本發(fā)明屬違禁藥品的檢測領(lǐng)域，涉及一種高通量毒品檢測的微流控芯片裝置及其應(yīng)用技術(shù)。

背景技術(shù)：

嗎啡(morphine)、冰毒(methamphetamine)、搖頭丸(mdma)等化學(xué)品雖然問世之初是為了治療人類疾病，緩解人類疼痛的，但因其在使用后具有嚴(yán)重的副作用，并且具有成癮性，因此也被列入了毒品名單。毒品的濫用，給人們的生活和生命安全都帶來了極大的影響和危害。

目前毒品檢測的方法主要包括前期的膠體金試紙檢測與后期法庭檢測所用的氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜等方法。膠體金試紙檢測方法雖然可以快速現(xiàn)場檢測，但是單張?jiān)嚰堉荒苓M(jìn)行單個樣本單一毒品的檢測，且每張只能讀取單一試紙的檢測結(jié)果。同時，由于毒品種類的繁多，對于樣本的需求量也很大。

微流控芯片由于其消耗樣本少、成本低、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，日益受到重視，被應(yīng)用到了多種檢測當(dāng)中。聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,pdms)、多聚賴氨酸、玻璃等材料的簡單易得，為毒品檢測提供了很好的方法。檢測對象只需提供少量樣本，即可實(shí)現(xiàn)多種毒品的檢測。同時，單張芯片上可以有多個檢測區(qū)域，并且可以同時檢測結(jié)果，大大方便了樣本的采集與檢測的進(jìn)行。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高通量毒品檢測的微流控芯片，由襯底層1、修飾層2、反應(yīng)層3構(gòu)成,反應(yīng)層3由n(n≥1)個完全相同的反應(yīng)模塊4組成，每個反應(yīng)模塊4由入口5、反應(yīng)通道6及出口7構(gòu)成。

該發(fā)明裝置利用多層軟光刻技術(shù)制作出具有入口5，反應(yīng)通道6以及出口7的反應(yīng)模塊4，多個反應(yīng)模塊4構(gòu)成了反應(yīng)層3。載玻片構(gòu)成的襯底層1、多聚賴氨酸構(gòu)成的修飾層2與pdms制作的反應(yīng)層3組成了整個芯片裝置。

反應(yīng)通道6的尺寸以及每個反應(yīng)模塊4之間的距離設(shè)計(jì)時可以調(diào)節(jié)以改變反應(yīng)模塊4的分布密度與總個數(shù)，實(shí)現(xiàn)不同數(shù)量樣本的同時檢測。反應(yīng)通道6寬度優(yōu)選500μm，高度優(yōu)選300μm。

襯底層1使用載玻片，材料簡單易得。厚度優(yōu)選1mm，長度優(yōu)選77mm，寬度優(yōu)選25mm。

修飾層2為多聚賴氨酸涂層。可以直接選用市面上的多聚賴氨酸載玻片，也可選擇普通載玻片自己包被多聚賴氨酸。多聚賴氨酸具有良好的生物相容性，常用作細(xì)胞培養(yǎng)，能夠形成親水的表面，利于待測樣本在芯片中的流動。

反應(yīng)層3選用聚二甲基硅氧烷(pdms)為材料，pdms具有生物兼容性好，本身熒光背景低，加工簡單、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)，同時pdms具有很強(qiáng)的蛋白吸附作用，這一吸附作用不需要特殊的表面處理，通過預(yù)先吸附特定的抗原或抗體，即可實(shí)現(xiàn)對毒品的特異性檢測。反應(yīng)層3的厚度可根據(jù)實(shí)際需要調(diào)節(jié)，優(yōu)選3–5mm。

反應(yīng)層3與涂有修飾層2的襯底層1之間封接采用等離子體處理反應(yīng)層3，同時在反應(yīng)層3底面涂敷甲苯與pdms的混合液的方式實(shí)現(xiàn)封接。

毒品對應(yīng)的完全抗原首先使用移液槍從入口5加入反應(yīng)通道6中。37℃烘干超過12h。之后使用同樣的方法，在反應(yīng)通道6中加入含有體積分?jǐn)?shù)0.05％的tween-20的磷酸鹽緩沖液(pbst)封閉液，在濕盒中，37℃保持45min–1h30min。之后，在每個入口5添加15μlpbst封閉液，從出口7抽出，直到抽干芯片內(nèi)的液體。

本發(fā)明的另一個目的是提供所述微流控芯片在高通量毒品檢測中的應(yīng)用。

芯片使用時，先將待測樣本與熒光乳膠微球溶液混合，之后添加在入口5。在出口7施加負(fù)壓，將混合溶液吸入反應(yīng)通道6中。室溫下保持1h。之后從出口7把反應(yīng)通道6中的液體都抽出。在每個入口5添加15μlpbst封閉液，從出口7加負(fù)壓，將芯片內(nèi)液體都抽出。

將芯片放在紫外凝膠成像儀或其他有紫外光源的設(shè)備中成像，一次成像可以獲得所有反應(yīng)通道6的熒光情況，分析每個通道的熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比即可獲得毒品的檢測結(jié)果。

本發(fā)明的特點(diǎn)：(1)修飾層為多聚賴氨酸，修飾后的芯片具有親水性，便于待測樣品流入芯片，同時也具有對毒品完全抗原的吸附作用；反應(yīng)層材質(zhì)為pdms，對毒品完全抗原具有很強(qiáng)的吸附能力。(2)多聚賴氨酸與pdms的配合使用，可以將多聚賴氨酸親水性的特點(diǎn)與pdms高蛋白吸附的特點(diǎn)結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)更好的檢測效果。(3)不同毒品、不同樣本的檢測發(fā)生在不同反應(yīng)通道中，不會出現(xiàn)互相干擾的現(xiàn)象，降低非特異性吸附。(4)pbst封閉液的使用可以增強(qiáng)結(jié)果的熒光強(qiáng)度。(5)單張芯片上有多個反應(yīng)模塊，可以在單張芯片上實(shí)現(xiàn)多個樣本以及多種毒品的現(xiàn)場同時檢測，實(shí)現(xiàn)高通量快速結(jié)果檢測分析。(6)反應(yīng)模塊的尺寸、間隔以及個數(shù)可以根據(jù)需要調(diào)整，滿足不同的檢測需求。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的實(shí)施例1、3、5、6的示意圖，其中1為襯底層，2為修飾層，3為反應(yīng)層，4為反應(yīng)模塊，5為入口，6為反應(yīng)通道，7為出口。

圖2是本發(fā)明的實(shí)施例2示意圖，其中5為入口，6為反應(yīng)通道，7為出口，8為陰性對照區(qū)域，9為陽性對照區(qū)域。區(qū)域10對應(yīng)為3000ng/ml的冰毒檢測區(qū)，區(qū)域11對應(yīng)為1000ng/ml的冰毒檢測區(qū)，區(qū)域12對應(yīng)為750ng/ml的冰毒檢測區(qū)，區(qū)域13對應(yīng)為500ng/ml的冰毒檢測區(qū)，區(qū)域14對應(yīng)為250ng/ml的冰毒檢測區(qū)，區(qū)域15對應(yīng)為100ng/ml的冰毒檢測區(qū)。

圖3是本發(fā)明的實(shí)施例2的結(jié)果圖。

圖4是本發(fā)明的實(shí)施例4的示意圖，其中5為入口，6為反應(yīng)通道，7為出口，16為熒光乳膠微球連接區(qū)，17為空白對照。

圖5是本發(fā)明的實(shí)施例4的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1芯片的制作

參見圖1，一種可實(shí)現(xiàn)高通量毒品檢測的微流控芯片，由襯底層1、修飾層2、反應(yīng)層3構(gòu)成，反應(yīng)層3由24個完全相同的反應(yīng)模塊4組成，每個反應(yīng)模塊4由入口5、反應(yīng)通道6及出口7構(gòu)成。

襯底層1與修飾層2采用市面上售賣的已經(jīng)包被了多聚賴氨酸的載玻片，優(yōu)選厚度1mm，寬度25mm，長度77mm。

反應(yīng)層3采用pdms為材料，采用多層軟光刻技術(shù)制作具有微通道結(jié)構(gòu)的模具，在模具上澆注具有透氣性質(zhì)的pdms固化脫模形成。反應(yīng)層3的厚度可根據(jù)實(shí)際需要調(diào)節(jié)，優(yōu)選3–5mm。

反應(yīng)層3制作完成后，用直徑1mm的打孔器在入口5與出口7處打孔，之后使用甲苯與pdms的混合溶液涂在等離子處理過的反應(yīng)層3底面，將其與修飾層2封接后，85℃加熱至牢固。

實(shí)施例2冰毒檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(參見圖2)

(1)將冰毒的完全抗原使用0.01mol/l，ph7.4的磷酸緩沖液(pbs)稀釋至200μg/ml，使用移液槍，從每個入口5加3μl進(jìn)入到反應(yīng)通道6中。其中陰性對照區(qū)域8內(nèi)的3個反應(yīng)模塊只通入pbs。芯片37℃烘干過夜。

(2)在pbs中添加體積分?jǐn)?shù)0.05％的tween-20，配置成pbst包被液。將包被液用移液槍從每個入口5加3μl進(jìn)入反應(yīng)通道6中。芯片放入濕盒，37℃保持1h。

(3)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用具有抽拉功能的注射泵，將pbst從出口抽出。

(4)使用pbst配置2.4μg/ml的帶有冰毒抗體的熒光乳膠微球溶液。

(5)使用(4)中配置的混合液梯度稀釋冰毒標(biāo)準(zhǔn)品，濃度稀釋至3000ng/ml,1000ng/ml,750ng/ml,500ng/ml,250ng/ml和100ng/ml。

(6)將(5)中得到的冰毒樣本加在入口5，從出口7通過注射泵抽入反應(yīng)通道6中。其中陰性對照區(qū)域8與陽性對照區(qū)域9的6個反應(yīng)模塊只通入帶有冰毒抗體的乳膠微球溶液。區(qū)域10通入濃度為3000ng/ml的冰毒，區(qū)域11通入濃度為1000ng/ml的冰毒，區(qū)域12通入濃度為750ng/ml的冰毒，區(qū)域13通入濃度為500ng/ml的冰毒，區(qū)域14通入濃度為250ng/ml的冰毒，區(qū)域15通入濃度為100ng/ml的冰毒。芯片放入濕盒中，室溫保持1h。

(7)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用注射泵從出口抽出，完成沖洗。

(8)使用紫外凝膠成像儀對芯片進(jìn)行結(jié)果拍攝，之后采集每一條通道的熒光強(qiáng)度，分析結(jié)果。隨著冰毒含量的增加，熒光強(qiáng)度會減弱，從而得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測結(jié)果如圖3所示。

實(shí)施例3冰毒檢測

(1)將冰毒的完全抗原使用0.01mol/l，ph7.4的pbs稀釋至200μg/ml，使用移液槍，從每個入口5加3μl進(jìn)入到反應(yīng)通道6中。芯片37℃烘干過夜。

(2)在pbs中添加體積分?jǐn)?shù)0.05％的tween-20，配置成pbst包被液。將包被液用移液槍從每個入口5加3μl進(jìn)入反應(yīng)通道6中。芯片放入濕盒，37℃保持1h。

(3)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用具有抽拉功能的注射泵，將pbst從出口抽出。

(4)使用pbst配置2.4μg/ml的帶有冰毒抗體的熒光乳膠微球溶液。

(5)使用(4)中配置的混合液與冰毒樣本混合。

(6)將(5)中得到的冰毒樣本加在入口5，從出口7通過注射泵抽入反應(yīng)通道6中。芯片放入濕盒中，室溫保持1h。

(7)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用注射泵從出口抽出，完成沖洗。

(8)使用紫外凝膠成像儀對芯片進(jìn)行結(jié)果拍攝，之后采集每一條通道的熒光強(qiáng)度，分析結(jié)果。沒有冰毒存在，則熒光強(qiáng)度會最強(qiáng)，而有冰毒存在，熒光強(qiáng)度則會減弱。通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可以得到檢測結(jié)果。

實(shí)施例4冰毒完全抗原對連接冰毒抗體的熒光乳膠微球的梯度濃度吸附實(shí)驗(yàn)

參見圖4、圖5：

(1)將冰毒的完全抗原使用0.01mol/l，ph7.4的pbs稀釋至200μg/ml，使用移液槍，從每個入口5加3μl進(jìn)入到反應(yīng)通道6中。其中空白對照區(qū)域17內(nèi)的3個反應(yīng)模塊只通入pbs。芯片37℃烘干過夜。

(2)在pbs中添加體積分?jǐn)?shù)0.05％的tween-20，配置成pbst包被液。將包被液用移液槍從每個入口5加3μl進(jìn)入反應(yīng)通道6中。芯片放入濕盒，37℃保持1h。

(3)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用具有抽拉功能的注射泵，將pbst從出口抽出。

(4)使用pbst配置2.4μg/ml的帶有冰毒抗體的熒光乳膠微球溶液。

(5)使用pbst梯度稀釋(4)中配置的帶有冰毒抗體的熒光乳膠微球溶液，濃度稀釋至10％,30％,50％,70％,100％。

(6)將(5)中得到的帶有冰毒抗體的熒光乳膠微球樣本加在入口5，從出口7通過注射泵抽入反應(yīng)通道6中。每個區(qū)域16中四個反應(yīng)模塊通入相同濃度的熒光乳膠微球溶液。芯片放入濕盒中，室溫保持1h。

(7)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用注射泵從出口抽出，完成沖洗。

(8)使用紫外凝膠成像儀對芯片進(jìn)行結(jié)果拍攝，之后采集每一條通道的熒光強(qiáng)度，分析結(jié)果。熒光強(qiáng)度隨著熒光乳膠微球濃度的升高而增強(qiáng)，并且空白區(qū)域無熒光。

實(shí)施例5嗎啡檢測

(1)參考實(shí)施例2制作嗎啡檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)將嗎啡的完全抗原使用0.01mol/l，ph7.4的pbs稀釋至200μg/ml，使用移液槍，從每個入口5加3μl進(jìn)入到反應(yīng)通道6中。芯片37℃烘干過夜。

(3)在pbs中添加體積分?jǐn)?shù)0.05％的tween-20，配置成pbst包被液。將包被液用移液槍從每個入口5加3μl進(jìn)入反應(yīng)通道6中。芯片放入濕盒，37℃保持1h。

(4)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用具有抽拉功能的注射泵，將pbst從出口抽出。

(5)使用pbst配置2.4μg/ml的帶有嗎啡抗體的熒光乳膠微球溶液。

(6)使用(4)中配置的混合液與嗎啡樣本混合。

(7)將(5)中得到的嗎啡樣本加在入口5，從出口7通過注射泵抽入反應(yīng)通道6中。芯片放入濕盒中，室溫保持1h。

(8)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用注射泵從出口抽出，完成沖洗。

(9)使用紫外凝膠成像儀對芯片進(jìn)行結(jié)果拍攝，之后采集每一條通道的熒光強(qiáng)度，分析結(jié)果。沒有嗎啡存在，則熒光強(qiáng)度會最強(qiáng)，而有嗎啡存在，熒光強(qiáng)度則會減弱。通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可以得到檢測結(jié)果。

實(shí)施例6搖頭丸檢測

(1)參考實(shí)施例2制作搖頭丸檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)將搖頭丸的完全抗原使用0.01mol/l，ph7.4的pbs稀釋至200μg/ml，使用移液槍，從每個入口5加3μl進(jìn)入到反應(yīng)通道6中。芯片37℃烘干過夜。

(3)在pbs中添加體積分?jǐn)?shù)0.05％的tween-20，配置成pbst包被液。將包被液用移液槍從每個入口5加3μl進(jìn)入反應(yīng)通道6中。芯片放入濕盒，37℃保持1h。

(4)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用具有抽拉功能的注射泵，將pbst從出口抽出。

(5)使用pbst配置2.4μg/ml的帶有搖頭丸抗體的熒光乳膠微球溶液。

(6)使用(4)中配置的混合液與搖頭丸樣本混合。

(7)將(5)中得到的搖頭丸樣本加在入口5，從出口7通過注射泵抽入反應(yīng)通道6中。芯片放入濕盒中，室溫保持1h。

(8)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用注射泵從出口抽出，完成沖洗。

(9)使用紫外凝膠成像儀對芯片進(jìn)行結(jié)果拍攝，之后采集每一條通道的熒光強(qiáng)度，分析結(jié)果。沒有搖頭丸存在，則熒光強(qiáng)度會最強(qiáng)，而有搖頭丸存在，熒光強(qiáng)度則會減弱。通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可以得到檢測結(jié)果。