本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱及其制備方法與檢測(cè)17α-羥孕酮的方法。
背景技術(shù)：
17α-羥孕酮(17α-hydroxyprogesterone，17α-ohp)是一種內(nèi)源性孕激素，分子式為c21h30o3。在體內(nèi)，17α-羥孕酮是在合成糖皮質(zhì)激素和性類固醇過程中產(chǎn)生的，可以在17α-羥化酶作用下由孕酮轉(zhuǎn)化，或者在3β-羥類固醇脫氫酶作用下由17α-羥孕烯醇酮轉(zhuǎn)化，主要產(chǎn)生于腎上腺，部分產(chǎn)生于性腺。17α-羥孕酮在血液中主要與性激素共同作用，促進(jìn)個(gè)體器官的發(fā)育。然而目前一些不法商販在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖及保健品中非法添加17α-羥孕酮等激素，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，這些激素會(huì)殘留在畜禽產(chǎn)品、水產(chǎn)品、保健品中，并通過食物鏈進(jìn)入人體，在人體內(nèi)積累。而過多的激素會(huì)使體內(nèi)激素分泌系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致多種機(jī)能障礙，兒童攝入過多激素還會(huì)影響身體發(fā)育，導(dǎo)致性早熟等不良后果。
食品、保健品中17α-羥孕酮濃度低，基質(zhì)復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)方法具有較高的要求。目前17α-羥孕酮的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法、液相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)17α-羥孕酮，特異性高，但是在檢測(cè)樣品之前，需要對(duì)樣品進(jìn)行層析分離或其它方法純化，造成整個(gè)檢測(cè)過程冗長(zhǎng)復(fù)雜。此外，前期樣品處理過程容易造成待分析成分的丟失。液相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)食品、保健品中的17α-羥孕酮對(duì)儀器有較高的要求，檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度較低。因此急需一種17α-羥孕酮的檢測(cè)方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)食品、保健品中17α-羥孕酮對(duì)檢測(cè)儀器要求高、檢測(cè)準(zhǔn)確性低、檢測(cè)靈敏度低的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明提供了一種17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)食品、保健品中17α-羥孕酮對(duì)檢測(cè)儀器要求高、檢測(cè)準(zhǔn)確性低、檢測(cè)靈敏度低的問題。
本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：
本發(fā)明提供了一種17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱，包括17α-羥孕酮分子印跡聚合物和空柱，17α-羥孕酮分子印跡聚合物裝填于空柱中。
優(yōu)選的，所述17α-羥孕酮分子印跡聚合物的粒徑為28～50μm。
在本發(fā)明中提供了所述17α-羥孕酮分子印跡聚合物的制備方法，包括：將模板分子17α-羥孕酮、功能單體與4-乙烯基吡啶混勻，加入交聯(lián)劑、引發(fā)劑，在氮?dú)夂?或惰性氣體環(huán)境下反應(yīng)后，去除模板分子17α-羥孕酮。
優(yōu)選的，所述功能單體為甲基丙烯胺；
所述交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯；
所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈。
優(yōu)選的，所述模板分子17α-羥孕酮、功能單體與4-乙烯基吡啶的摩爾比為1:2:3；
所述模板分子17α-羥孕酮與交聯(lián)劑的摩爾比為1:20；
所述模板分子17α-羥孕酮與引發(fā)劑的摩爾比為1:0.12。
優(yōu)選的，所述反應(yīng)的溫度為60℃，時(shí)間為24h。
本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)17α-羥孕酮的方法，包括：
a)對(duì)17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱進(jìn)行活化，得到活化后的17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱；
b)用有機(jī)溶劑對(duì)樣品進(jìn)行提取，得到提取液；
c)將步驟b)得到的提取液注入活化后的17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱后，用淋洗液進(jìn)行淋洗，再用洗脫溶液洗脫，得到洗脫液；
d)將步驟c)得到的洗脫液用氮?dú)夂?惰性氣體吹干，加入有機(jī)溶劑混合后過濾膜，得到溶液，進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。
優(yōu)選的，步驟a)中所述活化具體為：向17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱依次加入甲醇和水。
優(yōu)選的，步驟b)中所述有機(jī)溶劑為甲醇；
步驟c)中所述淋洗液為20％甲醇水溶液；
所述洗脫液為甲醇乙酸體積比為9:1的溶劑。
優(yōu)選的，步驟d)中所述有機(jī)溶劑為甲醇；
所述濾膜的孔徑為0.22μm。
綜上所述，本發(fā)明提供了一種17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱，包括17α-羥孕酮分子印跡聚合物和空柱，17α-羥孕酮分子印跡聚合物裝填于空柱中。與現(xiàn)有技術(shù)相比，該分子印跡固相萃取柱對(duì)17α-羥孕酮的特異性強(qiáng)、選擇性高，能夠從復(fù)雜體系中選擇性的吸附模板分子17α-羥孕酮，對(duì)其進(jìn)行選擇、富集和純化。使用本發(fā)明17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱用于檢測(cè)17α-羥孕酮對(duì)檢測(cè)儀器要求較低、檢測(cè)準(zhǔn)確性高、檢測(cè)靈敏度高。
附圖說明
為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
圖1為由聚合物的結(jié)合量繪制出mip和nip的等溫吸附曲線。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明公開了一種17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱及其制備方法與檢測(cè)17α-羥孕酮的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及產(chǎn)品已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
本發(fā)明提供了一種17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱，包括17α-羥孕酮分子印跡聚合物和空柱，17α-羥孕酮分子印跡聚合物裝填于空柱中。
17α-羥孕酮分子印跡聚合物置于甲醇中，混合均勻后移至空柱中，裝填均勻后兩端分別用篩板封堵。裝填好后用酸性有機(jī)溶劑上柱清洗，所述酸性有機(jī)溶劑優(yōu)選為甲醇乙酸，再用純有機(jī)溶劑上柱清洗，所述純有機(jī)溶劑優(yōu)選為純甲醇，以除去酸性物質(zhì)。然后用氮?dú)夂?或惰性氣體吹掃除去殘留的有機(jī)溶劑，真空干燥，制得17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱。
本發(fā)明中，所述17α-羥孕酮分子印跡聚合物的粒徑為28～50μm。
本發(fā)明提供了所述17α-羥孕酮分子印跡聚合物的制備方法，包括：將模板分子17α-羥孕酮、功能單體與4-乙烯基吡啶混勻，加入交聯(lián)劑、引發(fā)劑，在氮?dú)夂?或惰性氣體環(huán)境下反應(yīng)后，去除模板分子17α-羥孕酮。
本發(fā)明中，所述功能單體為甲基丙烯胺；
所述交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯；
所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈。
所述模板分子17α-羥孕酮、功能單體與4-乙烯基吡啶的摩爾比為1:2:3；
所述模板分子17α-羥孕酮與交聯(lián)劑的摩爾比為1:20；
所述模板分子17α-羥孕酮與引發(fā)劑的摩爾比為1:0.12。
所述反應(yīng)的溫度為60℃，時(shí)間為24h。
在一些實(shí)施方案中，將模板分子17α-羥孕酮、功能單體和4-乙烯基吡啶按照摩爾比為1:2:3的比例混合溶解于乙腈中，充分混勻，冰箱中放置過夜，然后加入交聯(lián)劑，所述模板分子17α-羥孕酮與所述交聯(lián)劑的摩爾比為1:20，再加入引發(fā)劑，所述引發(fā)劑與所述模板分子17α-羥孕酮的摩爾比為0.12:1，混合均勻，得到混合液。進(jìn)一步將混合液超聲脫氣，通入氮?dú)夂?或惰性氣體除去氧氣并密封，將容器置于恒溫水浴鍋中，反應(yīng)24h，得到17α-羥孕酮固相聚合物。
將17α-羥孕酮固相聚合物研磨，過300～500目篩，得到粒徑大小在28～50μm的聚合物顆粒，用丙酮反復(fù)沉降三次除去較小的顆粒。然后將聚合物放入索氏抽提器中，用酸性有機(jī)溶劑不斷抽提，直到洗脫液檢測(cè)不到模板分子17α-羥孕酮，再用純有機(jī)溶劑抽提除去酸性物質(zhì)，真空干燥備用，即得17α-羥孕酮分子印跡聚合物。
所述酸性有機(jī)溶劑優(yōu)選為甲醇乙酸，所述純有機(jī)溶劑優(yōu)選為純甲醇。
本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)17α-羥孕酮的方法，包括：
a)對(duì)17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱進(jìn)行活化，得到活化后的17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱；
b)用有機(jī)溶劑對(duì)樣品進(jìn)行提取，得到提取液；
c)將步驟b)得到的提取液注入活化后的17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱后，用淋洗液進(jìn)行淋洗，再用洗脫溶液洗脫，得到洗脫液；
d)將步驟c)得到的洗脫液用氮?dú)夂?惰性氣體吹干，加入有機(jī)溶劑混合后過濾膜，得到溶液，進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。
本發(fā)明中，步驟a)中所述活化具體為：向17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱依次加入甲醇和水。
本發(fā)明中，步驟b)中所述有機(jī)溶劑為甲醇；
步驟c)中所述淋洗液為20％甲醇水溶液；
所述洗脫液為甲醇乙酸體積比為9:1的溶劑。
本發(fā)明中，步驟d)中所述有機(jī)溶劑為甲醇；
所述濾膜的孔徑為0.22μm。
在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)17α-羥孕酮的方法具體包括：
①活化：取17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱，向柱中依次加入甲醇和水進(jìn)行活化；
②上樣：用甲醇對(duì)樣品進(jìn)行提取，取提取液注入17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱；
③淋洗：用甲醇水溶液進(jìn)行淋洗；
④洗脫：用甲醇乙酸體積比為9:1的溶劑作為洗脫溶液，注入17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱對(duì)分析物進(jìn)行洗脫；
⑤上機(jī)測(cè)定：收集洗脫液，并用氮?dú)獯蹈?，加入有機(jī)溶劑混勻后過0.22μm的濾膜，將得到的溶液用于檢測(cè)。
為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
如無特殊說明，本發(fā)明實(shí)施例中所涉及的試劑均為市售產(chǎn)品，均可以通過商業(yè)渠道購(gòu)買獲得。
實(shí)施例1、
(一)17α-羥孕酮分子印跡聚合物的制備
(1)17α-羥孕酮固相聚合物的制備
將稱取0.33g17α-羥孕酮溶解于10ml乙腈中，加入0.142g甲基丙烯胺和0.315g4-乙烯基吡啶，充分混勻，冰箱中放置過夜，再加入3.96g乙二醇二甲基丙烯酸酯，混合均勻后加入0.04g偶氮二異丁腈。將混合液超聲脫氣10min，通氮?dú)?5min以除去氧氣并在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下密封，保證反應(yīng)的順利進(jìn)行。將容器置于60℃恒溫水浴鍋中，熱引發(fā)反應(yīng)24小時(shí)，得到17α-羥孕酮固相聚合物。
(2)17α-羥孕酮分子印跡聚合物制備
將步驟(1)制備的17α-羥孕酮固相聚合物研磨，過300～500目篩，得到粒徑大小在28～50μm的顆粒，用丙酮洗三次除去較小的顆粒。將固相聚合物放入索氏抽提器中，用甲醇乙酸體積比為9:1的提取液不斷抽提，直到洗脫液檢測(cè)不到模板分子17α-羥孕酮，再用甲醇抽提除去乙酸，真空干燥備用，即得17α-羥孕酮分子印跡聚合物mip。
(二)17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱的制備
稱取(一)中的17α-羥孕酮分子印跡聚合物0.2g置于5ml甲醇中，振蕩10min后超聲15min，制成勻漿液，移至固相萃取小柱中，兩端分別用篩板封堵。裝填均勻后用20ml甲醇乙酸體積比為9:1的溶劑分多次上柱清洗，然后10ml純甲醇上柱清洗，以除去酸性物質(zhì)，并用氮?dú)獯祾叱埩舻募状?，真空干燥，制?7α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱。
實(shí)施例2、
(一)17α-羥孕酮分子印跡聚合物的制備
(1)17α-羥孕酮固相聚合物的制備
將稱取0.66g17α-羥孕酮溶解于10ml乙腈中，加入0.282g甲基丙烯胺和0.731g4-乙烯基吡啶，充分混勻，冰箱中放置過夜。再加入7.92g乙二醇二甲基丙烯酸酯，混合均勻后加入0.08g偶氮二異丁腈。將混合液超聲脫氣10min，通入氮?dú)?5min以除去氧氣并在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下密封，保證反應(yīng)的順利進(jìn)行。將容器置于60℃恒溫水浴鍋中，熱引發(fā)反應(yīng)24小時(shí)，得到17α-羥孕酮固相聚合物。
(2)17α-羥孕酮分子印跡聚合物制備
將步驟(一)制備的17α-羥孕酮固相聚合物研磨，過300～500目篩，得到粒徑大小在28～50μm的顆粒，用丙酮洗三次除去較小的顆粒。將聚合物放入索氏抽提器中，用甲醇乙酸體積比為9:1的提取液不斷抽提，直到洗脫液檢測(cè)不到模板分子17α-羥孕酮，再用甲醇抽提除去乙酸，真空干燥備用，即得17α-羥孕酮分子印跡固相聚合物mip。
(二)17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱的制備
稱取(2)中17α-羥孕酮分子印跡固相聚合物0.2g置于5ml甲醇中，振蕩10min后超聲15min，制成勻漿液，移至固相萃取小柱中，兩端分別用篩板封堵。裝填均勻后用20ml甲醇乙酸體積比為9:1的溶劑分多次上柱清洗，然后10ml純甲醇上柱清洗，以除去酸性物質(zhì)，并用氮?dú)獯祾叱埩舻募状?，真空干燥，制?7α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱。
實(shí)施例3、17α-羥孕酮分子印跡聚合物對(duì)17α-羥孕酮的分子識(shí)別性研究
(一)17α-羥孕酮分子印跡聚合物與非印跡聚合物的制備
按照實(shí)施例1中(一)的方法制備17α-羥孕酮分子印跡聚合物mip，同時(shí)制備非印跡聚合物nip，制備方法與實(shí)施例1中的mip基本相同，僅不加模板分子17α-羥孕酮。對(duì)分子印跡聚合物mip和非印跡聚合物nip對(duì)于17α-羥孕酮的分子識(shí)別性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。
(二)分子識(shí)別性能的研究
(1)結(jié)合能力研究
以乙腈為溶劑，分別配置了一系列0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1.0、1.5mmol/l的17α-羥孕酮乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取20mg的mip及nip于聚四氟乙烯離心管中，分別加入5ml不同濃度的17α-羥孕酮乙腈溶液，放入振蕩器中室溫下震蕩12h，10000r/min下離心20min取上清液，經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后進(jìn)行uplc-3q-ms分析。
根據(jù)公式q＝(c0-ce)*1000*v/m吸附前后溶液濃度的變化計(jì)算聚合物的吸附量q。式中q為鍵合容量(μmol/g)；c0為底物初始濃度(mmol/l)；ce為吸附平衡濃度(mmol/l)；v為實(shí)驗(yàn)溶液的體積(ml)；m為分子印跡聚合物的質(zhì)量(mg)。
將以上數(shù)據(jù)用于scatachard方程q/c＝(qmax-q)/kd。式中q為鍵合容量(μmol/g)；c為模板分子的平衡濃度(mmol/l)；kd為結(jié)合位點(diǎn)的平衡離解常數(shù)(μmol/ml)；qmax為結(jié)合位點(diǎn)的最大表現(xiàn)結(jié)合量(μmol/g)。計(jì)算出線性回歸方程得到結(jié)合位點(diǎn)的最大表現(xiàn)結(jié)合量qmax和結(jié)合位點(diǎn)的平衡離解常數(shù)kd。
(2)選擇性結(jié)合研究
以乙腈為溶劑，分別配置了一系列1.00mmol/l的醋酸甲羥孕酮、苯甲酸雌二醇、去氫表雄酮的乙腈溶液。準(zhǔn)確稱取20mg的mip及nip于聚四氟乙烯離心管中，分別加入5ml1.00mmol/l的醋酸甲羥孕酮、苯甲酸雌二醇、去氫表雄酮的乙腈溶液，放入振蕩器中室溫下震蕩12h，10000r/min下離心20min取上清液，經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后進(jìn)行hplc分析。
用印跡因子α評(píng)價(jià)mip對(duì)模板分子的特異吸附性，α＝qmip/qnip，式中qmip為mip對(duì)底物的吸附量(μmol/g)，qnip為nip對(duì)底物的吸附量(μmol/g)，α值越大說明mip對(duì)模板分子的特異性吸附越強(qiáng)。
(3)色譜條件
色譜柱：behc18(2.1×100nmi.d.1.8μm)；流速：0.4ml/min；進(jìn)樣量：5μl；流動(dòng)相a：含0.1％甲酸水溶液，流動(dòng)相b：含0.1％甲酸乙腈。梯度洗脫程序：0min，60％a，40％b；5min，60％a，40％b；7min，20％a，80％b；7.5min，5％a，95％b；9.5min，5％a，95％b；10min，60％a，40％b。
離子源：采用電噴霧離子源(esi)，正離子監(jiān)測(cè)方式。離子化電壓：5500v；離子化溫度：500℃；氣簾氣：35psi；霧化氣：50psi；輔助加熱氣：50psi。采用mrm多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式。4種激素的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。
表1目標(biāo)化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)
(三)17α-羥孕酮分子印跡聚合物對(duì)17α-羥孕酮的分子識(shí)別性研究結(jié)果
由聚合物的結(jié)合量繪制出mip和nip的等溫吸附曲線，如圖1所示，mip的q值隨17α-羥孕酮濃度的增大而增大，并且高于nip，表明分子印跡聚合物對(duì)模板分子的結(jié)合量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于空白聚合物的吸附量。
將以上數(shù)據(jù)用于scatachard方程得到回歸方程為q/c＝-1.53q+15.47，根據(jù)曲線的斜率和截距求出qmax＝15.47μmol/g，kd＝0.65μmol/ml。
選擇性研究結(jié)果如表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明17α-羥孕酮分子印跡聚合物對(duì)17α-羥孕酮具有較高的特異性吸附，而對(duì)其分子結(jié)構(gòu)類似物的吸附弱且沒有特異性。同時(shí)非印跡聚合物不具備特異分子識(shí)別性。
表2聚合物對(duì)不同底物的選擇性研究
實(shí)施例4、17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱應(yīng)用于保健品口服液中17α-羥孕酮?dú)埩魳悠返奶崛∫旱倪x擇性分離、富集和純化
(1)取制備好的17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱，向柱中依次加入5ml甲醇活化，再用5ml水進(jìn)行平衡。
(2)取市售質(zhì)檢合格的激素零含量保健品口服液，準(zhǔn)確吸取1ml于具塞試管中，加入甲醇溶液8ml并超聲提取1h，后定容于10ml容量瓶中，取2ml上清液緩慢注入17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱。
(3)用4ml20％的甲醇水溶液進(jìn)行淋洗。
(4)用4ml甲醇乙酸體積比為9:1的混合溶液作為洗脫溶液，注入固相萃取柱對(duì)分析物進(jìn)行洗脫，洗脫液由氮?dú)獯蹈?，用甲醇定容?ml，再經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后進(jìn)行uplc-3q-ms分析。
結(jié)果：17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱對(duì)保健品口服液中的17α-羥孕酮具有專一選擇性的富集和純化能力，對(duì)保健品口服液樣品中加標(biāo)回收率為94.43％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.03％。
對(duì)比例1c18固相萃取柱應(yīng)用于保健品口服液中17α-羥孕酮?dú)埩魳悠返奶崛∫旱倪x擇性分離、富集和純化
(1)取c18固相萃取柱，向柱中依次加入5ml甲醇活化，再用5ml水進(jìn)行平衡。
(2)取市售質(zhì)檢合格的激素零含量保健品口服液(同實(shí)施例4)，準(zhǔn)確吸取1ml于具塞試管中，加入一定濃度的17α-羥孕酮甲醇溶液8ml并超聲提取1h，后定容于10ml容量瓶中，取2ml上清液緩慢注入c18固相萃取柱。
(3)用4ml純水進(jìn)行淋洗。
(4)用4ml甲醇進(jìn)行洗脫，洗脫液由氮?dú)獯蹈桑眉状级ㄈ葜?ml，再經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后進(jìn)行uplc-3q-ms分析。
結(jié)果：c18固相萃取柱保健品口服液中的17α-羥孕酮加標(biāo)回收率為48.59％，遠(yuǎn)低于本發(fā)明17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱對(duì)保健品口服液樣品的加標(biāo)回收率(94.43％)；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.31％，高于本發(fā)明17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱對(duì)保健品口服液樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(5.03％)。
實(shí)施例517α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱應(yīng)用于牛奶中17α-羥孕酮?dú)埩魳悠返奶崛∫旱倪x擇性分離、富集和純化
(1)取制備好的17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱，向柱中依次加入5ml甲醇活化，再用5ml水進(jìn)行平衡。
(2)取市售牛奶，準(zhǔn)確吸取1ml于具塞試管中，加入一定濃度的17α-羥孕酮甲醇溶液8ml并超聲提取1h，后定容于10ml容量瓶中，取2ml上清液緩慢注入17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱。
(3)用4ml20％的甲醇水溶液進(jìn)行淋洗。
(4)用4ml甲醇乙酸體積比為9:1的混合溶液作為洗脫溶液，注入固相萃取柱對(duì)分析物進(jìn)行洗脫，洗脫液由氮?dú)獯蹈?，用甲醇定容?ml，再經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后進(jìn)行uplc-3q-ms分析。
結(jié)果：17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱對(duì)牛奶中的17α-羥孕酮具有專一選擇性的富集和純化能力，對(duì)牛奶樣品中加標(biāo)回收率為92.13％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.94％。
對(duì)比例2c18固相萃取柱應(yīng)用于牛奶中17α-羥孕酮?dú)埩魳悠返奶崛∫旱倪x擇性分離、富集和純化
(1)取c18固相萃取柱，向柱中依次加入5ml甲醇活化，再用5ml水進(jìn)行平衡。
(2)取市售牛奶(同實(shí)施例5)，準(zhǔn)確吸取1ml于具塞試管中，加入一定濃度的17α-羥孕酮甲醇溶液8ml并超聲提取1h，后定容于10ml容量瓶中，取2ml上清液緩慢注入c18固相萃取柱。
(3)用4ml純水進(jìn)行淋洗。
(4)用4ml甲醇進(jìn)行洗脫，洗脫液由氮?dú)獯蹈?，用甲醇定容?ml，再經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后進(jìn)行uplc-3q-ms分析。
結(jié)果：c18固相萃取柱牛奶中的17α-羥孕酮加標(biāo)回收率為41.68％，遠(yuǎn)低于本發(fā)明17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱對(duì)牛奶的加標(biāo)回收率(92.13％)；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.12％，高于本發(fā)明17α-羥孕酮分子印跡固相萃取柱對(duì)保健品口服液樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(4.94％)。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。