本發(fā)明涉及食品加工、天然藥物制藥領(lǐng)域，尤其涉及牡丹花粉的破壁方法。

背景技術(shù)：

牡丹(paeoniasuffrutcosa)屬于芍藥科（paeoniaceae）芍藥屬(paeonia)牡丹組(sect.moutan)，又名鹿韭、白術(shù)、木芍藥，為芍藥科芍藥屬的多年生落葉灌木(趙蘭勇《中國(guó)牡丹栽培與鑒賞》,2004,1-22)，在中國(guó)有2000多年的藥用歷史，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品；據(jù)《新修本草》記載:牡丹“生漢中，劍南所出者，苗似羊桃，夏生白花，秋實(shí)圓綠，冬實(shí)赤色，凌冬不凋，根似芍藥，肉白皮丹”;《名醫(yī)別錄》記載:“牡丹生巴郡山谷及漢中”，“今東間亦有”，說(shuō)明該植物原產(chǎn)于中國(guó)西部秦嶺和大巴山一帶山區(qū)；約于8世紀(jì)東傳日本，17世紀(jì)傳入歐洲，19世紀(jì)傳入美洲；國(guó)外也培育出了許多優(yōu)良品種，有的已被我國(guó)引進(jìn)（陳平平《中國(guó)牡丹的起源、演化與分類(lèi)·生物學(xué)通報(bào)》,1997,32(3):5-7）。中國(guó)是世界牡丹的發(fā)祥地和世界牡丹王國(guó)，全國(guó)各地均有種植，廣泛分布于河南洛陽(yáng)、山東菏澤、安徽銅陵、陜西漢中、河北柏山、四川、甘肅、浙江等地，以洛陽(yáng)、菏澤、安徽種植最多，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)牡丹的種植面積已達(dá)2萬(wàn)hm²（白喜婷,朱文學(xué),羅磊,等《牡丹籽油的精煉及理化特性變化分析·食品科學(xué)》,2008,29(8):351-354.）。特產(chǎn)于中國(guó)的芍藥屬牡丹組藥用植物共計(jì)有8個(gè)種，7個(gè)亞種（沈保安《中國(guó)芍藥屬牡丹組藥用植物的分類(lèi)鑒定研究與修訂·時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥》,2001,12(4):330-333）。中國(guó)牡丹園藝品種根據(jù)栽培地區(qū)和野生原種的不同，可分為4個(gè)牡丹品種群，即中原品種群、西北品種群、江南品種群和西南品種群，其中以中原牡丹品種群品種最多（何秀麗,鄭國(guó)生,王宗正《牡丹研究現(xiàn)狀與進(jìn)展·花卉園藝》,2006(2):8-9）。其根皮（牡丹皮）是中醫(yī)臨床常用中藥之一，在歷版《中華人民共和國(guó)藥典》中也均有收載，性微寒，味苦、辛，歸心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血，活血化瘀的功能，用于熱入營(yíng)血、溫毒發(fā)斑、吐血衄血、夜熱早涼、無(wú)汗骨蒸、經(jīng)閉痛經(jīng)、跌撲傷痛、臃腫瘡毒等癥（國(guó)家藥典委員會(huì)《牡丹皮·中華人民共和國(guó)藥典(一部)》,2015:172）。

牡丹花大色艷、雍容華貴、富麗端莊、芳香濃郁，具有和平、繁榮、吉祥、富貴的象征意義，而且品種繁多，素有“國(guó)色天香”、“花中之王”的美稱(chēng)，不僅是一種重要的觀(guān)賞植物，而且全身都是寶，除了其根和根皮的藥用價(jià)值外，牡丹的花、籽、花粉、葉都有著很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其中，牡丹花粉中富含有多種營(yíng)養(yǎng)素、維生素和礦物質(zhì)，其礦物質(zhì)含量雖然不高，但比較齊全。牡丹花粉中還含有大量天然活性物質(zhì)，包括80多種酶、黃酮類(lèi)化合物、激素、核酸和有機(jī)酸等。牡丹花粉中大量天然活性物質(zhì)是促進(jìn)健康、增加肌體防御能力的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。每顆花粉都是微型的“營(yíng)養(yǎng)庫(kù)”，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)35%，有20多種氨基酸，并且一半以上的氨基酸處于游離狀態(tài)，很容易被人體吸收（趙貴紅《牡丹花粉保健面條的研制·糧油加工》,2006,3:66-68）。這是目前任何一種天然食物所不能比擬的。目前牡丹花粉已被開(kāi)發(fā)成口服液(鄭愛(ài)霞,趙小強(qiáng),趙潛龍《牡丹花粉口服液及其制備方法·中國(guó)專(zhuān)利:cn200910117445.7》,2010-02-17)，以及作為保健面條（趙貴紅《牡丹花粉保健面條的研制·糧油加工》,2006,37（3）:66-68）、酸奶（趙貴紅《牡丹花粉山藥酸奶的研究·食品科技》，2008,2:43-45）、啤酒（趙貴紅《牡丹花粉蔬菜汁啤酒的研制·釀酒》，2005，32（5）：86-88）等的輔料。但未見(jiàn)牡丹花粉破壁的方法的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種工藝簡(jiǎn)單、活性物質(zhì)流失少的牡丹花粉的破壁方法。

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所述的牡丹花粉的破壁方法，其特征在于：該方法是指將牡丹花粉按厚度≤0.5cm均勻鋪設(shè)后覆蓋白布，并置于日光充足地方曬干或于40~50℃溫度下烘干，當(dāng)花粉中水分≤5%時(shí)經(jīng)七號(hào)篩除雜，即得精選的牡丹花粉；所述精選的牡丹花粉經(jīng)溫差破壁法或超微粉碎法，即得破壁牡丹花粉成品。

所述牡丹花粉為丹鳳牡丹（paeoniaostiit.hongetj.x.zhang）或紫斑牡丹[paeoniarockii（s.g.haw.et.laeuner）t.hanget.t.j.li]的花粉。

所述溫差破壁法是指將精選的牡丹花粉裝入密閉容器內(nèi)，經(jīng)冷凍后，按冷凍后牡丹花粉體積的20倍迅速加入沸水，搖勻，置20℃水浴中以550~650rpm的速率攪拌7h，得到花粉混合溶液；所述花粉混合溶液以3000~3500rpm的速率離心8min~10min，得到固體物質(zhì)，該固體物質(zhì)于25℃~35℃干燥6~10h后，經(jīng)滅菌處理即得破壁牡丹花粉成品。

所述冷凍條件是指溫度為-150℃，冷凍時(shí)間為20~32h。

所述超微粉碎法是指將精選的牡丹花粉裝入低溫細(xì)胞壁破壁超微粉碎機(jī)料斗中，啟動(dòng)儀器粉碎20~25min，取出，經(jīng)滅菌處理即得破壁牡丹花粉成品。

所述滅菌條件是指45℃微波處理30min。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、花粉是植物生命的精華，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值，富含蛋白質(zhì)、脂肪酸、黃酮等多種活性成分。在花粉的利用過(guò)程中，由于其外部有一層堅(jiān)硬的孢子壁，阻礙了內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶出，本發(fā)明對(duì)牡丹花粉進(jìn)行破壁處理有利于活性物質(zhì)的釋放，提高生物利用率。

2、本發(fā)明牡丹花粉在破壁前后主要營(yíng)養(yǎng)成分（氨基酸、脂肪酸）的含量指標(biāo)：

2.1牡丹花粉中的脂肪酸類(lèi)成分分析

2.1.1溶液的制備

混合對(duì)照品溶液：精密量取32種脂肪酸甲酯混合對(duì)照品（sigma-aldrich公司提供，批號(hào)：18919-1amp，供脂肪酸鑒別和含量測(cè)定用）76.1mg，置10ml容量瓶中，加入正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得脂肪酸甲酯混合對(duì)照品溶液，冰箱冷藏備用。

供試品溶液：取牡丹花粉（花粉采集于蘭州中川牡丹園，原植物經(jīng)蘭州中川牡丹產(chǎn)業(yè)有限公司趙潛龍高級(jí)工程師鑒定為毛茛科芍藥屬植物紫斑牡丹[paeoniarockii（s.g.haw.et.laeuner）t.hanget.t.j.li]）約1g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加環(huán)己烷50ml，超聲（功率：500w，頻率：28khz）30min，放冷，搖勻，濾過(guò)，減壓回收溶劑至干；加入0.5mol·l^-1氫氧化鈉甲醇溶液1ml，置60℃水浴皂化反應(yīng)30min至油滴消失；冷卻后加入bf3-甲醇（14%）溶液1ml，于60℃水浴加熱反應(yīng)15min，取出，冷卻后，精密加入正己烷2ml及異辛烷5ml，充分振搖，加飽和氯化鈉溶液10ml，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，分取上層異辛烷溶液，作為供試品溶液，備用。

2.1.2色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：采用agilent7890b/7000cgc-ms-ms型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配置有7693型自動(dòng)進(jìn)樣器)，色譜柱：hp-5ms石英毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mm，0.25μm）；程序升溫：起始溫度50℃，以8℃·min^-1升至155℃，保持2min；再以10℃·min^-1升至175℃，保持2min；以1.3℃·min^-1升至190℃，保持8min；最后以6℃·min^-1升至280℃，保持5min。掃描模式：scan，sim；進(jìn)樣口溫度：260℃；載氣：氦氣，純度99.99%；不分流進(jìn)樣；流速：1.0ml·min^-1；進(jìn)樣量：1μl。在上述色譜條件下，混合對(duì)照品溶液與花粉樣品中脂肪酸成分總離子流見(jiàn)圖1、圖2（色譜峰編號(hào)與表1中編號(hào)一致）。根據(jù)各色譜峰的保留時(shí)間及相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)合nist譜庫(kù)的檢索結(jié)果，并與混合對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，對(duì)樣品中的脂肪酸組分進(jìn)行定性鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（ei），離子源溫度230℃，電子能量70ev，質(zhì)量掃描范圍m/z40~400amu，溶劑延遲4.0min。

表1紫斑牡丹花粉中脂肪酸成分的定性結(jié)果

注：“*”紫斑牡丹花粉樣品中測(cè)得的脂肪酸。

2.1.3線(xiàn)性關(guān)系的考察

分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加正己烷配制成濃度為2、4、5、6、9、10、15μg·ml^-1系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下所述條件分別進(jìn)樣1μl，進(jìn)行g(shù)c-ms/sim分析，以脂肪酸甲酯對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（x，μg·ml^-1）為橫坐標(biāo)，峰面積平均值（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，32個(gè)被測(cè)脂肪酸甲酯化成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好線(xiàn)性關(guān)系（r=0.9871~0.9976)。

表232種脂肪酸的線(xiàn)性關(guān)系考察結(jié)果

2.1.4樣品測(cè)定取紫斑牡丹花粉樣品按“2.1.1”項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，依“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，5批樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3紫斑牡丹花粉中脂肪酸含量測(cè)定結(jié)果（μg·mg^-1）

2.1.5結(jié)果

本發(fā)明采用gc-ms-sim法分析紫斑牡丹花粉脂肪酸含量，該方法分析速度快，專(zhuān)屬性好，靈敏度高，操作簡(jiǎn)便。分析結(jié)果表明，甘肅紫斑牡丹花粉中主要含有c6~c24的18種脂肪酸，總量在7.49~8.67μg·mg^-1之間，其中辛酸、十四烷酸、十六烷酸、油酸、亞油酸、亞麻酸含量較高；紫斑牡丹花粉中的脂肪酸以不飽和脂肪酸為主，不飽和脂肪酸占脂肪酸總量的50.46%~60.96%。

本發(fā)明對(duì)破壁紫斑牡丹花粉中的脂肪酸進(jìn)行分析，結(jié)果表明，破壁的紫斑牡丹花粉中脂肪酸類(lèi)化合物的含量明顯高于不破壁的花粉，破壁的紫斑牡丹花粉中脂肪酸總量是未破壁樣品的6~7倍，其中亞油酸、γ-亞麻酸、油酸、十六烷酸的提取分別增高了15、11.6、1.7、8.5倍。由此可見(jiàn)，紫斑牡丹花粉的破壁，更有利于脂肪酸類(lèi)成分的溶出與提取，這為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用紫斑牡丹花粉提供了技術(shù)支撐。

2.2牡丹花粉氨基酸的含量測(cè)定

2.2.1溶液的制備混合對(duì)照品溶液：精密量取混合氨基酸對(duì)照品（由sigma-aldrich公司提供，批號(hào)：slbm6769v，供氨基酸鑒別和含量測(cè)定用，包括ala、arg、asp、cys、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro，ser、thr、tyr、val）適量，加稀釋液制成濃度為50nmol·l^-1(胱氨酸)和100nmol·l^-1(其余16種氨基酸)的混合對(duì)照品溶液，4℃保存。

緩沖液a：稱(chēng)取檸檬酸三鈉11.8g、檸檬酸6g，加適量水溶解，再加乙醇65ml和濃鹽酸5.6ml，然后用水稀釋至1l（調(diào)ph至3.45），并用0.45μm濾膜過(guò)濾。

緩沖液b：稱(chēng)取檸檬酸三鈉19.6g、氫氧化鈉3.1g、硼酸5.0g，加適量水溶解，稀釋至1l（調(diào)ph至10.85），并用0.45μm濾膜過(guò)濾。

再生液c：稱(chēng)取氫氧化鈉20.0g、edta0.2g，用水溶解，稀釋至1l，并用0.45μm濾膜過(guò)濾。

樣品稀釋液：稱(chēng)取檸檬酸三鈉11.8g、濃鹽酸10.4ml，用水稀至1l（調(diào)ph至2.20），并用0.45μm濾膜過(guò)濾。

茚三酮衍生化試劑：稱(chēng)取茚三酮20g、苯酚2g、用400ml鉀鈉緩沖液和600ml甲醇溶解，并用0.45μm濾膜過(guò)濾。

供試品溶液：精密稱(chēng)取樣品粉末0.2g，置于水解管中，加6mol·l^-1鹽酸10ml，加入新蒸餾的苯酚3滴；將水解管置于-18℃冰箱中冷凍5min后，通氮?dú)夥饪冢?10℃烘箱內(nèi)水解22h，取出放冷至室溫，打開(kāi)水解管，將水解液過(guò)濾后，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移至250ml容量瓶?jī)?nèi)用去離子水定容；吸取上述溶液1ml于10ml燒杯內(nèi)，蒸干，殘留物用1ml水溶解，再干燥，反復(fù)進(jìn)行兩次。將殘?jiān)?ml樣品稀釋液溶解至離心管中，10000r·min^-1離心10min，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.2色譜條件采用德國(guó)sykam公司s-433d氨基酸全自動(dòng)分析儀(含s7130溶劑存放單元、s5200全自動(dòng)進(jìn)樣器、s4300氨基酸反應(yīng)模塊、s2100梯度泵)，色譜柱：磺酸基強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂lcak06/na，（4.6mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相：緩沖液a、緩沖液b、再生液c；茚三酮為衍生化試劑。檢測(cè)波長(zhǎng)440nm（脯氨酸）和570nm（其余氨基酸）；進(jìn)樣量：50μl；流速：a泵（洗脫泵）0.45ml·min^-1，m泵（衍生泵）0.25ml·min^-1，梯度洗脫程序見(jiàn)表4。分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各50μl，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：選擇2個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)440nm(脯氨酸)和570nm(其余氨基酸)，混合對(duì)照品和樣品中的氨基酸得到了很好的分離，色譜圖見(jiàn)圖3、圖4。

表4梯度洗脫程序

2.2.3線(xiàn)性關(guān)系考察分別精密吸取氨基酸混合對(duì)照品溶液配制成濃度分別為20、40、80、160、200nmol·l^-1的系列對(duì)照品溶液，按上述色譜條件注入氨基酸分析儀，測(cè)定峰面積，以峰面積y對(duì)氨基酸濃度x(μg·ml^-1)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程見(jiàn)表5。

表517種氨基酸的線(xiàn)性關(guān)系

2.2.4樣品測(cè)定精密稱(chēng)取破壁前后紫斑牡丹花粉樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制樣3份，按上述色譜條件，分別精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各50μl進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果表明，破壁前紫斑牡丹花粉中平均總氨基酸含量為31.67%，破壁紫斑牡丹花粉中平均總氨基酸含量為33.05%，見(jiàn)表6。

表6紫斑牡丹花粉中水解氨基酸的測(cè)定結(jié)果(%，n=3)

注:*代表必需氨基酸。

2.2.5結(jié)果

本發(fā)明將樣品酸水解處理，采用柱后衍生陽(yáng)離子交換色譜法，建立的測(cè)定甘肅紫斑牡丹花粉中17種氨基酸的方法，具有操作方便、快捷、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。分析結(jié)果表明：紫斑牡丹花粉中，含有人體必須氨基酸總含量達(dá)130.6mg·g-1，營(yíng)養(yǎng)豐富，值得深入開(kāi)發(fā)和利用。

本發(fā)明通過(guò)對(duì)紫斑牡丹花粉破壁前后水解氨基酸的含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)花粉破壁前后氨基酸的總量及各氨基酸含量沒(méi)有顯著性差異，究其原因可能與它們均經(jīng)過(guò)水解且都水解的比較徹底有關(guān)。另外也說(shuō)明破壁花粉的活性物質(zhì)流失少。

3、本發(fā)明所獲得的牡丹破壁花粉具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值，且獲得的牡丹花粉破壁產(chǎn)品更利于人體吸收，可制成膠囊劑、片劑、顆粒劑、口服液等劑型及其復(fù)方制劑。

4、本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、成本低、易操作，破壁效率高，純度高，具有很好的市場(chǎng)前景和利潤(rùn)空間。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

圖1為本發(fā)明紫斑牡丹花粉32種脂肪酸甲酯混合對(duì)照品總離子流色譜圖。

圖2為本發(fā)明紫斑牡丹花粉中脂肪酸甲酯總離子流色譜圖。

圖3為本發(fā)明混合對(duì)照品色譜圖。圖中1.天冬氨酸(asp)；2.蘇氨酸(thr)；3.絲氨酸(ser)；4.谷氨酸(glu)；5.甘氨酸(gly)；6.丙氨酸(ala)；7.纈氨酸(val)；8.蛋氨酸(met)；9.胱氨酸(cys)；10.異亮氨酸(ile)；11.亮氨酸(leu)；12.酪氨酸(tyr)；13.苯丙氨酸(phe)；14.組氨酸(his)；15.賴(lài)氨酸(lys)；16.精氨酸(arg)；17.脯氨酸(pro)。

圖4為本發(fā)明紫斑牡丹花粉樣品色譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1牡丹花粉的破壁方法，該方法是指將牡丹花粉200g按厚度≤0.5cm均勻鋪設(shè)在白色瓷盤(pán)上面后覆蓋白布，并置于日光充足地方曬干或于40~50℃溫度下烘干，當(dāng)花粉中水分≤5%時(shí)經(jīng)七號(hào)篩除雜，即得精選的牡丹花粉；將精選的牡丹花粉裝入密閉容器（塑料容器中并加蓋密封）內(nèi)，并置于日本三洋mdf-c2156van低溫冷凍存儲(chǔ)箱中經(jīng)-150℃冷凍冷凍20~32h后，按冷凍后牡丹花粉體積的20倍迅速加入沸水，搖勻，置20℃水浴中以550~650rpm的速率攪拌7h，得到花粉混合溶液；花粉混合溶液在深圳市優(yōu)米儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)的gl21m立式高速冷凍離心機(jī)中以3000~3500rpm的速率離心8min~10min，得到固體物質(zhì)，該固體物質(zhì)于25℃~35℃干燥6~10h后，經(jīng)45℃微波滅菌處理30min即得破壁牡丹花粉成品（破壁率大于92%）。

實(shí)施例2牡丹花粉的破壁方法，該方法是指將牡丹花粉200g按厚度≤0.5cm均勻鋪設(shè)在白色瓷盤(pán)上面后覆蓋白布，并置于日光充足地方曬干或于40~50℃溫度下烘干，當(dāng)花粉中水分≤5%時(shí)經(jīng)七號(hào)篩除雜，即得精選的牡丹花粉；將精選的牡丹花粉裝入濟(jì)南龍威制藥設(shè)備有限公司生產(chǎn)的lwf6-tbi低溫細(xì)胞壁破壁超微粉粹機(jī)料斗中，啟動(dòng)儀器粉碎20~25min，取出，經(jīng)45℃微波滅菌處理30min即得破壁牡丹花粉成品（破壁率大于97%）。

上述實(shí)施例1~2中，牡丹花粉為丹鳳牡丹（paeoniaostiit.hongetj.x.zhang）或紫斑牡丹[paeoniarockii（s.g.haw.et.laeuner）t.hanget.t.j.li]的花粉。