，產(chǎn)生介電泳力fdep，其原理圖如圖3所示。根據(jù)fdep的計算公式：其中，εm、r分別為溶液介電常數(shù)、細(xì)胞半徑，為clausius-mossottifactor(cm因子，方向因子，與細(xì)胞及溶液極化特性、交流電頻率有關(guān))，如圖4所示反應(yīng)了細(xì)胞在不同介質(zhì)溶液中方向因子與施加交流電頻率的關(guān)系，其中，橫坐標(biāo)為交流電頻率f(單位為hz)，縱坐標(biāo)為介電泳力方向因子，σ溶液表示溶液的介電常數(shù)，σ細(xì)胞表示細(xì)胞的介電常數(shù)。cm因子大于0，fdep為正向，細(xì)胞將由低電場區(qū)域向高電場區(qū)域移動，即正向介電泳(positivedielectrophoresis，p-dep)；而當(dāng)cm因子小于0，fdep為負(fù)向，細(xì)胞由高電場區(qū)域向低電場區(qū)域移動，即n-dep；cm因子為0時，電信號頻率為臨界頻率，細(xì)胞不受介電泳力。

在大多數(shù)具有高導(dǎo)電率的生理溶液(血液、唾液、尿液等)及細(xì)胞培養(yǎng)液 中，細(xì)胞受到負(fù)向介電泳作用(negative-dep，n-dep)，即在高電導(dǎo)率溶液中細(xì)胞受到介電泳力的作用由高電場的區(qū)域向低電場區(qū)域移動。利用這一特性，根據(jù)本發(fā)明的實施例通過在基板10表面設(shè)置插齒電極20將高電場區(qū)域布置在流道表面，而將低電場區(qū)域布置的遠(yuǎn)離流道表面，細(xì)胞將受到背離流道表面的介電泳力以克服流道表面存在的非特異性的吸附力，不同細(xì)胞的受力及運動軌跡如圖5所示，其中，受到較強的特異性的親和性吸附力的靶向ctcs將留在流道內(nèi)，而沒有穩(wěn)定的、足夠大的吸附力的非靶向細(xì)胞將隨流體流出流道。最終，ctcs的捕獲純度提高。

根據(jù)介電泳原理可知，需要對微流控芯片調(diào)節(jié)的參數(shù)主要包括：所加電壓的大小及頻率、電極寬度及電極間距。這些參數(shù)將影響電場的空間分布。根據(jù)所分離的細(xì)胞的大小、靶向細(xì)胞與流道表面親和性連接強弱等調(diào)節(jié)各參數(shù)。在本實施例中，電場分布的模擬主要由ansoftmaxwell軟件完成，如圖6所示，齒電極21寬度10um、齒電極21之間的間距40um、交流電電壓大小5v時流道中的電場分布。在圖6中，縱坐標(biāo)表示電場強度(v/m)，其中，區(qū)域1的電場強度范圍為2.0792e+002～1.4331e+004，區(qū)域2的電場強度范圍為1.4331e+004～2.8453e+004，區(qū)域3的電場強度范圍為2.8453e+004～4.2576e+004，區(qū)域4的電場強度范圍為4.2576e+004～5.6698e+004，區(qū)域5的電場強度范圍為5.6698e+004～8.4944e+004，區(qū)域6的電場強度范圍為8.4944e+004～1.5558e+005。區(qū)域7的電場強度范圍為1.5558e+005～1.6968e+005。細(xì)胞在接近電極表面時，將受到介電泳力，由區(qū)域3向區(qū)域2、區(qū)域1移動。

圖7是根據(jù)本發(fā)明的實施例的利用微流控芯片進(jìn)行實驗的示意圖。

參照圖7，注射泵100用于定量注射樣品或緩沖液，信號發(fā)生器200用于提供合適的交流電，顯微鏡300用于實時觀察與檢測，樣品或緩沖液流出微流控芯片最終被廢液管400收集處理，詳細(xì)步驟如下：

首先，啟動注射泵100將緩沖液由第一進(jìn)孔61(或第二進(jìn)孔62)推入由封閉的圖案化粘結(jié)件50形成的流道內(nèi)，對流道進(jìn)行清洗并排出流道中的氣泡；

接著，氣泡排出后打開信號發(fā)生器200，信號發(fā)生器200提供電信號，將細(xì)胞樣品從第二進(jìn)孔62(或第一進(jìn)孔61)推入由封閉的中空結(jié)構(gòu)51形成的流道內(nèi)，觀察細(xì)胞吸附情況；

接著，細(xì)胞樣品注射完成后，由第一進(jìn)孔61(或第二進(jìn)孔62)繼續(xù)注射適 量緩沖液以去除未吸附細(xì)胞；

最后，整個過程結(jié)束之后，對由封閉的中空結(jié)構(gòu)51形成的流道內(nèi)內(nèi)細(xì)胞計數(shù)。

在本實施例中，細(xì)胞捕獲的實施過程簡單，由于電壓較小且流體一直處于流動狀態(tài)，電場對細(xì)胞活性的影響較小，捕獲后的細(xì)胞仍保持活性，可進(jìn)行其他檢測。

綜上所述，根據(jù)本發(fā)明的實施例，具有以下優(yōu)點：

一、將生物分子間親和性吸附捕獲細(xì)胞與介電泳原理相結(jié)合，模擬細(xì)胞在生理溶液中的液體環(huán)境，利用負(fù)向介電泳力克服細(xì)胞親和性捕獲過程中非特異性吸附力對吸附結(jié)果的干擾，既保存了親和性吸附的高效性，也得到了吸附細(xì)胞高純度的特點；

二、細(xì)胞吸附過程簡單，操作容易，對設(shè)備要求不高，捕獲的成本較低，且不需對細(xì)胞樣品進(jìn)行復(fù)雜預(yù)處理，避免免細(xì)胞損失；

三、產(chǎn)生介電泳力的微型電極的制作過程簡單，可根據(jù)不同的流道結(jié)構(gòu)設(shè)計電極結(jié)構(gòu)，改變電場的分布；介電泳力的作用距離有限，不會對干擾其他捕獲方法的實施，易于與其他捕獲方法結(jié)合，達(dá)到更好的捕獲效果；

四、采用圖案化的粘結(jié)件形成圖案化流道結(jié)構(gòu)，制作方便、成本低廉；直流道設(shè)計，為提高通量，可大量集成，大大減小分離吸附速度；

五、分離的過程所用的交流電電壓較小，且流體一直處于流動狀態(tài)，避免了流體中的電效應(yīng)對細(xì)胞活性的損害，對細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白檢測等后續(xù)檢測有利。

雖然已經(jīng)參照特定實施例示出并描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解：在不脫離由權(quán)利要求及其等同物限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可在此進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)上的各種變化。