本發(fā)明涉及一種表面多孔型核殼結(jié)構(gòu)硅膠微球及其制備方法及其色譜分離應(yīng)用，屬于分析化學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，由固體核和表面多孔的殼組成的核殼結(jié)構(gòu)色譜固定相被廣泛應(yīng)用于高流速低壓色譜體系中。由于固體核表面多孔的外殼能夠增大固體核的尺寸，降低了柱壓，同時(shí)由于多孔的外殼材料增大了核的比表面積，從而提高色譜柱載樣量，如2.2μm核殼結(jié)構(gòu)硅膠由0.5μm厚多孔的殼和1.7μm的核組成(g.guiochonandf.gritti,journalofchromatographya,2011,1218,1915-1938.)，能夠產(chǎn)生和2μm的粒子相同的柱效，同時(shí)柱壓又接近于裝填了3μm的硅膠微球填料的色譜柱的柱壓。因而，核殼結(jié)構(gòu)的較小的孔隙體積能夠減少縱向擴(kuò)散(即vandeemter方程中的b項(xiàng))，同時(shí)，較短的擴(kuò)散路徑能夠減小傳質(zhì)阻力，從而減小vandeemter方程中的c項(xiàng)，因而對(duì)難以采用色譜分離的大分子化合物如蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子化合物具有較好的分離效果。

vandeemter方程：h＝a+b/u+cu

核殼結(jié)構(gòu)中的核和殼可以是不同的材料或者相同的材料不同的結(jié)構(gòu)組成，如圖所示，圖1為幾種不同的核殼結(jié)構(gòu)粒子的示意圖，其中核可以是一個(gè)單獨(dú)的球(圖1(a))或者是幾個(gè)小球的合體(圖1(b))；核殼結(jié)構(gòu)可能是含有一個(gè)中空的外殼和中間一個(gè)小球(圖1(c))，或像一個(gè)蛋黃-蛋殼的結(jié)構(gòu)(圖1(c))；殼結(jié)構(gòu)可以是一個(gè)連續(xù)層(圖1(c)和圖1(h))、一些更小的球吸附到一個(gè)大核表面(圖1(d)和圖1(e))或者核是由一群小核聚集合成(圖1(f))(x.l.zhang,h.y.niu,w.h.li,y.l.shiandy.q.cai,chemicalcommunications,2011,47,4454-4456.)。比較復(fù)雜的核殼結(jié)構(gòu)是將一些更小的小球嵌入到殼里面(圖1(g))(x.y.lai,j.li,b.a.korgel,z.h.dong,z.m.li,f.b.su,j.a.duandd.wang,angewandtechemie-internationaledition,2011,50,2738-2741.)或者是由多層殼組成(圖1(i))(r.j.gui,a.wanandh.jin,analyst,2013,138,5956-5964.)，這些核和殼都由一個(gè)無(wú)孔的核和多孔的殼組成，核殼結(jié)構(gòu)的材料被廣泛應(yīng)用于色譜分離中，其中應(yīng)用最多的基質(zhì)填料是硅膠。不同孔徑大小的核殼結(jié)構(gòu)可以用于分離不同大小的分析物，當(dāng)核殼材料的孔徑在8-10nm之間，適合用于小分子化合物的分離(j.j.destefano,s.a.schuster,j.m.lawhornandj.j.kirkland,journalofchromatographya,2012,1258,76-83.)，孔徑更大的填料可用于分離更大相對(duì)分子質(zhì)量的分子化合物。如孔徑16nm用于分離多肽和小分子蛋白質(zhì)(mw<15kda)(j.j.kirkland,f.a.truszkowski,c.h.dilksandg.s.engel,journalofchromatographya,2000,890,3-13.)；更大孔徑的多孔材料，如孔徑40nm，可以允許大分子(mw<500kda)化合物能夠無(wú)限制地進(jìn)入固定相，從而獲得較好的分離效果。

大部分核殼結(jié)構(gòu)的硅膠材料是采用層層自組裝(lbl)的方法制備，特別是現(xiàn)在市場(chǎng)中商品化的核殼結(jié)構(gòu)的硅膠(g.guiochonandf.gritti,journalofchromatographya,2011,1218,1915-1938.)。該方法利用正負(fù)電荷之間的靜電作用(或氫鍵作用、共價(jià)鍵、范德華力等)組裝成多層，具體方法為：硅膠核首先吸附一層帶電聚合物(如帶負(fù)電荷的硅膠能夠吸附帶正電荷的聚合物)，表面多余的帶電聚合物被水洗掉，這個(gè)包裹的核材料再浸潤(rùn)在與帶電聚合物具有相反電荷的納米顆粒溶液中，從而再吸附一層殼。這個(gè)過(guò)程是交替重復(fù)沉浸在帶電聚合物溶液和納米顆粒的懸浮液中，直到形成所需厚度的殼(g.guiochonandf.gritti,journalofchromatographya,2011,1218,1915-1938.)；最后將形成的粒子采用高溫煅燒去除表面的有機(jī)聚合物，形成核殼多孔的材料。但是這種制備方法時(shí)間長(zhǎng)，重現(xiàn)性差，因而需要找出一種制備簡(jiǎn)單，方法可控，重現(xiàn)性更好的制備核殼型材料的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)難題，本發(fā)明提供一種操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用廣泛的表面多孔的核殼固定相的制備方法及對(duì)上述表面多孔型核殼結(jié)構(gòu)硅膠微球進(jìn)行改性的方法，首先將在硅膠微球表面堆積h2sif6水解的納米氧化硅顆粒組成核殼型材料，再在該核殼材料表面進(jìn)行功能化修飾，可以得到多種不同的色譜固定相。

本發(fā)明所提供的技術(shù)方案具體如下：

一種表面多孔型核殼結(jié)構(gòu)硅膠微球，具有核殼結(jié)構(gòu)，以粒徑為2～5μm的球形硅膠為核，以球形硅膠表面堆積的硅膠納米顆粒所形成的多孔殼狀結(jié)構(gòu)為殼，核與殼緊密結(jié)合，殼的厚度為100-700nm，孔徑范圍為15-120nm。

一種表面多孔型核殼結(jié)構(gòu)硅膠微球的制備方法，包括以下步驟：將粒徑為2～5μm的球形硅膠加入10體積份35wt％的h2sif6水溶液中，攪拌2～16h，其中，球形硅膠和h2sif6水溶液的用量比為1g：1ml；然后依次加入5體積份水和6體積份0.1mol·l^-1h3bo3水溶液，混合均勻；先將混合溶液在真空環(huán)境中靜置1h，再在40℃的恒溫?fù)u床中振蕩12～24h，然后將反應(yīng)后的混合溶液用沙芯漏斗過(guò)濾，過(guò)濾出的固體在120℃下烘干，再將烘干產(chǎn)物置于馬弗爐中，以140℃/min的速率升溫至200℃，保持2h，得到表面多孔型核殼結(jié)構(gòu)硅膠微球，即sio2＠sio2。

一種對(duì)上述表面多孔型核殼結(jié)構(gòu)硅膠微球進(jìn)行改性的方法，包括以下步驟：將表面多孔型核殼結(jié)構(gòu)硅膠微球置于反應(yīng)釜中，加入8體積份硅烷偶聯(lián)劑和200體積份無(wú)水甲苯，在130℃下反應(yīng)12h，冷卻至室溫后進(jìn)行抽濾，然后依次用甲苯﹑丙酮、甲醇洗滌，45℃烘干，即得到表面修飾硅烷偶聯(lián)劑的表面多孔型核殼結(jié)構(gòu)硅膠微球。

所述的硅烷偶聯(lián)劑為十八烷基三甲氧基硅烷或氨基丙基三甲氧基硅烷等硅烷偶聯(lián)劑。

一種表面修飾硅烷偶聯(lián)劑的表面多孔型核殼結(jié)構(gòu)硅膠微球，由上述方法制備得到。

上述表面修飾硅烷偶聯(lián)劑的表面多孔型核殼結(jié)構(gòu)硅膠微球用于蛋白質(zhì)的分離或多肽的分離。

上述表面修飾硅烷偶聯(lián)劑的表面多孔型核殼結(jié)構(gòu)硅膠微球作為色譜固定相的應(yīng)用。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

1.本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，制備時(shí)間短，方法可控(可以制備出不同孔徑不同厚度的多孔外殼)，重現(xiàn)性好。

2.本發(fā)明制備的核殼型硅膠應(yīng)用性能好，可用于蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子化合物的分離，以及多種物質(zhì)的快速色譜分離。

附圖說(shuō)明

圖1是不同類(lèi)型的核殼結(jié)構(gòu)的示意圖；其中，圖1(a)表示核是一個(gè)單獨(dú)的球的核殼結(jié)構(gòu)，圖1(b)表示核是幾個(gè)小球的合體的核殼結(jié)構(gòu)；圖1(c)表示含有一個(gè)中空的外殼和中間一個(gè)小球的蛋黃-蛋殼核殼結(jié)構(gòu)；圖1(d)和圖1(e)表示一些更小的球吸附到一個(gè)大核表面的核殼結(jié)構(gòu)，圖1(f)表示核和殼均由一群小核聚集合成的核殼結(jié)構(gòu)，圖1(g)表示將一些更小的小球嵌入到殼里面的復(fù)雜核殼結(jié)構(gòu)，圖1(h)表示中空的核和連續(xù)的殼的核殼結(jié)構(gòu)，圖1(i)表示具有多層殼的核殼結(jié)構(gòu)。

圖2是粒徑為5μm球形硅膠和在40℃的恒溫?fù)u床中振蕩24h所制備的殼厚度為0.48μm的sio2＠sio2的掃描電鏡(sem)圖；其中，圖2(a)是粒徑為5μm球形硅膠在放大1萬(wàn)倍的sem圖；圖2(b)是粒徑為5μm球形硅膠放大5萬(wàn)倍的sem圖；圖2(c)是殼厚度為0.48μm的sio2＠sio2放大1萬(wàn)倍的sem圖；圖2(d)是殼厚度為0.48μm的sio2＠sio2放大5萬(wàn)倍的sem圖。

圖3是粒徑為5μm球形硅膠和所制備的殼厚度為0.48μm的sio2＠sio2的透射電鏡(tem)譜圖；其中，圖3(a)是粒徑為5μm球形硅膠放大5萬(wàn)倍的tem圖；圖3(b)是殼厚度為0.48μm的sio2＠sio2放大5萬(wàn)倍的tem圖。

圖4為十八烷基鍵合sio2＠sio2分離5種蛋白質(zhì)混合物的色譜分離圖。

圖5為十八烷基鍵合sio2＠sio2分離胰蛋白酶酶解的牛血清蛋白(bsa)的酶解物色譜分離圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例為了使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員更清楚地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。以下百分比若無(wú)特殊說(shuō)明，均表示體積百分比。

實(shí)施例1

將10g粒徑為5μm的球形硅膠加入到10ml35wt％h2sif6水溶液中，攪拌2h；然后依次加入5ml水和6ml0.1mol·l^-1h3bo3溶液，混合均勻；先將混合溶液在真空環(huán)境中靜置1h，再在40℃的搖床中振蕩24h，然后將反應(yīng)后的混合溶液用沙芯漏斗過(guò)濾，過(guò)濾出的固體在120℃下烘干，再將烘干產(chǎn)物置于馬弗爐中，以140℃/min的速率升至200℃，并保持2h，即得到表面多孔型核殼結(jié)構(gòu)硅膠微球，即sio2＠sio2；

然后將制備的表面多孔型核殼硅膠置于反應(yīng)釜中，再加入8ml十八烷基三甲氧基硅烷和20ml無(wú)水甲苯，在130℃溫度下反應(yīng)12h，冷卻，抽濾，抽濾出的固體依次用甲苯﹑丙酮、甲醇洗滌，45℃烘干備用，即得到十八烷基鍵合sio2＠sio2。

實(shí)施例2

將10g粒徑為5μm的球形硅膠加入到10ml35wt％h2sif6水溶液中，攪拌16h；然后依次加入5ml水和6ml0.1mol·l^-1h3bo3溶液，混合均勻；先將混合溶液在真空環(huán)境中靜置1h，再在40℃的搖床中振蕩12h，然后將反應(yīng)后的混合溶液用沙芯漏斗過(guò)濾，過(guò)濾出的固體在120℃下烘干，再將烘干產(chǎn)物置于馬弗爐中，以140℃/min的速率升至200℃，并保持2h，即得到表面多孔型核殼結(jié)構(gòu)硅膠微球，即sio2＠sio2；

然后將制備的表面多孔型核殼硅膠置于反應(yīng)釜中，再加入8ml氨基丙基三甲氧基硅烷和20ml無(wú)水甲苯，在130℃溫度下反應(yīng)12h，冷卻，抽濾，抽濾出的固體依次用甲苯﹑丙酮、甲醇洗滌，45℃烘干備用，即得到氨基鍵合sio2＠sio2。

實(shí)施例3

將十八烷基鍵合sio2＠sio2裝填于50mm×4.6mm(i.d.)的液相色譜柱中，然后將其用于5種標(biāo)準(zhǔn)多肽樣品混合物(crgrgrgr-594.73kda,spvlaedpsegee-1269.21kda,cfrgl-594.73,cfrglrgfrg-1381.61,angitotensinⅱ-1046.18)的色譜分離，得到了很好的分離效果。

色譜條件：溶劑a為0.1％tfa水溶液，溶劑b為乙腈/0.1％tfa。流動(dòng)相梯度程序?yàn)?t表示時(shí)間(min)，例如：t20表示進(jìn)樣后20min時(shí))：t0，20％b；t20，90％b；流速為0.2ml/min；樣品進(jìn)樣量為20μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm；柱溫：50℃。

實(shí)施例4

將十八烷基鍵合sio2＠sio2裝填于50mm×4.6mm(i.d.)的液相色譜柱中，然后將其用于5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品混合物的色譜分離，得到了很好的分離效果，結(jié)果如圖3所示。

色譜條件：溶劑a為0.1％tfa水溶液，溶劑b為乙腈/0.1％tfa。流動(dòng)相梯度程序?yàn)?t表示時(shí)間(min))：t0，25％b；t15，70％b；流速為0.2ml/min，樣品：5種蛋白質(zhì)樣品(rnasea、cytochromec、bsa、myoglobin和carbonicanhydrase)；樣品進(jìn)樣量為20μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm。

實(shí)施例5

將十八烷基鍵合sio2＠sio2裝填于150mm×2.1mm(i.d.)的液相色譜柱中，然后將其用于胰蛋白酶酶解的牛血清蛋白(bsa)的酶解物色譜分離，得到了很好的分離效果，結(jié)果如圖4所示。

液相色譜條件：溶劑a為0.1％tfa水溶液，溶劑b為乙腈/0.1％tfa。流動(dòng)相梯度程序?yàn)?t表示時(shí)間(min))：t0，10％b；t90，90％b；t120，10％b。流速為0.2ml/min，樣品：3pmolbsa酶解物；樣品進(jìn)樣量為20μl。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜儀為德國(guó)布魯克公司的microtof-q質(zhì)譜儀；質(zhì)譜掃描模式：全掃描模式；掃描范圍m/z350-1500。

實(shí)施例6

將十八烷基鍵合sio2＠sio2裝填于50mm×4.6mm(i.d.)的液相色譜柱中，然后將其用于菲的保留分析，發(fā)現(xiàn)菲的容量因子k的lgk與流動(dòng)相中甲醇含量成正比，表明其在該色譜柱上的保留主要基于疏水作用，且其保留機(jī)理不同于蛋白質(zhì)等大分子樣品化合物的保留。

液相色譜條件：流動(dòng)相分別為90％甲醇，80％甲醇，70％甲醇，60％甲醇和50％甲醇；流速為0.2ml/min；樣品進(jìn)樣量為20μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。