本發(fā)明屬于天然藥物分離技術領域，具體涉及一種用于分離純化紫杉醇的氨基改性介孔二氧化硅的制備方法。

背景技術：

紫杉醇（Paclitaxel）是目前已發(fā)現(xiàn)天然抗癌藥物的重要代表，在臨床上已廣泛用于乳腺癌、卵巢癌和其他部位實體腫瘤的治療。1992年，美國FAD（食品和藥物管理局）批準紫杉醇上市，商品名Taxol，主要用于卵巢癌的治療。紫杉醇最初是由美國化學家Wani等于1971年從紅豆杉屬植物短葉紅豆杉樹皮中提取出來的一種二萜類化合物。全球范圍內，天然紅豆杉被認為是天然珍稀抗癌植物，種類和數(shù)量稀少，生長緩慢，植物體內藥用有效成分含量極低。在我國，許多地方在人工種植含量較高的雜交品種曼尼亞紅豆杉（Taxus media），以滿足市場需求。

介孔硅吸附材料是近些年來興起的受科研工作者青睞的一種材料。無機改性介孔材料是一種表面改性材料，由于其高比表面積和優(yōu)良的吸附性能，引起科學工作者的很大興趣。本申請采用普通球形二氧化硅作為支撐體，在其表面進行改性，制備表面介孔和氨基改性的二氧化硅，并可用于分離和純化紫杉醇。普通硅改性作為支撐體，使改性硅球具備良好的物理穩(wěn)定性，表面介孔結構使其具有高比表面積，表面氨基改性使其對紫杉醇具有良好的選擇性吸附能力。所以，本申請制備的一種氨基改性介孔二氧化硅可表現(xiàn)出良好的物理化學耐受力，使用壽命長，在合適的環(huán)境溫度下可重復使用等特點。在藥物分離純化，化學催化及生物科技等方面有著廣闊的應用前景。

在文獻或專利中已經多種純化分離紫杉醇的方法報道，如中國專利“申請?zhí)?01310251956.4、201410388561.3”都有采用硅膠、堿性氧化鋁柱層析或重結晶的手段來提取分離紫杉醇。據(jù)所查文獻，還未發(fā)現(xiàn)有專利和文獻與本發(fā)明相同。本發(fā)明的優(yōu)點：在球形二氧化硅的基底上，將功能化基團與介孔結構相結合，制備氨基改性介孔二氧化硅，它可用于柱層析技術上，將紫杉醇的純度提高近20倍，回收率達到80%以上，為紫杉醇工業(yè)化大規(guī)模生產提供一個方向。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決上述問題，提供一種用于分離純化紫杉醇的氨基改性介孔二氧化硅的制備方法。

一種用于分離純化紫杉醇的氨基改性介孔二氧化硅的制備方法，工藝過程包括以下步驟：

(1) 取10g球形二氧化硅（20-300目）加入到10-100mL Piranha溶液（過氧化氫：濃硫酸=3/7，v/v）中，加轉子攪拌，油浴120℃，60min。冷卻至室溫，用乙醇稀釋Piranha溶液（此時濃硫酸可能放熱），冷卻后過濾，用乙醇反復沖洗5-10遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，備用。

(2) 氮氣氣氛條件下，1.5-3.5mL含氨基的硅烷作為功能化試劑溶于10-100mL的無水乙醇，該混合溶液50℃攪拌1-6h，0.1-0.9g表面活性劑作為軟模板，取1.0g經活化的二氧化硅和0.5-2.5mL正硅酸乙酯或正硅酸甲酯或它們的混合物加入到體系中。1mol/L 的催化劑溶液3-7mL逐滴加入，氮氣氣氛條件下保持50℃攪拌1-2h，之后保持50℃放入搖床震蕩孵化1-12h。冷卻至室溫，過濾后由用無水乙醇浮選后，得大小均一的微球。

(3) 上一步得到的微球用去離子水、無水乙醇分別洗滌3-10次，以除去表面活性劑，洗滌后，后60℃下真空干燥6-12h得氨基改性的介孔二氧化硅。

(4)將所制備的氨基改性介孔硅球，裝載成一根小柱，干法上樣對紅豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）進行柱層析。利用乙醇/水梯度洗脫，收集不同流份，回收溶劑得固體。

所述含氨基的硅烷是3-氨丙基-三甲氧基硅烷，3-氨丙基-三乙氧基硅烷，N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷中的一種或它們的混合物。

所述表面活性劑是Pluronic F127、Pluronic P123、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）中的一種或它們的混合物。

上述所述催化劑是酸（鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸中的一種或它們的混合物），或堿（NH₄OH、三乙胺、NaOH中的一種或它們的混合物）。

上述制備的新型功能化二氧化硅材料，可應用于紫杉醇的分離純化。

本發(fā)明提供的方法制備的氨基改性介孔二氧化硅材料對紫杉醇表現(xiàn)出良好的選擇性吸附性能，經柱層析技術，浸膏樣品中的紫杉醇含量可大幅度提升。采用該方法制備的氨基改性介孔硅材料，原料成本廉價，制備工藝和分離目標物的工藝操作簡單，而且產率高，易于大規(guī)模地應用于工業(yè)生產。

具體實施方法

實施例1：

① 取10g球形二氧化硅（20目）加入到10 Piranha溶液（過氧化氫：濃硫酸=3/7，v/v）中，加轉子攪拌，油浴120℃，60min。冷卻至室溫，用乙醇稀釋Piranha溶液（此時濃硫酸可能放熱），冷卻后過濾，用乙醇反復沖洗5遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，備用。

② 氮氣氣氛條件下，功能化試劑(3-氨丙基-三乙氧基硅烷)1.5mL溶于10mL的無水乙醇，該混合溶液50℃攪拌1h。 0.1g表面活性劑Pluronic F127，1.0g經活化的二氧化硅，正硅酸乙酯（TEOS）0.5mL加入到體系中。1mol/L 的催化劑HCl3.0mL逐滴滴加，氮氣氣氛條件下保持50℃攪拌1h，之后保持50℃放入搖床震蕩孵化1h。冷卻至室溫，過濾后由無水乙醇浮選后，得大小均一的微球。

③ 上一步得到的微球用去離子水、無水乙醇分別3次洗滌，以除去Pluronic F127，過濾后真空干燥6h得氨基改性介孔二氧化硅。

④ 將所制備的氨基改性介孔硅球，裝載成一根小柱，干法上樣對紅豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）進行柱層析。利用乙醇/水梯度洗脫，收集不同流份，回收溶劑得固體，固體經HPLC檢測紫杉醇純度為9.0%，紫杉醇回收率為89%。

實施例2：

① 取10g球形二氧化硅（300目）加入到10 Piranha溶液（過氧化氫：濃硫酸=3/7，v/v）中，加轉子攪拌，油浴120℃，60min。冷卻至室溫，用乙醇稀釋Piranha溶液（此時濃硫酸可能放熱），冷卻后過濾，用乙醇反復沖洗10遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，備用。

②氮氣氣氛條件下，功能化試劑3-氨丙基-三乙氧基硅烷3.5mL溶于50mL的無水乙醇，該混合溶液50℃攪拌6h。0.59表面活性劑CTAB，1.0g經活化的二氧化硅，正硅酸乙酯（TEOS）2.5mL加入到體系中。1mol/L 的催化劑NH₄OH 7.0mL逐滴滴加，氮氣氣氛條件下保持50℃攪拌2h，之后保持50℃放入搖床震蕩孵化12h。冷卻至室溫，過濾后由無水乙醇浮選，得大小均一的微球。

③ 上一步得到微球用去離子水、無水乙醇分10次洗滌，以除去CTAB，過濾后60℃下真空干燥12h得氨基改性介孔二氧化硅。

④ 將所制備的改性介孔硅球，裝載成一根小柱，干法上樣對紅豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）進行柱層析。利用乙醇/水梯度洗脫，收集不同流份，回收溶劑得固體，固體經HPLC檢測紫杉醇純度為8.2%，紫杉醇回收率為92%。

實施例3：

① 取10g球形二氧化硅（200目）加入到50mL Piranha溶液（過氧化氫：濃硫酸=3/7，v/v）中，加轉子攪拌，油浴120℃，60min。冷卻至室溫，用乙醇稀釋Piranha溶液（此時濃硫酸可能放熱），冷卻后過濾，用乙醇反復沖洗8遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，備用。

②氮氣氣氛條件下，功能化試劑N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷2.5mL溶于50mL的無水乙醇，該混合溶液50℃攪拌6h。 0.5g表面活性劑PluronicF127，1.0g經活化的二氧化硅，正硅酸乙酯（TEOS）1.0mL加入到體系中。1mol/L 的催化劑HCl5.0mL逐滴滴加，氮氣氣氛條件下保持50℃攪拌2h，之后保持50℃放入搖床震蕩孵化7h。冷卻至室溫，過濾后由無水乙醇浮選后，得大小均一的微球。

③ 上一步得到的產物用去離子水、無水乙醇分5次洗滌，以除去PluronicF127，過濾后真空干燥12h得氨基改性介孔二氧化硅。

④ 將所制備的氨基改性介孔硅球，裝載成一根小柱，干法上樣對紅豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）進行柱層析。利用乙醇/水梯度洗脫，收集不同流份，回收溶劑得固體，固體經HPLC檢測紫杉醇純度為8.9%，紫杉醇回收率為80%。

實施例4：

① 取10g球形二氧化硅（180目）加入到60mL Piranha溶液（過氧化氫：濃硫酸=3/7，v/v）中，加轉子攪拌，油浴120℃，60min。冷卻至室溫，用乙醇稀釋Piranha溶液（此時濃硫酸可能放熱），冷卻后過濾，用乙醇反復沖洗7遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，備用。

②氮氣氣氛條件下，功能化試劑3-氨丙基-三乙氧基硅烷2.0mL溶于40mL的無水乙醇，該混合溶液50℃攪拌6h。 0.5g表面活性劑Pluronic P123/Pluronic F127混合物（1/1，g/g），1.0g經活化的二氧化硅，正硅酸乙酯/正硅酸甲酯的混合物（1/1，mL/mL）1.0mL加入到體系中。1mol/L 的催化劑三乙胺4.0mL逐滴滴加，氮氣氣氛條件下保持50℃攪拌2h，之后保持50℃放入搖床震蕩孵化12h。冷卻至室溫，過濾后由用無水乙醇浮選后，得大小均一的微球。

③ 上一步得到的微球用去離子水、無水乙醇分5次洗滌，以除去表面活性劑，過濾后真空干燥12h得氨基改性介孔二氧化硅。

④ 將所制備的氨基改性介孔硅球，裝載成一根小柱，干法上樣對紅豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）進行柱層析。利用乙醇/水梯度洗脫，收集不同流份，回收溶劑得固體，固體經HPLC檢測紫杉醇純度為8.8%，紫杉醇回收率為86%。

實施例5：

① 取10g球形二氧化硅（100目）加入到70mL Piranha溶液（過氧化氫：濃硫酸=3/7，v/v）中，加轉子攪拌，油浴120℃，60min。冷卻至室溫，用乙醇稀釋Piranha溶液（此時濃硫酸可能放熱），冷卻后過濾，用乙醇反復沖洗6遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，備用。

② 氮氣氣氛條件下，功能化試劑3-氨丙基-三乙氧基硅烷/3-氨丙基-三乙氧基硅烷混合物（1/1, v/v）2.0mL溶于50mL的無水乙醇，該混合溶液50℃攪拌6h。0.5g表面活性劑Pluronic F127，1.0g經活化的二氧化硅，正硅酸甲酯1.0mL加入到體系中。1mol/L 的催化劑HCl4.0mL逐滴滴加，氮氣氣氛條件下保持50℃攪拌12h。冷卻至室溫，過濾后由無水乙醇浮選后，得大小均一的微球。

③ 上一步得到的微球用去離子水、無水乙醇分8次洗滌，以除去Pluronic F127，過濾后真空干燥10h得氨基改性介孔二氧化硅。

④ 將所制備的改性介孔硅球，裝載成一根小柱，干法上樣對紅豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）進行柱層析。利用乙醇/水梯度洗脫，收集不同流份，回收溶劑得固體，固體經HPLC檢測紫杉醇純度為6.5%，紫杉醇回收率為94%。

實施例6：

① 取10g球形二氧化硅（120目）加入到80mL Piranha溶液（過氧化氫：濃硫酸=3/7，v/v）中，加轉子攪拌，油浴120℃，60min。冷卻至室溫，用乙醇稀釋Piranha溶液（此時濃硫酸可能放熱），冷卻后過濾，用乙醇反復沖洗9遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，備用。

② 氮氣氣氛條件下，功能化試3-氨丙基-三乙氧基硅烷劑2.5mL溶于100mL的無水乙醇，該混合溶液65℃攪拌6h。 0.5g表面活性劑F127，1.0g經活化的二氧化硅，正硅酸乙酯1.0mL加入到體系中。1mol/L 的催化劑硝酸3.0mL逐滴滴加，氮氣氣氛條件下保持65℃攪拌2h，之后保持65℃放入搖床震蕩孵化7h。冷卻至室溫，過濾后由用無水乙醇浮選后，得大小均一的微球。

③ 上一步得到的微球用去離子水、無水乙醇分別洗滌8次，以除去表面活性劑，洗滌后，后60℃下真空干燥8h得氨基改性的介孔二氧化硅。

④ 將所制備的改性介孔硅球，裝載成一根小柱，干法上樣對紅豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）進行柱層析。利用乙醇/水梯度洗脫，收集不同流份，回收溶劑得固體，固體經HPLC檢測紫杉醇純度為7.8%，，紫杉醇回收率為85%。。

實施例7：

① 取10g球形二氧化硅（120目）加入到80mL Piranha溶液（過氧化氫：濃硫酸=3/7，v/v）中，加轉子攪拌，油浴120℃，60min。冷卻至室溫，用乙醇稀釋Piranha溶液（此時濃硫酸可能放熱），冷卻后過濾，用乙醇反復沖洗9遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，備用。

② 氮氣氣氛條件下，功能化試3-氨丙基-三乙氧基硅烷劑2.5mL溶于50mL的乙腈，該混合溶液65℃攪拌6h。 0.5g表面活性劑Pluronic F127，1.0g經活化的二氧化硅，正硅酸乙酯（TEOS）1.0mL加入到體系中。1mol/L 的催化劑HCl和乙酸混合物（1/1，v/v）4.0mL逐滴滴加，氮氣氣氛條件下保持65℃攪拌2h，之后保持65℃放入搖床震蕩孵化12h。冷卻至室溫，過濾后由用無水乙醇浮選后，得大小均一的微球。

③ 上一步得到的微球用去離子水、無水乙醇分5次洗滌，以除去Pluronic F127，過濾后真空干燥12h得氨基改性介孔二氧化硅。

④ 將所制備的氨基改性介孔硅球，裝載成一根小柱，干法上樣對紅豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）進行柱層析。利用乙醇/水梯度洗脫，收集不同流份，回收溶劑得固體，固體經HPLC檢測紫杉醇純度為5.3%，紫杉醇回收率為91%。

實施例8：

① 取10g球形二氧化硅（120目）加入到80mL Piranha溶液（過氧化氫：濃硫酸=3/7，v/v）中，加轉子攪拌，油浴120℃，60min。冷卻至室溫，用乙醇稀釋Piranha溶液（此時濃硫酸可能放熱），冷卻后過濾，用乙醇反復沖洗9遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，備用。

②氮氣氣氛條件下，功能化試3-氨丙基-三乙氧基硅烷劑2.5mL溶于50mL的無水乙醇，該混合溶液50℃攪拌6h。0.5g表面活性劑F127，1.0g經活化的二氧化硅，正硅酸乙酯（TEOS）1.0mL加入到體系中。1mol/L 的催化劑NaOH4.0mL逐滴滴加，氮氣氣氛條件下保持50℃攪拌2h，之后裝入100mL聚四氟乙烯瓶中保持100℃放入搖床震蕩孵化12h。冷卻至室溫，過濾后由用無水乙醇浮選后，得大小均一的微球。

③ 上一步得到的微球用去離子水、無水乙醇分別洗滌6次，以除去表面活性劑，洗滌后，后60℃下真空干燥6h得氨基改性的介孔二氧化硅。

④ 將所制備的改性介孔硅球，裝載成一根小柱，干法上樣對紅豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）進行柱層析。利用乙醇/水梯度洗脫，收集不同流份，回收溶劑得固體，固體經HPLC檢測紫杉醇純度為6.3%，紫杉醇回收率為87%。

實施例9：

① 取10g球形二氧化硅（80目）加入到60mL Piranha溶液（過氧化氫：濃硫酸=3/7，v/v）中，加轉子攪拌，油浴120℃，60min。冷卻至室溫，用乙醇稀釋Piranha溶液（此時濃硫酸可能放熱），冷卻后過濾，用乙醇反復沖洗6遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，備用。

②氮氣氣氛條件下，功能化試劑3-氨丙基-三乙氧基硅烷2.0mL溶于40mL的無水乙醇，該混合溶液50℃攪拌6h。 0.5g表面活性劑Pluronic P123，1.0g經活化的二氧化硅，正硅酸乙酯/正硅酸甲酯的混合物（1/1，mL/mL）1.0mL加入到體系中。1mol/L 的催化劑NaOH/NH₄OH混合物（1/1, v/v）4.0mL逐滴滴加，氮氣氣氛條件下保持50℃攪拌2h，之后保持50℃放入搖床震蕩孵化12h。冷卻至室溫，過濾后由用無水乙醇浮選后，得大小均一的微球。

③ 上一步得到的微球用去離子水、無水乙醇分5次洗滌，以除去表面活性劑，過濾后真空干燥12h得氨基改性介孔二氧化硅。

④ 將所制備的氨基改性介孔硅球，裝載成一根小柱，干法上樣對紅豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）進行柱層析。利用乙醇/水梯度洗脫，收集不同流份，回收溶劑得固體，固體經HPLC檢測紫杉醇純度為8.1%，紫杉醇回收率為88%。