技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大豆異黃酮分離純化用大孔吸附樹脂的制備方法。
背景技術(shù)：
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天然存在的大豆異黃酮共有12種，分為大豆苷、染料木苷和黃豆黃素苷3大類。大豆異黃酮具有抗氧化、預(yù)防癌癥、增強(qiáng)免疫力及改善動物生產(chǎn)性能等功能，已被廣泛應(yīng)用于生物、飼料、醫(yī)藥和食品保健等領(lǐng)域中。研究發(fā)現(xiàn)，只有游離型的苷元才具有生物學(xué)活性，需經(jīng)酶解或酸水解糖苷轉(zhuǎn)化成游離型的苷元才能被動物或人體所吸收。目前，提高大豆異黃酮中苷元含量的方法主要有浸提法、物理輔助法、高壓濕法和超濾法等，但這些方法存在工藝較復(fù)雜、成本較高和有機(jī)溶劑殘留量高等缺點(diǎn)，不適于批量化制備。
大孔吸附樹脂法是近年來使用廣泛的一種純化方法，相對其他純化方法具有選擇性好、無毒和無污染等優(yōu)點(diǎn)，但目前使用的大孔吸附樹脂的吸附量較低，且解吸時(shí)需要大量有機(jī)溶劑沖洗，即使這些有機(jī)溶劑能被回收再利用，也需要消耗大量能量來實(shí)現(xiàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種吸附量高、解吸容易且苷元含量高的大豆異黃酮分離純化用大孔吸附樹脂的制備方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題采用以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
一種大豆異黃酮分離純化用大孔吸附樹脂的制備方法，其制備方法包括如下步驟：
(1)大孔吸附樹脂的制備：向水中按比例加入苯乙烯、氫化松香丙烯酸丙三醇酯、甲基丙烯酸羥乙酯、納米致孔劑和引發(fā)劑，充分混合后于超聲頻率40khz、輸出功率200w下超聲處理15min，再于微波頻率2450mhz、輸出功率700w下微波處理10min，并于0-5℃環(huán)境中靜置30min，混合均勻后繼續(xù)微波處理10min，然后于-5-0℃環(huán)境中靜置15min，混合均勻后再次微波處理10min，所得混合液以5℃/min的降溫速度降溫至0-5℃保溫混合1h，隨后將混合液固液分離，所得固相用35-40℃溫水水洗三次得到白球，最后將白球于60-65℃下真空干燥，即得大孔吸附樹脂；
(2)大孔吸附樹脂的預(yù)處理：向上述所制大孔吸附樹脂中加入泊洛沙姆、n-羥甲基丙烯酰胺和水解聚馬來酸酐，并以5℃/min的升溫速度升溫至65-70℃保溫混合30min，再向所得混合物中加入3倍重量30-35℃水，繼續(xù)以5℃/min的升溫速度升溫至回流狀態(tài)保溫混合15min，然后自然冷卻至室溫，過濾，所得樹脂球體水洗三次，最后于60-65℃下真空干燥；
(3)大孔吸附樹脂的改性：向異氰尿酸三縮水甘油酯中加入納米二氧化鈦和衣康酸酐，以5℃/min的升溫速度升溫至115-120℃保溫混合15min，再加入經(jīng)預(yù)處理后的大孔吸附樹脂，繼續(xù)在115-120℃保溫混合30min，待自然冷卻至室溫后水洗三次，最后經(jīng)所得樹脂球體于60-65℃下真空干燥。
所述步驟(1)中水、苯乙烯、氫化松香丙烯酸丙三醇酯、甲基丙烯酸羥乙酯、納米致孔劑和引發(fā)劑的質(zhì)量比為300-400:45-50:30-35:15-20:40-45:0.5-1。
所述步驟(2)中大孔吸附樹脂、泊洛沙姆、n-羥甲基丙烯酰胺和水解聚馬來酸酐的質(zhì)量比為60-65:1-2:0.5-1:0.5-1。
所述步驟(3)中大孔吸附樹脂、異氰尿酸三縮水甘油酯、納米二氧化鈦和衣康酸酐的質(zhì)量比為60-65:5-10:3-5:0.1-0.2。
所述納米致孔劑由如下重量份數(shù)的原料制成：微晶纖維素5-10份、多聚谷氨酸3-5份、氫化蓖麻油1-2份、聚二甲基二烯丙基氯化銨0.5-1份、葡萄糖酸鈉0.5-1份、二茂鐵0.05-0.1份、水30-50份，其制備方法為：向水中加入微晶纖維素和氫化蓖麻油，并升溫至回流狀態(tài)保溫混合15min，待自然冷卻至40-45℃后加入多聚谷氨酸和聚二甲基二烯丙基氯化銨，攪拌30min形成乳液，然后加入葡萄糖酸鈉和二茂鐵，混合均勻后將所得混合物送入噴霧干燥機(jī)中，干燥所得顆粒經(jīng)研磨制成納米粉末，最后將納米粉末加水制成固含量30-35wt％的乳液，即得納米致孔劑。
所述納米二氧化鈦是由二氧化鈦經(jīng)改性處理后制成的納米粉體，其制備方法為：向二氧化鈦中加入交聯(lián)聚維酮和六羥甲基三聚氰胺六甲醚，先以5℃/min的升溫速度升溫至120-125℃保溫混合30min，再加入陰離子聚丙烯酰胺和環(huán)氧大豆油，繼續(xù)在120-125℃下保溫混合30min，所得混合物以10℃/min的降溫速度降溫至40-50℃，并加入40-50℃水，以10℃/min的升溫速度升溫至回流狀態(tài)保溫混合10min，經(jīng)自然冷卻至室溫后靜置1h，過濾，所得固體于75-80℃下烘干，最后送入納米研磨機(jī)中，經(jīng)研磨得到納米二氧化鈦。
所述二氧化鈦、交聯(lián)聚維酮、六羥甲基三聚氰胺六甲醚、陰離子聚丙烯酰胺、環(huán)氧大豆油和水的質(zhì)量比為30-40:3-5:0.5-1:2-3:0.1-0.3:100-150。
本發(fā)明的有益效果是：
(1)在大孔吸附樹脂的制備階段采用三步微波處理法協(xié)以降溫操作，在縮短制備時(shí)間的同時(shí)提高大孔吸附樹脂的耐高低溫性；
(2)通過水溶性的泊洛沙姆、n-羥甲基丙烯酰胺和水解聚馬來酸酐的預(yù)處理，降低大孔吸附樹脂的表面張力，增加大孔吸附樹脂的表面活性，以利于下步的改性處理；
(3)利用異氰尿酸三縮水甘油酯、納米二氧化鈦和衣康酸酐對大孔吸附樹脂進(jìn)行改性處理，增大其比表面積，增強(qiáng)其吸附活性；
(4)所制大孔吸附樹脂對大豆異黃酮的吸附量達(dá)到17mg/g以上，經(jīng)60％甲醇溶液沖洗后能實(shí)現(xiàn)大豆異黃酮的高效解吸，解吸率達(dá)到98.5％以上，所制大豆異黃酮的純度達(dá)到60％以上，因此該大孔吸附樹脂適用于大豆異黃酮的高效分離。
具體實(shí)施方式：
為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例1
(1)大孔吸附樹脂的制備：向350份水中按比例加入45份苯乙烯、30份氫化松香丙烯酸丙三醇酯、15份甲基丙烯酸羥乙酯、40份納米致孔劑和0.5份引發(fā)劑，充分混合后于超聲頻率40khz、輸出功率200w下超聲處理15min，再于微波頻率2450mhz、輸出功率700w下微波處理10min，并于0-5℃環(huán)境中靜置30min，混合均勻后繼續(xù)微波處理10min，然后于-5-0℃環(huán)境中靜置15min，混合均勻后再次微波處理10min，所得混合液以5℃/min的降溫速度降溫至0-5℃保溫混合1h，隨后將混合液固液分離，所得固相用35-40℃溫水水洗三次得到白球，最后將白球于60-65℃下真空干燥，即得大孔吸附樹脂；
(2)大孔吸附樹脂的預(yù)處理：向上述所制60份大孔吸附樹脂中加入2份泊洛沙姆、0.5份n-羥甲基丙烯酰胺和1份水解聚馬來酸酐，并以5℃/min的升溫速度升溫至65-70℃保溫混合30min，再向所得混合物中加入3倍重量30-35℃水，繼續(xù)以5℃/min的升溫速度升溫至回流狀態(tài)保溫混合15min，然后自然冷卻至室溫，過濾，所得樹脂球體水洗三次，最后于60-65℃下真空干燥；
(3)大孔吸附樹脂的改性：向10份異氰尿酸三縮水甘油酯中加入3份納米二氧化鈦和0.15份衣康酸酐，以5℃/min的升溫速度升溫至115-120℃保溫混合15min，再加入經(jīng)預(yù)處理后的60份大孔吸附樹脂，繼續(xù)在115-120℃保溫混合30min，待自然冷卻至室溫后水洗三次，最后經(jīng)所得樹脂球體于60-65℃下真空干燥。
納米致孔劑的制備：向50份水中加入5份微晶纖維素和1份氫化蓖麻油，并升溫至回流狀態(tài)保溫混合15min，待自然冷卻至40-45℃后加入5份多聚谷氨酸和0.5份聚二甲基二烯丙基氯化銨，攪拌30min形成乳液，然后加入0.5份葡萄糖酸鈉和0.05份二茂鐵，混合均勻后將所得混合物送入噴霧干燥機(jī)中，干燥所得顆粒經(jīng)研磨制成納米粉末，最后將納米粉末加水制成固含量30-35wt％的乳液，即得納米致孔劑。
納米二氧化鈦的制備：向40份二氧化鈦中加入3份交聯(lián)聚維酮和0.5份六羥甲基三聚氰胺六甲醚，先以5℃/min的升溫速度升溫至120-125℃保溫混合30min，再加入3份陰離子聚丙烯酰胺和0.2份環(huán)氧大豆油，繼續(xù)在120-125℃下保溫混合30min，所得混合物以10℃/min的降溫速度降溫至40-50℃，并加入40-50℃150份水，以10℃/min的升溫速度升溫至回流狀態(tài)保溫混合10min，經(jīng)自然冷卻至室溫后靜置1h，過濾，所得固體于75-80℃下烘干，最后送入納米研磨機(jī)中，經(jīng)研磨得到納米二氧化鈦。
實(shí)施例2
(1)大孔吸附樹脂的制備：向350份水中按比例加入50份苯乙烯、35份氫化松香丙烯酸丙三醇酯、15份甲基丙烯酸羥乙酯、40份納米致孔劑和0.5份引發(fā)劑，充分混合后于超聲頻率40khz、輸出功率200w下超聲處理15min，再于微波頻率2450mhz、輸出功率700w下微波處理10min，并于0-5℃環(huán)境中靜置30min，混合均勻后繼續(xù)微波處理10min，然后于-5-0℃環(huán)境中靜置15min，混合均勻后再次微波處理10min，所得混合液以5℃/min的降溫速度降溫至0-5℃保溫混合1h，隨后將混合液固液分離，所得固相用35-40℃溫水水洗三次得到白球，最后將白球于60-65℃下真空干燥，即得大孔吸附樹脂；
(2)大孔吸附樹脂的預(yù)處理：向上述所制65份大孔吸附樹脂中加入2份泊洛沙姆、1份n-羥甲基丙烯酰胺和0.5份水解聚馬來酸酐，并以5℃/min的升溫速度升溫至65-70℃保溫混合30min，再向所得混合物中加入3倍重量30-35℃水，繼續(xù)以5℃/min的升溫速度升溫至回流狀態(tài)保溫混合15min，然后自然冷卻至室溫，過濾，所得樹脂球體水洗三次，最后于60-65℃下真空干燥
(3)大孔吸附樹脂的改性：向10份異氰尿酸三縮水甘油酯中加入5份納米二氧化鈦和0.15份衣康酸酐，以5℃/min的升溫速度升溫至115-120℃保溫混合15min，再加入經(jīng)預(yù)處理后的65份大孔吸附樹脂，繼續(xù)在115-120℃保溫混合30min，待自然冷卻至室溫后水洗三次，最后經(jīng)所得樹脂球體于60-65℃下真空干燥。
納米致孔劑的制備：向50份水中加入10份微晶纖維素和2份氫化蓖麻油，并升溫至回流狀態(tài)保溫混合15min，待自然冷卻至40-45℃后加入5份多聚谷氨酸和0.5份聚二甲基二烯丙基氯化銨，攪拌30min形成乳液，然后加入0.5份葡萄糖酸鈉和0.05份二茂鐵，混合均勻后將所得混合物送入噴霧干燥機(jī)中，干燥所得顆粒經(jīng)研磨制成納米粉末，最后將納米粉末加水制成固含量30-35wt％的乳液，即得納米致孔劑。
納米二氧化鈦的制備：向40份二氧化鈦中加入5份交聯(lián)聚維酮和0.5份六羥甲基三聚氰胺六甲醚，先以5℃/min的升溫速度升溫至120-125℃保溫混合30min，再加入2份陰離子聚丙烯酰胺和0.2份環(huán)氧大豆油，繼續(xù)在120-125℃下保溫混合30min，所得混合物以10℃/min的降溫速度降溫至40-50℃，并加入40-50℃150份水，以10℃/min的升溫速度升溫至回流狀態(tài)保溫混合10min，經(jīng)自然冷卻至室溫后靜置1h，過濾，所得固體于75-80℃下烘干，最后送入納米研磨機(jī)中，經(jīng)研磨得到納米二氧化鈦。
實(shí)施例3
(1)大孔吸附樹脂的制備：向350份水中按比例加入50份苯乙烯、35份氫化松香丙烯酸丙三醇酯、15份甲基丙烯酸羥乙酯、40份納米致孔劑和0.5份引發(fā)劑，充分混合后于超聲頻率40khz、輸出功率200w下超聲處理15min，再于微波頻率2450mhz、輸出功率700w下微波處理10min，并于0-5℃環(huán)境中靜置30min，混合均勻后繼續(xù)微波處理10min，然后于-5-0℃環(huán)境中靜置15min，混合均勻后再次微波處理10min，所得混合液以5℃/min的降溫速度降溫至0-5℃保溫混合1h，隨后將混合液固液分離，所得固相用35-40℃溫水水洗三次得到白球，最后將白球于60-65℃下真空干燥，即得大孔吸附樹脂；
(4)大孔吸附樹脂的預(yù)處理：向上述所制65份大孔吸附樹脂中加入2份泊洛沙姆、1份n-羥甲基丙烯酰胺和0.5份水解聚馬來酸酐，并以5℃/min的升溫速度升溫至65-70℃保溫混合30min，再向所得混合物中加入3倍重量30-35℃水，繼續(xù)以5℃/min的升溫速度升溫至回流狀態(tài)保溫混合15min，然后自然冷卻至室溫，過濾，所得樹脂球體水洗三次，最后于60-65℃下真空干燥
(5)大孔吸附樹脂的改性：向10份異氰尿酸三縮水甘油酯中加入5份納米二氧化鈦和0.15份衣康酸酐，以5℃/min的升溫速度升溫至115-120℃保溫混合15min，再加入經(jīng)預(yù)處理后的65份大孔吸附樹脂，繼續(xù)在115-120℃保溫混合30min，待自然冷卻至室溫后水洗三次，最后經(jīng)所得樹脂球體于60-65℃下真空干燥。
納米致孔劑的制備：向50份水中加入10份微晶纖維素和2份氫化蓖麻油，并升溫至回流狀態(tài)保溫混合15min，待自然冷卻至40-45℃后加入5份多聚谷氨酸和0.5份聚二甲基二烯丙基氯化銨，攪拌30min形成乳液，然后加入0.5份葡萄糖酸鈉和0.05份二茂鐵，混合均勻后將所得混合物送入噴霧干燥機(jī)中，干燥所得顆粒經(jīng)研磨制成納米粉末，最后將納米粉末加水制成固含量30-35wt％的乳液，即得納米致孔劑。
對照例1
(1)大孔吸附樹脂的制備：向350份水中按比例加入50份苯乙烯、35份氫化松香丙烯酸丙三醇酯、15份甲基丙烯酸羥乙酯、40份異辛烷和0.5份引發(fā)劑，充分混合后于超聲頻率40khz、輸出功率200w下超聲處理15min，再于微波頻率2450mhz、輸出功率700w下微波處理10min，并于0-5℃環(huán)境中靜置30min，混合均勻后繼續(xù)微波處理10min，然后于-5-0℃環(huán)境中靜置15min，混合均勻后再次微波處理10min，所得混合液以5℃/min的降溫速度降溫至0-5℃保溫混合1h，隨后將混合液固液分離，所得固相用35-40℃溫水水洗三次得到白球，最后將白球于60-65℃下真空干燥，即得大孔吸附樹脂；
(2)大孔吸附樹脂的預(yù)處理：向上述所制65份大孔吸附樹脂中加入2份泊洛沙姆、1份n-羥甲基丙烯酰胺和0.5份水解聚馬來酸酐，并以5℃/min的升溫速度升溫至65-70℃保溫混合30min，再向所得混合物中加入3倍重量30-35℃水，繼續(xù)以5℃/min的升溫速度升溫至回流狀態(tài)保溫混合15min，然后自然冷卻至室溫，過濾，所得樹脂球體水洗三次，最后于60-65℃下真空干燥
(3)大孔吸附樹脂的改性：向10份異氰尿酸三縮水甘油酯中加入5份納米二氧化鈦和0.15份衣康酸酐，以5℃/min的升溫速度升溫至115-120℃保溫混合15min，再加入經(jīng)預(yù)處理后的65份大孔吸附樹脂，繼續(xù)在115-120℃保溫混合30min，待自然冷卻至室溫后水洗三次，最后經(jīng)所得樹脂球體于60-65℃下真空干燥。
納米二氧化鈦的制備：向40份二氧化鈦中加入5份交聯(lián)聚維酮和0.5份六羥甲基三聚氰胺六甲醚，先以5℃/min的升溫速度升溫至120-125℃保溫混合30min，再加入2份陰離子聚丙烯酰胺和0.2份環(huán)氧大豆油，繼續(xù)在120-125℃下保溫混合30min，所得混合物以10℃/min的降溫速度降溫至40-50℃，并加入40-50℃150份水，以10℃/min的升溫速度升溫至回流狀態(tài)保溫混合10min，經(jīng)自然冷卻至室溫后靜置1h，過濾，所得固體于75-80℃下烘干，最后送入納米研磨機(jī)中，經(jīng)研磨得到納米二氧化鈦。
對照例2
(1)大孔吸附樹脂的制備：向350份水中按比例加入50份苯乙烯、35份氫化松香丙烯酸丙三醇酯、15份甲基丙烯酸羥乙酯、40份異辛烷和0.5份引發(fā)劑，充分混合后于超聲頻率40khz、輸出功率200w下超聲處理15min，再于微波頻率2450mhz、輸出功率700w下微波處理10min，并于0-5℃環(huán)境中靜置30min，混合均勻后繼續(xù)微波處理10min，然后于-5-0℃環(huán)境中靜置15min，混合均勻后再次微波處理10min，所得混合液以5℃/min的降溫速度降溫至0-5℃保溫混合1h，隨后將混合液固液分離，所得固相用35-40℃溫水水洗三次得到白球，最后將白球于60-65℃下真空干燥，即得大孔吸附樹脂；
(2)大孔吸附樹脂的預(yù)處理：向上述所制65份大孔吸附樹脂中加入2份泊洛沙姆、1份n-羥甲基丙烯酰胺和0.5份水解聚馬來酸酐，并以5℃/min的升溫速度升溫至65-70℃保溫混合30min，再向所得混合物中加入3倍重量30-35℃水，繼續(xù)以5℃/min的升溫速度升溫至回流狀態(tài)保溫混合15min，然后自然冷卻至室溫，過濾，所得樹脂球體水洗三次，最后于60-65℃下真空干燥
(3)大孔吸附樹脂的改性：向10份異氰尿酸三縮水甘油酯中加入5份納米二氧化鈦和0.15份衣康酸酐，以5℃/min的升溫速度升溫至115-120℃保溫混合15min，再加入經(jīng)預(yù)處理后的65份大孔吸附樹脂，繼續(xù)在115-120℃保溫混合30min，待自然冷卻至室溫后水洗三次，最后經(jīng)所得樹脂球體于60-65℃下真空干燥。
實(shí)施例4
將等量實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、對照例1和對照例2所制大孔吸附樹脂用于等量且同批大豆異黃酮提取液的分離純化，并設(shè)置等量市售大孔吸附樹脂hp-20作為對照例3。
待分離純化液的制備：將大豆異黃酮乙醇提取液冷藏48h后離心，并取上清液，上清液濃縮，再經(jīng)冷藏24h后去脂，然后用5mol/l鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph值至中性，即得待分離純化液；
大豆異黃酮的分離純化：將大孔吸附樹脂加等量水充分潤濕后裝入玻璃吸附柱中，然后將等量且同批待分離純化液通過吸附柱，吸附完成后利用60％甲醇溶液沖洗大孔吸附樹脂，直至流出溶液中大豆異黃酮的質(zhì)量百分比低于0.5％，并將所得洗脫液經(jīng)干燥后制成富含大豆異黃酮的粉末，測定大孔吸附樹脂對大豆異黃酮的吸附量、解吸率和粉末中大豆異黃酮的純度，測定結(jié)果如表1所示。
表1所制大孔吸附樹脂的處理效果
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。