本發(fā)明涉及一種分離材料，尤其涉及一種同步富集分離微量黃酮和生物堿的固相萃取材料及其制備方法和在復(fù)雜生物樣品分析的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥研究的核心內(nèi)容之一，也是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵所在，但由于中藥成分的復(fù)雜性，中藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究非常困難，已成為制約中藥發(fā)展公認(rèn)的瓶頸問題。中藥化學(xué)成分是中藥藥效產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)，從藥理學(xué)角度來看，被生物體吸收的成分才有機(jī)會(huì)成為潛在的有效成分。因此，研究生物樣品中的中藥有效成分變化，能夠?yàn)槊鞔_中藥藥效、物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。生物樣品包括血液、細(xì)胞培養(yǎng)液、尿液、組織液、組織勻漿液等多種類型，普遍存在樣品基質(zhì)非常復(fù)雜和有效成分濃度很低兩個(gè)問題，需要采取適當(dāng)?shù)姆蛛x、凈化和富集等樣品處理技術(shù)，增加檢測靈敏度和準(zhǔn)確度，同時(shí)降低對(duì)整個(gè)檢測系統(tǒng)的污染。

生物堿和黃酮是兩類重要的天然活性物質(zhì)，廣泛分布于多種藥物植物中。其中生物堿類具有降血壓、抗心律失常、抗血小板聚集、降血糖、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性、抗氧化等藥理作用；黃酮類具有清除自由基、抗氧化、抑制腫瘤細(xì)胞等多種生物活性。因此，開發(fā)和運(yùn)用現(xiàn)代分離分析技術(shù)分離和定量分析生物樣品中的生物堿和黃酮成分，然后進(jìn)行藥效篩選和藥理實(shí)驗(yàn)，能夠更為科學(xué)合理地利用藥用植物資源，極有可能開發(fā)出新型天然藥物。

目前生物堿的提取方法包括酸水提取法、乙醇提取法和離子交換樹脂法等。黃酮的提取方法主要有溶劑提取法、微波提取法、超聲波提取法、酶解法、超臨界流體萃取法、雙水相萃取分離法、半仿生提取法等。但以上方法只能用于藥材中生物堿或黃酮的富集分離，不能用于樣品量較少，且基體復(fù)雜的生物樣品分析。由于生物樣品的樣品量少，基體復(fù)雜，生物樣品前處理一般采用固相萃取小柱或液液萃取法，但目前尚未見到能夠同時(shí)分離富集生物樣品中生物堿和黃酮的樣品前處理方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是設(shè)計(jì)了一種同時(shí)具有陽離子交換和反相保留能力的吸附材料，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述的吸附材料的制備方法，本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述的吸附材料的應(yīng)用。本發(fā)明用于同步富集分離生物樣品中的生物堿和黃酮，與高效液相色譜聯(lián)合使用，定量分析生物堿和黃酮成分，為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供實(shí)驗(yàn)裝置及實(shí)驗(yàn)方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

一種同時(shí)具有陽離子交換和反相保留能力的吸附材料，該吸附材料由苯乙烯-二乙烯苯聚合物微球的磺化修飾制得，苯乙烯-二乙烯苯聚合物微球中含有0.1%~20%的納米碳管。

作為優(yōu)選，所述的苯乙烯-二乙烯苯聚合物微球中含有1%~15%的納米碳管。再優(yōu)選，所述的苯乙烯-二乙烯苯聚合物微球中含有5%~12%的納米碳管。

作為優(yōu)選，所述的納米碳管采用多壁碳納米管和單壁碳納米管中的一種或兩種混合。

作為優(yōu)選，所述的苯乙烯-二乙烯苯聚合物中苯乙烯和二乙烯基苯單體的比為：1:10~10:1。

為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

一種制備所述的吸附材料的方法，該方法采用種子聚合方法，該方法包括以下的步驟：

1）種子溶液的制備：在反應(yīng)容器中加入90~95%乙醇水溶液、聚吡咯烷酮；通氮?dú)獬パ鯕?，把反?yīng)裝置的溫度恒定設(shè)為60~80℃；加入苯乙烯、偶氮二異丁腈，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，攪拌反應(yīng)20~30小時(shí)后停止加熱，反應(yīng)結(jié)束后將種子乳液用水反復(fù)清洗抽濾，再用無水乙醇洗滌，轉(zhuǎn)移至0.1~0.5%質(zhì)量百分比濃度的十二烷基磺酸鈉溶液中分散保存；

2）微球的制備：在種子溶液中加入苯乙烯，二乙烯基苯，甲苯，過氧化苯甲酰、十二烷基磺酸鈉，聚乙二醇水溶液和碳納米管；將該混合液超聲分散至上層無油滴，然后在室溫下攪拌20~30小時(shí)；通氮?dú)?，水浴溫度升溫?0~80℃，攪拌反應(yīng)20~30小時(shí)；反應(yīng)所得乳液用熱水反復(fù)清洗抽濾，至無泡沫時(shí)用無水乙醇洗滌后真空干燥，再用甲苯作為提取溶劑，索氏抽提60~80小時(shí)，烘干備用；

3）微球的磺化修飾：將微球分散在濃硫酸中，在35~45℃水浴中超聲0.1~0.5小時(shí)，得到懸浮液用水稀釋后抽濾，然后用水洗至pH值7，過濾后，真空干燥。

作為優(yōu)選，所述的步驟1）種子溶液的制備中個(gè)成分的質(zhì)量比為乙醇水溶液：苯乙烯：聚吡咯烷酮：偶氮二異丁腈=40~60:4~6：0.4~0.6~0.1~0.3。

作為優(yōu)選，所述的步驟2）中按重量百分比計(jì)：

聚乙二醇水溶液 80~95%

苯乙烯 1~5%

二乙烯基苯 2~10%

甲苯 4~10%

過氧化苯甲酰 0.02~0.1%

十二烷基磺酸鈉 0.1~0.5%

碳納米管 0.1~1%。

為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

上述的吸附材料用于生物堿和黃酮同時(shí)分離富集的固相萃取材料。

一種生物堿和黃酮同時(shí)分離富集的方法，該方法包括以下的步驟：

1）吸取的生物樣品于離心管中離心后取上清液，轉(zhuǎn)移至另一只干凈的離心管中備用；

2）加入緩沖溶液與離心管中，與樣品混合均勻，緩沖溶液的pH范圍為4-7；

3）加入權(quán)利要求1~4任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的吸附，超聲混勻，進(jìn)行萃??；

4）離心后去除上層清液，加入洗脫溶劑洗脫；

5）離心后吸取上層清液，以氮?dú)獯蹈伞?/p>

所述的生物樣品包括：細(xì)胞培養(yǎng)液、組織液、血清、血漿、尿液、組織勻漿液、唾液、乳汁、淚液、膽汁、胃液、胰液、糞便中的一種；緩沖溶液類型包括磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、鄰苯二甲酸緩沖液中的一種；洗脫溶劑選用甲醇、乙腈、二氯甲烷、甲醇-氨水混合溶液、乙腈-氨水混合溶液、二氯甲烷-二乙胺混合溶液、二氯甲烷-三乙胺混合溶液、甲醇-二乙胺混合溶液、甲醇-三乙胺混合溶液、乙腈-二乙胺混合溶液、乙腈-三乙胺混合溶液中的一種。

本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種同時(shí)具有陽離子交換和反相保留能力的吸附材料，采用碳納米管增強(qiáng)其對(duì)生物堿和黃酮的保留能力，將該吸附材料置于生物樣品中，能夠同步富集分離樣品中的生物堿和黃酮成分，洗脫后采用高效液相色譜進(jìn)行定量檢測。該材料及方法主要用于生物堿和黃酮的同時(shí)定量分析，其他采用的混合保留模式材料在化學(xué)結(jié)構(gòu)、工作原理上均與本發(fā)明存在明顯差異。

本發(fā)明由于采用了上述的固相萃取材料及應(yīng)用步驟，具有以下的特點(diǎn)：

1、樣品凈化高效快速

由于目前用于富集黃酮和生物堿成分的固相萃取材料，大多只能用于單類成分的富集，不能實(shí)現(xiàn)黃酮和生物堿的同步富集，且大多吸附容量小，只能用于樣品量大（一般大于10 mL）、目標(biāo)成分含量較高（一般大于5 mg/mL）的樣品中，不能用于樣品量小、且目標(biāo)成分含量低的生物樣品。本發(fā)明的固相萃取材料具有離子交換和反相保留雙重吸附能力，且吸附容量大，能夠用于樣品量小（最低僅用0.1mL），同時(shí)吸附生物樣品中微量黃酮和生物堿（成分濃度最低可到0.002mg/mL），萃取效率顯著提高。

2、吸附容量可調(diào)

本發(fā)明的固相萃取材料及其應(yīng)用方法，可針對(duì)不同的目標(biāo)物質(zhì)和樣品，調(diào)節(jié)碳納米管用量與磺化修飾時(shí)間，方便調(diào)節(jié)離子交換和反相吸附容量，靈活選擇多種萃取溶劑，通過調(diào)整不同的吸附容量、溶劑類型、用量和萃取時(shí)間，提供多樣化的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，滿足不同生物樣品的分析要求。

3、萃取方法簡便

目前的固相萃取普遍采用固相萃取柱或?qū)游鲋韫滔噍腿〔牧嫌昧枯^大（一般大于2g），有機(jī)溶劑用量也較大（一般大于5mL），且需要較高的實(shí)驗(yàn)技巧，操作繁瑣耗時(shí)。本發(fā)明所用的固相萃取法是不需要額外的固相萃取柱或?qū)游鲋?，通過分散固相萃取材料于樣品中實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成分的吸附。萃取過程簡便可控，結(jié)果重現(xiàn)性好，能夠?yàn)樯飿悠返纳V分析提供可靠的樣品前處理裝置。

4、應(yīng)用前景良好

本發(fā)明所采用的制備材料是各類實(shí)驗(yàn)室常用的實(shí)驗(yàn)耗材，萃取材料如萃取溶劑和容器也應(yīng)用廣泛，取材方便。通過本發(fā)明的制備方法，可以方便地合成所需固相萃取材料，開展樣品前處理實(shí)驗(yàn)，且該材料可以多次重復(fù)使用，能夠?yàn)闇p少樣品前處理時(shí)間，降低實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，發(fā)揮積極的作用。

附圖說明

圖1固相萃取材料的掃描電鏡圖A：不含碳納米管的固相萃取材料；B：含碳納米管的固相萃取材料；C：不含碳納米管的固相萃取材料（局部放大圖）；D：含碳納米管的固相萃取材料（局部放大圖）。

圖2 檢測波長為225nm的HPLC色譜分離圖 A：標(biāo)準(zhǔn)溶液；B：破骨細(xì)胞培養(yǎng)液樣品；C：大便樣品；D：尿液樣品；E：成骨細(xì)胞培養(yǎng)液樣品。色譜峰1：木蘭花堿。

圖3 檢測波長為270nm的HPLC色譜分離圖 A：標(biāo)準(zhǔn)溶液；B：淫羊藿提取液；C：破骨細(xì)胞培養(yǎng)液樣品；D：大便樣品；E：尿液樣品；F：成骨細(xì)胞培養(yǎng)液樣品。色譜峰1：表小檗堿；色譜峰2：藥根堿；色譜峰3：巴馬?。簧V法4：朝藿定A；色譜峰5：朝藿定B；色譜峰6：朝藿定C；色譜峰7：淫羊藿苷。

具體實(shí)施方式

1、吸附材料的制備

1）試劑的前處理

苯乙烯：將50 mL苯乙烯裝入減壓蒸餾裝置中，減壓蒸餾去除阻聚劑，收集餾分放入棕色試劑瓶中4℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

二乙烯基苯：將50mL二乙烯基苯裝入減壓蒸餾裝置中，減壓蒸餾去除阻聚劑，收集餾分放入棕色試劑瓶中4℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

偶氮二異丁腈：在25℃下用無水乙醇重新溶解偶氮二異丁腈，配制成飽和溶液，過濾后將飽和溶液冷卻靜置重結(jié)晶，將警惕用無水乙醇洗滌，真空干燥，放入棕色試劑瓶中4℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

過氧化苯甲酰：在25攝氏度將過氧化苯甲酰用氯仿配制成飽和溶液，過濾后加入等體積甲醇，待其自然揮發(fā)、析出晶體后抽濾、用少量甲醇洗滌后，真空干燥，放入棕色試劑瓶中4℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

碳納米管：將1500mg多壁碳納米管或單壁碳納米管分散在100mL濃硫酸和濃硝酸的混合溶液中，其中濃硫酸和濃硝酸的體積比為3:1。在10-50℃水浴中超聲12小時(shí)，得到懸浮液用水稀釋后抽濾，然后用水洗至pH值7，過濾后，真空干燥，放入試劑瓶中4℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2）吸附材料的制備

種子的制備：在1000mL三頸瓶中加入95%乙醇水溶液50mL、聚吡咯烷酮0.5g；通氮?dú)?0min除去氧氣，把反應(yīng)裝置的溫度恒定設(shè)為70℃；加入苯乙烯5g、偶氮二異丁腈0.2g，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，攪拌反應(yīng)24小時(shí)后停止加熱，反應(yīng)借宿后將種子乳液用水反復(fù)清洗抽濾，再用無水乙醇洗滌5次，轉(zhuǎn)移至0.2%十二烷基磺酸鈉溶液中分散保存。

微球的制備：在1000mL三頸瓶中加入5g苯乙烯，10g二乙烯基苯，14g甲苯，0.2g過氧化苯甲酰、0.8g十二烷基磺酸鈉，250mL 1%聚乙二醇水溶液和1500 mg碳納米管。將該混合液超聲分散至上層無油滴，然后在室溫下攪拌24小時(shí)。通氮?dú)?，水浴溫度升溫?0℃，攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)所得乳液用熱水反復(fù)清洗抽濾，至無泡沫時(shí)用無水乙醇洗3次后真空干燥，再用甲苯作為提取溶劑，索氏抽提72小時(shí)，烘干備用。

微球的磺化修飾：將微球分散在100mL濃硫酸中，在40℃水浴中超聲0.2小時(shí)，得到懸浮液用水稀釋后抽濾，然后用水洗至pH值7，過濾后，真空干燥，放入試劑瓶中保存?zhèn)溆?。制備所得微球中碳納米管含量約為10%。

3）生物樣品制備

淫羊藿提取液：稱取100g淫羊藿藥材于2000mL圓底燒瓶中，加入1000mL水，加熱提取2小時(shí)，過濾，濾渣再用1000mL水提取2次，合并濾液，減壓蒸餾濃縮即為淫羊藿提取液，生藥含量為0.38g/mL。

成骨細(xì)胞培養(yǎng)液：成骨細(xì)胞密度為1×10⁵，培養(yǎng)液中加入淫羊藿提取液，最終含量（以生藥量計(jì)）為1.90mg/mL。經(jīng)24小時(shí)后，吸取0.5mL細(xì)胞培養(yǎng)液，過濾后即為成骨細(xì)胞培養(yǎng)液樣品。

破骨細(xì)胞培養(yǎng)液：破骨細(xì)胞密度為1×10⁵，培養(yǎng)液中加入淫羊藿提取液，最終含量（以生藥量計(jì)）為1.90mg/mL。經(jīng)24小時(shí)后，吸取0.5mL細(xì)胞培養(yǎng)液，過濾后即為破骨細(xì)胞培養(yǎng)液樣品。

大鼠尿液：清潔級(jí)雌性大鼠，體重為200g，給藥劑量為3.80g/kg/天，給藥3天，1天1次。收集第三天大鼠尿液，減壓蒸餾濃縮至干，加入1mL純水將殘?jiān)咳芙?，過濾后即為大鼠尿液樣品。

大鼠大便樣品：清潔級(jí)雌性大鼠，體重為200g，給藥劑量為3.80g/kg/天，給藥3天，1天1次。收集第三天大鼠大便。稱取5g大鼠大便，加入10mL純水，勻漿，離心后取上清液，濃縮至干，加入1mL純水將殘?jiān)咳芙?，過濾后為大鼠大便樣品。

4) 固相萃取步驟：

吸取0.1mL生物樣品于離心管中。離心管體積為1.5mL。加入0.2mL磷酸鹽緩沖液（pH為5.8）與離心管中，與樣品混合均勻。加入10mg固相萃取材料，超聲混勻，萃取2min。離心后去除上層清液，加入0.1mL洗脫溶劑。洗脫溶劑為甲醇-氨水混合溶液（80:20，v/v）。離心后吸取上層清液，以氮?dú)獯蹈桑?.1mL乙腈溶解，用高效液相色譜分析。

5）生物樣品中淫羊藿黃酮和生物堿含量測定結(jié)果

采用外標(biāo)法，計(jì)算實(shí)際樣品淫羊藿含量，結(jié)果見表1。

表1. 生物樣品中淫羊藿黃酮和生物堿含量

^an.a.：未檢出。