本發(fā)明涉及磁性微球的制備領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種高密度羧基修飾的磁性微球及其制備方法。
背景技術(shù)：
：生物磁性微球是一種新型的功能化固體載體，其表面修飾有活性基團(tuán)，可以與多種生物活性物質(zhì)發(fā)生偶聯(lián)，兼具有液體的流動(dòng)性和固體磁性材料等特點(diǎn)，在外磁場(chǎng)的作用下可以定向移動(dòng)和集中，當(dāng)撤去外磁場(chǎng)后，稍加振蕩或抽吸又可均勻分散于液體中，從而使固液相的分離變的十分快捷方便，通過(guò)簡(jiǎn)單的洗脫可以得到純度很高的靶向物質(zhì)。利用納微米超順磁性磁性微球提取核酸的方法要比傳統(tǒng)的方法(Chelex100法、有機(jī)法、二氧化硅法、鹽析法等)更為簡(jiǎn)單、方便，并且具有轉(zhuǎn)移離心管的次數(shù)較少、不易污染、無(wú)需離心、操作簡(jiǎn)便快速，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。該方法主要依靠靜電作用、疏水作用和氫鍵作用將核酸結(jié)合到磁性微球上。先將細(xì)胞或組織經(jīng)過(guò)裂解液作用使其中的DNA/RNA被釋放出來(lái)，然后經(jīng)過(guò)表面修飾的磁性微球與核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成核酸-磁性微球復(fù)合物，最后在外加磁場(chǎng)的作用下，分離出核酸-磁性微球復(fù)合物。其中，氨基與羧基是兩種常用來(lái)修飾磁性微球的活性基團(tuán)，在一定條件下，它們可以與生物配基偶聯(lián)得到免疫磁珠。其中，氨基修飾的磁性微球容易獲得，且氨基的活性較好，很容易與生物配基進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)。在使用時(shí)一般通過(guò)戊二醛與生物配基偶聯(lián)，利用戊二醛作為空間臂對(duì)磁性微球表面的氨基和生物配基中的氨基進(jìn)行還原胺化反應(yīng)，獲得較高的包被量。但是該方法在進(jìn)行還原胺化反應(yīng)時(shí)還需要添加強(qiáng)還原劑(如硼氫化鈉或者氰基硼氫化鈉)，容易引起蛋白等活性物質(zhì)失活，而且戊二醛也會(huì)導(dǎo)致磁性微球和生物配基自身發(fā)生交聯(lián)，也會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部交聯(lián)，不利于生物配基的包被。而羧基修飾的磁性微球則利用磁性微球表面的羧基與EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)/NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)反應(yīng)后，生成NHS活化的磁性微球中間體，再利用NHS基團(tuán)與生物配基上的氨基偶聯(lián)。該方法易于操作，且反應(yīng)迅速，適用于小分子、短肽作為生物配基的偶聯(lián)。但是羧基修飾的磁性微球表面的羧基密度低，活性位點(diǎn)較少，并且羧基活性低、偶聯(lián)效率低、生物配基的包被量少。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足提供一種高密度羧基修飾的磁性微球的制備方法，該制備方法簡(jiǎn)單，制備得到的磁性微球表面的羧基密度高，活性位點(diǎn)多。在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種高密度羧基修飾的磁性微球的制備方法，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟：s1：制備氨基修飾的磁性微球；s2：將所述氨基修飾的磁性微球與有機(jī)羧酸混合，再加入EDC和NHS，反應(yīng)1～3小時(shí)后得到所述高密度羧基修飾的磁性微球。所述氨基修飾的磁性微球可以采用市售商品或者按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)方法制備，均不影響本發(fā)明的結(jié)果。本發(fā)明制備氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球，可以使磁性納米粒子聚集在二氧化硅內(nèi)部，形成核殼結(jié)構(gòu)，增大粒徑，并且增加磁性和穩(wěn)定性。效果更加優(yōu)于直接在納米磁性粒子表面進(jìn)行氨基修飾得到氨基修飾的磁性微球。優(yōu)選的，所述步驟s1中，氨基修飾的磁性微球?yàn)榘被揎椀亩趸璋拇判晕⑶?，它是通過(guò)如下方法制備得到的：向含有磁性納米粒子的溶液中加入氨水、硅烷化試劑和氨基硅烷偶聯(lián)劑，反應(yīng)1～3天后得到氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球，所述磁性納米粒子、氨水、硅烷化試劑、氨基硅烷偶聯(lián)劑加入的質(zhì)量比為：1:(12.5～40):(2～8):(0.5～3)；氨水的質(zhì)量濃度為25-28％。其中，硅烷化試劑可以為正硅酸四乙酯(CAS：562-90-3)，氨基硅烷偶聯(lián)劑可以為(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(CAS：919-30-2)。本領(lǐng)域技術(shù)人員在選擇其他的硅烷化試劑與氨基硅烷偶聯(lián)劑時(shí)，可以對(duì)反應(yīng)原料的比例進(jìn)行調(diào)整，均不超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。得到的氨基修飾的磁性微球可以進(jìn)行常規(guī)的洗滌純化，例如：通過(guò)磁分離，以及水、乙醇交替洗滌進(jìn)行純化。優(yōu)選的，所述磁性納米粒子為磁性納米Fe3O4，是通過(guò)如下步驟制備得到：s1-1：在空氣中，向二價(jià)鐵鹽的水溶液中加入氨水，攪拌使部分二價(jià)鐵氧化為三價(jià)鐵，在堿性條件下氧化沉淀生成黑色Fe3O4顆粒；s1-2：向步驟s1-1中加入油酸，混合均勻后在60～130℃下加熱反應(yīng)3～5小時(shí)，即可得到所述油酸包裹的超順磁性納米Fe3O4。本發(fā)明的磁性納米粒子也可以通過(guò)其他常規(guī)方法制備得到，比如水熱法、溶劑熱法、共沉淀法等。優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述有機(jī)羧酸為至少含有三個(gè)或三個(gè)以上羧基的多元羧酸。多元羧酸通過(guò)其中一個(gè)羧基與所述氨基修飾的磁性微球偶聯(lián)后，還剩下多個(gè)羧基，能夠使羧基的表面密度增大。最優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述多元羧酸為聚丙烯酸、透明質(zhì)酸、聚谷氨酸或琥珀酰胺酸樹(shù)枝狀聚合物。為了保證有機(jī)羧酸的羧基可以與磁性微球表面的氨基偶聯(lián)，同時(shí)使有機(jī)羧酸由于空間位阻的限制盡可能的只有一個(gè)羧基與氨基偶聯(lián)，應(yīng)控制氨基修飾的磁性微球與有機(jī)羧酸的比例。優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述氨基修飾的磁性微球與所述有機(jī)羧酸的質(zhì)量比為1:(0.4～2)。更優(yōu)選的，所述步驟(2)中，加入的EDC、NHS、有機(jī)羧酸、氨基修飾的磁性微球的質(zhì)量比為(10～60):(5～30):(4～20):10。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種根據(jù)上述任一方法制備得到的高密度羧基修飾的磁性微球。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種核酸提取試劑盒，其中包括磁性微球，所述磁性微球?yàn)樯鲜龅母呙芏若然揎椀拇判晕⑶?。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種免疫磁珠，所述免疫磁珠是通過(guò)上述高密度羧基修飾的磁性微球與生物配基偶聯(lián)，制備得到的。所述生物配基可以為抗體、酶、BSA、DNA或者RNA等具有生物活性的配基。本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明提供了一種羧基修飾的磁性微球，是通過(guò)將氨基修飾的磁性微球表面的氨基與有機(jī)羧酸偶聯(lián)得到的，磁性微球表面的羧基具有高密度的特點(diǎn)。(2)由于磁性微球上的氨基活性比較高，因此與有機(jī)羧酸的偶聯(lián)容易，避免了使用戊二醛進(jìn)行還原胺化反應(yīng)的不足(存在內(nèi)部交聯(lián)，還原劑易導(dǎo)致蛋白等活性物質(zhì)失活)，使反應(yīng)產(chǎn)物更加可控。(3)本發(fā)明的羧基修飾磁性微球表面的羧基是通過(guò)氨基與磁性微球偶聯(lián)的，其空間臂長(zhǎng)度比一般的羧基修飾的磁性微球的空間臂更長(zhǎng)，因此磁性微球表面可排列的羧基密度更高，其在提取核酸的時(shí)候，由于結(jié)合位點(diǎn)多，提取效率也更高。也可以將本發(fā)明的高密度羧基修飾的磁性微球與生物配基偶聯(lián)，得到免疫磁珠，由于羧基密度高，生物配基的包被量也更大。(4)本發(fā)明原料簡(jiǎn)單易得，成本低，工藝步驟簡(jiǎn)單，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。附圖說(shuō)明圖1為氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球1的SEM圖；圖2為氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球1的TEM圖；圖3為實(shí)施例4的質(zhì)粒DNA提取后的電泳圖。具體實(shí)施方式以下通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明：下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書選擇。本發(fā)明實(shí)施例所用的氨水質(zhì)量濃度為25～28％。本發(fā)明實(shí)施例所用的聚丙烯酸分子量為2000，CAS：9003-01-4。本發(fā)明實(shí)施例所用的透明質(zhì)酸分子量為4000。本發(fā)明實(shí)施例所用的聚谷氨酸分子量為50000，CAS：25513-46-6。本發(fā)明實(shí)施例所用的琥珀酰胺酸樹(shù)枝狀聚合物分子量為4885.40～83805.01，購(gòu)自ALDRICH。實(shí)施例1(1)在空氣中，將7gFeCl2·4H2O加入到50mL去離子水中，得到濃度為0.14g/mL的FeCl2水溶液。向50mLFeCl2水溶液中加入氨水30mL，攪拌45min后，顏色逐漸變?yōu)闇\綠色，再變深綠色，最后變?yōu)楹谏?2)向步驟(1)中加入1.1g油酸，混合均勻后將混合液置于密閉的反應(yīng)釜中，在110℃下加熱反應(yīng)4小時(shí)，然后用去離子水和乙醇交替洗滌各一次，磁分離后分散在正己烷中，即可得到黑色的所述油酸包裹的順磁性納米Fe3O41；(3)向含有10mg油酸包裹的順磁性納米Fe3O41的溶液中加入125mg氨水、30mg正硅酸四乙酯和30mg(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，反應(yīng)1天后進(jìn)行磁分離，并且用乙醇和水交替洗滌各兩次后得到氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球1。(4)將10mg步驟(3)所述氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球1與10mg聚丙烯酸混合，再加入60mgEDC和30mgNHS，反應(yīng)1小時(shí)后得到所述高密度羧基修飾的磁性微球1。實(shí)施例2(1)在空氣中，將10gFeCl2·H2O加入到100mL去離子水中，得到濃度為0.10g/mL的FeCl2水溶液。向100mLFeCl2·H2O水溶液中加入氨水20mL，攪拌60min后，顏色逐漸變?yōu)闇\綠色，再變深綠色，最后變?yōu)楹谏?2)向步驟(1)中加入1g油酸，混合均勻后將混合液置于密閉的反應(yīng)釜中，在60℃下加熱反應(yīng)5小時(shí)，然后用去離子水和乙醇交替洗滌各兩次，磁分離后分散在辛己烷中，即可得到黑色的所述油酸包裹的順磁性納米Fe3O42；(3)向含有10mg油酸包裹的順磁性納米Fe3O42的溶液中加入250mg氨水、20mg正硅酸四乙酯和10mg(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，反應(yīng)2天后進(jìn)行磁分離，并且用乙醇和水交替洗滌各兩次后得到氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球2。(4)將10mg步驟(3)所述氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球2與4mg透明質(zhì)酸混合，再加入10mgEDC和5mgNHS，反應(yīng)2小時(shí)后得到所述高密度羧基修飾的磁性微球2。實(shí)施例3(1)在空氣中，將50gFeCl2·H2O加入到100mL去離子水中，得到濃度為0.50g/mL的FeCl2水溶液。向100mLFeCl2·H2O水溶液中加入氨水50mL，攪拌90min后，顏色逐漸變?yōu)闇\綠色，再變深綠色，最后變?yōu)楹谏?2)向步驟(1)中加入5g油酸，混合均勻后將混合液置于密閉的反應(yīng)釜中，在130℃下加熱反應(yīng)3小時(shí)，然后用去離子水和乙醇交替洗滌各兩次，磁分離后分散在正辛烷中，即可得到黑色的所述油酸包裹的順磁性納米Fe3O43。(3)向含有10mg油酸包裹的順磁性納米Fe3O43的溶液中加入125mg氨水、40mg正硅酸四乙酯和5mg(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，反應(yīng)3天后進(jìn)行磁分離，并且用乙醇和水交替洗滌各兩次后得到氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球3。(4)將10mg步驟(3)所述氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球3與8mg聚谷氨酸混合，再加入40mgEDC和20mgNHS，反應(yīng)3小時(shí)后得到所述高密度羧基修飾的磁性微球3。實(shí)施例4按照上述實(shí)施例1的方法，將10mg聚丙烯酸分別替換成20mg琥珀酰胺酸樹(shù)枝狀聚合物，可以得到高密度羧基修飾的磁性微球4。將實(shí)施例1中的氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球1進(jìn)行掃描電子顯微鏡(SEM)檢測(cè)和透射電子顯微鏡(TEM)檢測(cè)，結(jié)果如圖1和圖2所示?？梢钥闯?，氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球1的大小均一，尺寸分布窄，而且分散性好。同時(shí)，內(nèi)核包覆有多個(gè)磁性納米粒子，外殼層分界明顯，說(shuō)明穩(wěn)定性好，不易團(tuán)聚。其他實(shí)施例的氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球SEM和TEM檢測(cè)具有類似效果，不一一贅述。實(shí)施例5質(zhì)粒DNA提取將1.5mL大腸桿菌培養(yǎng)液倒入離心管，12000rpm離心30s棄上清收集菌體，向菌體加入100μL含20μg/mLRNA酶的緩沖液(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0))，200μL堿裂解液(含0.2MNaOH和1％的SDS)，輕柔混合，冰浴3min，再加150μL的pH值為5的5M醋酸鉀溶液，混合靜置，12000rpm離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中；向離心管中加入實(shí)施例1的高密度羧基修飾的磁性微球1.5mg，震蕩混勻，溫育2-5min，將離心管置于磁分離架上，吸棄上清液；加500μL的70％乙醇清洗質(zhì)粒DNA-磁性微粒復(fù)合物兩次，乙醇抽干，加50μL的TE緩沖液(10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0))懸浮磁性微粒，磁分離收集洗脫液。紫外檢測(cè)，DNA在260nm處有紫外特征吸收峰，DNA的純度以(OD260-OD320)/(OD280-OD320)來(lái)確定，該比值應(yīng)在1.7-1.9之間。OD260為樣品溶液在260nm處的吸光值，OD280為樣品溶液在280nm處的吸光值，OD320為樣品溶液紫外測(cè)定時(shí)的背景值。結(jié)果表明，得到約40μg高純度的質(zhì)粒DNA，純度在1.8左右。制備濃度1％瓊脂糖凝膠，取上述提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行電泳，25min后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳結(jié)果。電泳結(jié)果如圖3所示，可以看出，高密度羧基磁珠提取的質(zhì)粒DNA很完整，提取結(jié)果批間差異小，產(chǎn)量及純度高。取1mg上述實(shí)施例1～4中的高密度羧基修飾的磁性微球1～4活化后，加入200μg的BSA，混合均勻后在4℃下孵育12小時(shí)。然后用pH為7.4的PBS緩沖液(含0.1％的Tween)洗滌3次，得到免疫磁珠1～4。并取市售羧基修飾的二氧化硅(磁珠)包裹的磁性微球作為對(duì)照組。對(duì)上述免疫磁珠1～4進(jìn)行表面BSA檢測(cè)，得到的結(jié)果如表1所示：每毫克不同BSA包被量實(shí)施例180微克實(shí)施例276微克實(shí)施例3110微克實(shí)施例4102微克對(duì)照組20微克表1免疫磁珠的BSA包被量從表1可以看出，用本發(fā)明的高密度羧基修飾的磁性微球與生物配基偶聯(lián)得到免疫磁珠，大大提高了免疫磁珠表面的BSA包被量。對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明實(shí)施例原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為本發(fā)明實(shí)施例的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3