本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片及其制備方法。
背景技術(shù)：
：微流控芯片是以微機(jī)電加工技術(shù)為基礎(chǔ)，由微管路在芯片上形成網(wǎng)絡(luò)，以可控微流體貫穿整個系統(tǒng)并完成各種生物和化學(xué)過程的一種技術(shù)。在微流控芯片技術(shù)發(fā)展早期，蛋白免疫芯片是市場主流；近年來，隨著分子診斷市場的成熟，臨床醫(yī)院客戶和檢驗(yàn)檢疫用戶均對核酸擴(kuò)增微流控芯片提出了迫切需求。當(dāng)前的檢測用芯片有多種，如cn1996009b、cn101590389a、us6627159、us20050199500a1、us2004120856a1、us6919058b2、us20030166265a1、wo9533986a1。但這些芯片均不是專用核酸擴(kuò)增微流控芯片，很難滿足臨床用戶需求。常見的核酸擴(kuò)增方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、鏈替代擴(kuò)增（sda）、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（lcr）等，這些方法均涉及溫度循環(huán)或溫度控制，芯片需要能夠隨外部溫控模塊快速升降溫。如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)，其原理是先加熱使待測雙鏈dna解開螺旋得到模板dna，在退火溫度條件下，引物同模板dna進(jìn)行雜交，在taqdna聚合酶、mg2+和合適的ph緩沖液等條件下延伸引物，重復(fù)“解螺旋→雜交→延伸→解螺旋”的循環(huán)過程，重復(fù)進(jìn)行25-40個pcr循環(huán)，使待測樣品中的核酸拷貝數(shù)呈指數(shù)級擴(kuò)大。其中，解螺旋、雜交、延伸階段均需要溫度控制，一個pcr循環(huán)就是一個溫度循環(huán)過程。這就要求了核酸擴(kuò)增微流控芯片必須能夠快速地升降溫，完成pcr的溫度循環(huán)過程。為滿足臨床客戶對核酸擴(kuò)增微流控芯片提出了溫控效率高的要求，需要盡量把芯片的厚度降低，方便外界的加熱裝置對芯片進(jìn)行溫控。但是目前芯片的生產(chǎn)工藝主要利用注塑工藝，這種注塑工藝只能加工板式的、具備一定厚度的芯片，當(dāng)芯片的厚度降低到一定程度時，由于芯片具備通道、反應(yīng)池等復(fù)雜精細(xì)的結(jié)構(gòu)，注塑工藝無法對其進(jìn)行精密加工。由于這種生產(chǎn)工藝的不足，始終無法生產(chǎn)大批量、生產(chǎn)成本低、具備精細(xì)結(jié)構(gòu)的薄膜式芯片。臨床上還對核酸擴(kuò)增微流控芯片提出了以下要求：1、密封性好。在核酸擴(kuò)增反應(yīng)期間（需承受100℃高溫）不能有變形或泄露，否則核酸試劑容易形成氣溶膠污染。2、生物兼容性好。核酸擴(kuò)增使用的生物試劑通常包括引物、酶等成分，芯片材質(zhì)需要兼容這些成分，以確保擴(kuò)增效率。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片及其制備方法，提供一種溫控效率高、密封性好、生物兼容性好、生產(chǎn)工藝簡單高效的薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片，包括依次貼合的底片、中間層和蓋片，所述中間層設(shè)有通道和反應(yīng)池，所述通道與反應(yīng)池連接，所述蓋片設(shè)有進(jìn)口和出口，所述進(jìn)口和出口均為通孔，所述進(jìn)口、出口分別與所述通道連接，所述底片、中間層和蓋片均為薄膜，所述底片、中間層和蓋片均為高分子材料，所述高分子材料包括聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、環(huán)烯烴類共聚物或熱塑性彈性體中的至少一種。采用這種薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片，由于其厚度小，因此可以通過外加的加熱裝置實(shí)現(xiàn)溫度的快速傳導(dǎo)，溫控效率高；由于其為三層薄膜的結(jié)構(gòu)，柔性好，在一定角度范圍內(nèi)可以能任意變形，因此可以被加工而不容易卷翹或斷裂，密封性好，使用時試劑不容易泄漏。核酸擴(kuò)增反應(yīng)過程中使用的生物試劑通常包括引物、酶等成分，芯片材質(zhì)需要兼容這些成分，以確保擴(kuò)增效率。采用上述技術(shù)方案，所述底片、中間層和蓋片可以是同一種高分子材料，也可以是不同的高分子材料，所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片為高分子材料，能使其與生物試劑兼容，生物兼容性良好。進(jìn)一步的，所述中間層設(shè)有鏤空結(jié)構(gòu)，所述鏤空結(jié)構(gòu)包括所述通道和所述反應(yīng)池。由于鏤空結(jié)構(gòu)的上方和下方均為薄膜，薄膜的透明度高，在對底片、中間層和蓋片進(jìn)行激光焊接時，薄膜較少吸收激光，因此通道和反應(yīng)池的內(nèi)表面在激光焊接后仍能保持光滑，保證后續(xù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。進(jìn)一步的，所述中間層為熱塑性彈性體。對芯片進(jìn)行激光焊接是一種簡單高效的生產(chǎn)工藝，但對于薄膜式的芯片，激光焊接的難點(diǎn)在于這三層薄膜貼合后，在薄膜之間很容易形成氣穴，氣穴不僅造成激光焊接強(qiáng)度不夠，而且容易形成不規(guī)則的燒痕，嚴(yán)重影響產(chǎn)品美觀。而采用熱塑性彈性體的中間層，由于具有彈性，薄膜之間在外界壓力下不會產(chǎn)生氣穴，避免了出現(xiàn)燒痕。氣穴是指由于貼合不緊密，在焊接后形成的塊狀缺陷，缺陷內(nèi)部包裹氣體。進(jìn)一步的，所述底片和蓋片為環(huán)烯烴類共聚物。環(huán)烯烴類共聚物的一種高透明性的高分子材料，其光線透過率可達(dá)90%以上。由于鏤空結(jié)構(gòu)的上方和下方均為薄膜，薄膜的透明度高，而優(yōu)選為環(huán)烯烴類共聚物的透明度更高，在對底片、中間層和蓋片進(jìn)行激光焊接時，薄膜極少吸收激光，因此通道和反應(yīng)池的內(nèi)表面在激光焊接后仍能保持光滑，保證后續(xù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。進(jìn)一步的，所述中間層為黑色熱塑性彈性體，所述底片、蓋片均為透明環(huán)烯烴類共聚物。由于激光焊接要求芯片的某一層能夠吸收激光能量，一般采用兩種方式：第一種是采用摻雜炭黑的黑色材質(zhì)制成的中間層，或在中間層上涂覆吸光涂料。本發(fā)明采用黑色熱塑性彈性體是使用了第一種方式，優(yōu)點(diǎn)是不再需要涂覆工藝步驟；采用透明環(huán)烯烴類共聚物，其透明度更高，在激光焊接時候不容易吸收激光，減少了對激光對位精度的要求，提高了激光焊接效率效果。進(jìn)一步的，所述底片的厚度為0.05~1mm，所述蓋片的厚度為0.05~1mm，所述中間層的厚度為0.2~2mm。采用此技術(shù)方案，所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的溫控效率高，而且薄膜的底片和蓋片，中間層更加透明，不容易吸收激光，對生產(chǎn)工藝的要求難度低，材料易得。采用此技術(shù)方案，所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的溫控效率高，滿足了大部分核酸擴(kuò)增反應(yīng)檢測的需要。進(jìn)一步的，所述通道或反應(yīng)池內(nèi)設(shè)有用于固態(tài)試劑，所述固態(tài)試劑包括干粉試劑和凝膠試劑。采用此技術(shù)方案，事先將反應(yīng)所需酶和引物加入到所述固態(tài)試劑中，使核酸擴(kuò)增反應(yīng)的全過程不需要外加反應(yīng)物，保證了反應(yīng)的連續(xù)發(fā)生，提高檢測效率。本發(fā)明的另一個目的是提供一種薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的制備方法，包括以下步驟：步驟s1，制備底片、蓋片和中間層，所述底片、蓋片和中間層均為薄膜；步驟s2，在所述中間層上切/削出通道和反應(yīng)池；步驟s3，在所述蓋片上加工出進(jìn)口和出口；步驟s4，將所述底片、中間層和蓋片依次對位，使所述進(jìn)口、出口分別與所述通道連接，使所述底片、中間層、蓋片貼合壓緊后進(jìn)行封接；步驟s5，封接完成，獲得所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片。現(xiàn)有技術(shù)中一般采用注塑工藝來生產(chǎn)芯片，當(dāng)使用注塑工藝加工精細(xì)結(jié)構(gòu)時，經(jīng)常出現(xiàn)低平面度、熔接痕、澆口斷裂等問題，很難達(dá)到設(shè)計要求；對于薄膜式芯片來說，其厚度很小，反應(yīng)池和通道的結(jié)構(gòu)非常精細(xì)，注塑工藝無法完成如此精細(xì)的結(jié)構(gòu)，使得薄膜式芯片的生產(chǎn)工藝成為一個難題。為避免注塑工藝產(chǎn)生的上述問題，本發(fā)明使用先切/削后封接的生產(chǎn)工藝：先在中間層切/削獲得切口平整、結(jié)構(gòu)精細(xì)的通道和反應(yīng)池；再將所述底片、中間層和蓋片封接貼合在一起。由于薄膜在一定角度范圍內(nèi)能任意變形，因此封接不容易卷翹或者斷裂，密封性好。采用上述先切/削后封接的技術(shù)方案，生產(chǎn)工藝簡單、高效，采用這種工藝生產(chǎn)的薄膜式核酸微流控芯片，厚度小，有利于提高溫控效率；切口平整；薄膜的柔性好，使得芯片邊緣被加工后不容易卷翹或者斷裂，密封性好。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟s2中，所述切/削方式包括機(jī)器沖切、機(jī)加工、裁剪、激光切割的一種或多種方式；所述步驟s3中，所述加工方式包括沖切、機(jī)加工、裁剪、激光切割和注塑成型中的一種或多種方式；所述步驟s4中，所述封接方式包括激光焊接、熱壓封接、高強(qiáng)度化學(xué)膠粘接或超聲焊接中的一種或多種方式。采用此技術(shù)方案，可以根據(jù)工廠的設(shè)備情況，采用多種方式組合進(jìn)行生產(chǎn)加工，如采用焊接的方式進(jìn)行封接，可以提高封接效率。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟s2中，所述切/削采用機(jī)器沖切方式；所述步驟s4中，先使所述底片、中間層、蓋片貼合壓緊，放入激光焊接設(shè)備中，再通過線激光掃描進(jìn)行焊接，激光焊接時候不需掩膜。采用機(jī)器沖切的優(yōu)點(diǎn)是：沖切表面光滑、生產(chǎn)效率高、成本低。由于涉及核酸擴(kuò)增反應(yīng)，通道或反應(yīng)池的側(cè)壁也盡量光滑，減少生物分子吸附，提高擴(kuò)增效率。機(jī)器沖切使用沖床，切口光滑，符合需求。沖切工藝是機(jī)械加工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)工藝，工藝成熟度高，配套廠家多，批量生產(chǎn)成本很低，只需使用相應(yīng)的沖切模具，就能快速生產(chǎn)。采用激光焊接的方式，有利于提高焊接效率。采用熱塑性彈性體的中間層，其在激光焊接時的優(yōu)點(diǎn)是：激光焊接的難點(diǎn)在于薄膜對位后，在薄膜之間很容易形成氣穴，氣穴不僅造成激光焊接后強(qiáng)度不夠，而且形成不規(guī)則的燒痕，嚴(yán)重影響產(chǎn)品美觀。而采用彈性材料的中間層，由于具有彈性，薄膜之間在外界壓力下不會產(chǎn)生氣穴，避免了出現(xiàn)燒痕。采用環(huán)烯烴類共聚物的底片和蓋片，以及采用鏤空結(jié)構(gòu)的中間層，其在激光焊接時的優(yōu)點(diǎn)是：激光焊接時不再需要掩膜輔助。線掃描式激光焊接設(shè)備，通常需要金屬掩膜輔助，掩膜會保護(hù)通道或反應(yīng)池等流體區(qū)域，激光只焊接非保護(hù)區(qū)域。但是由于光學(xué)折射、機(jī)械定位等原因，掩膜的設(shè)計位置和芯片結(jié)構(gòu)位置很容易發(fā)生偏差，此時激光就會照射通道或反應(yīng)池等關(guān)鍵區(qū)域，造成反應(yīng)區(qū)域表面的粗糙化，極大影響了生物反應(yīng)效率。中間層設(shè)有鏤空結(jié)構(gòu)，由于鏤空結(jié)構(gòu)的上方和下方均為薄膜，薄膜的透明度高，而優(yōu)選為環(huán)烯烴類共聚物的透明度更高，因此在對底片、中間層和蓋片進(jìn)行激光焊接時，薄膜極少吸收激光，使通道和反應(yīng)池的內(nèi)表面在激光焊接后仍能保持光滑，保證后續(xù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。本發(fā)明還提供了一種薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的使用方法，包括當(dāng)單獨(dú)使用時，使用配套框架將所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的兩側(cè)固定后使用；當(dāng)與提取芯片一起使用時，將所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片鑲嵌入提取芯片內(nèi)使用。核酸擴(kuò)增檢測流程包含四大模塊：前處理-核酸提取-核酸擴(kuò)增-檢測分析，因此如果將所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片與提取芯片結(jié)合使用，就能使核酸擴(kuò)增檢測過程的芯片更加一體化、方便快速。盡管所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片是針對核酸應(yīng)用開發(fā)的，但也可用于免疫、細(xì)胞等應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，這種薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片及其制備方法的有益效果是：1、密封無泄漏，薄膜式的芯片結(jié)構(gòu)，并采用激光焊接的封接方式，封接面不卷翹或者斷裂，能確保核酸擴(kuò)增反應(yīng)檢測過程中試劑無泄漏。2、溫控效率高，薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片，熱傳遞損耗小，升降溫速度快。3、生物兼容性，采用高分子材料，機(jī)器沖切加工后表面光滑，利于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。4、生產(chǎn)工藝簡單高效，采用先機(jī)器沖切后激光焊接的加工方式，避免注塑工藝難點(diǎn)，無需精密加工設(shè)備，生產(chǎn)效率高；底片和中間層為環(huán)烯烴類共聚物，中間層為熱塑性彈性體，并采用鏤空結(jié)構(gòu)，這樣激光焊接無氣穴、無需掩膜輔助，生產(chǎn)合格率大大提高。5、適用性強(qiáng)，所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片既適合分子診斷應(yīng)用，也適合免疫檢測、細(xì)胞檢測等應(yīng)用。附圖說明圖1是一種薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的俯視圖。圖2是一種薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的正視圖。圖3是一種薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的中間層的俯視圖。圖4是一種薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的使用方法示意圖。圖5是一種薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。附圖說明：1-底片，2-中間層，21-通道，22-反應(yīng)池，3-蓋片，31-通孔。具體實(shí)施方式為了更清楚地說明本申請實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中，芯片制作技術(shù)和使用方法均為微流控芯片領(lǐng)域和生物檢測領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)和方法。實(shí)施例1一種薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片，包括依次貼合的底片、中間層和蓋片，所述中間層設(shè)有通道和反應(yīng)池，所述通道與反應(yīng)池連接，所述蓋片設(shè)有進(jìn)口和出口，所述進(jìn)口和出口均為通孔，所述進(jìn)口、出口分別與所述通道連接，所述底片、中間層和蓋片均為薄膜，所述底片、中間層和蓋片均為高分子材料，所述高分子材料包括聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、環(huán)烯烴類共聚物或熱塑性彈性體中的至少一種。進(jìn)一步的，所述底片、中間層和蓋片可以是同一種高分子材料，也可以是不同的高分子材料。在實(shí)施例1中，薄膜的材質(zhì)也可以選自下述任意一種、任意幾種組成的復(fù)合體或任意幾種組成的混合體：金屬、玻璃、石英、硅、陶瓷、高分子化合物、橡膠和硅鋁酸鹽化合物。采用實(shí)施例1的薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片，其優(yōu)點(diǎn)是：1、溫控效率高，核酸擴(kuò)增芯片由于涉及溫度循環(huán)，需要芯片盡量薄，降低芯片內(nèi)試劑與儀器溫控模塊的溫度差。薄膜芯片的底片、蓋片均能緊密貼合溫控模塊，溫控效率高，升降溫速度很快。2、密封性好，避免封接翹曲問題，常見的微流控芯片為板式，在封接時，封接之后的芯片經(jīng)常存在翹曲現(xiàn)象，翹曲會引發(fā)板式微流控芯片封接面斷裂，并導(dǎo)致試劑泄漏、流路中斷等問題。而采用薄膜式芯片，在一定角度范圍內(nèi)芯片能夠任意變形，封接牢固，不影響正常使用，這就大大降低了封接難度。3.生物兼容性好，核酸擴(kuò)增反應(yīng)過程中使用的生物試劑通常包括引物、酶等成分，芯片材質(zhì)需要兼容這些成分，以確保擴(kuò)增效率。上述的高分子材料能使該薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片與生物試劑兼容，生物兼容性良好。實(shí)施例2在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的，所述中間層設(shè)有鏤空結(jié)構(gòu)，所述鏤空結(jié)構(gòu)包括所述通道和所述反應(yīng)池。進(jìn)一步的，所述底片和蓋片均為環(huán)烯烴類共聚物，優(yōu)選為透明環(huán)烯烴類共聚物。進(jìn)一步的，所述中間層為熱塑性彈性體，優(yōu)選為黑色熱塑性彈性體。進(jìn)一步的，所述底片的厚度為0.05~1mm，蓋片的厚度為0.05~1mm，中間層的厚度為0.2~2mm。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)灼蛏w片的厚度低于0.05mm時，材料不容易選擇，加工過程中也容易破損，厚度高于1mm時，在封接過程中較容易發(fā)生卷翹。當(dāng)中間層的厚度低于0.2mm時，中間層很難起到支撐作用；厚度高于2mm時，封接后的芯片過厚，溫控效率降低，也不利于使用和存放。經(jīng)過測試發(fā)現(xiàn)，在底片的厚度為0.05~1mm，蓋片的厚度為0.05~1mm，中間層的厚度為0.2~2mm時，此厚度的材料批量采購方便、適合批量加工，成品芯片厚度適中，不影響實(shí)際使用中的溫控效率，芯片保存也很方便。進(jìn)一步的，所述通道或反應(yīng)池內(nèi)設(shè)有用于固態(tài)試劑，所述固態(tài)試劑在核酸擴(kuò)增過程中參與反應(yīng)，所述固態(tài)試劑包括干粉試劑和凝膠試劑。采用此技術(shù)方案，事先將反應(yīng)所需酶和引物加入到所述固態(tài)試劑中，使核酸擴(kuò)增反應(yīng)的全過程不需要外加反應(yīng)物，保證了反應(yīng)的連續(xù)發(fā)生，提高檢測效率。所述中間層采用鏤空結(jié)構(gòu)，所述底片和蓋片均為環(huán)烯烴類共聚物的優(yōu)點(diǎn)是：環(huán)烯烴類共聚物的一種高透明性的高分子材料，其光線透過率可達(dá)90%以上。中間層設(shè)有鏤空結(jié)構(gòu)，由于鏤空結(jié)構(gòu)的上方和下方均為薄膜，薄膜的透明度高，而優(yōu)選為環(huán)烯烴類共聚物的透明度更高，在對底片、中間層和蓋片進(jìn)行激光焊接時，薄膜極少吸收激光，因此通道和反應(yīng)池的內(nèi)表面在激光焊接后仍能保持光滑，保證后續(xù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。所述中間層材質(zhì)優(yōu)選為熱塑性彈性體，其優(yōu)點(diǎn)為：1、形成通道、反應(yīng)池等主要結(jié)構(gòu)，完成擴(kuò)增反應(yīng)。2、避免產(chǎn)生氣穴，對芯片進(jìn)行激光焊接是一種簡單高效的生產(chǎn)工藝，但對于薄膜式的芯片，激光焊接的難點(diǎn)在于這三層薄膜貼合后，在薄膜之間很容易形成氣穴，氣穴不僅造成激光焊接強(qiáng)度不夠，而且容易形成不規(guī)則的燒痕，嚴(yán)重影響產(chǎn)品美觀。而采用熱塑性彈性體的中間層，由于具有彈性，薄膜之間在外界壓力下不會產(chǎn)生氣穴，避免了出現(xiàn)燒痕。進(jìn)一步的，所述中間層為黑色熱塑性彈性體，所述底片、蓋片均為透明環(huán)烯烴類共聚物的優(yōu)點(diǎn)是：由于激光焊接要求芯片的某一層能夠吸收激光能量，一般采用兩種方式：第一種是采用摻雜炭黑的黑色材質(zhì)作為中間層，第二種是在中間層上涂覆吸光涂料。本發(fā)明采用黑色熱塑性彈性體是使用了第一種方式，優(yōu)點(diǎn)是不再需要涂覆工藝步驟；采用透明環(huán)烯烴類共聚物，其透明度更高，在激光焊接時候不容易吸收激光，減少了對激光對位精度的要求，提高了激光焊接效率效果。實(shí)施例3一種如實(shí)施例1或?qū)嵤├?所述的薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的制備方法，包括以下步驟：步驟s1，制備底片、蓋片和中間層，所述底片、蓋片和中間層均為薄膜；步驟s2，在所述中間層上切/削出通道和反應(yīng)池；步驟s3，在所述蓋片上加工出進(jìn)口和出口；步驟s4，將所述底片、中間層和蓋片依次對位，使所述進(jìn)口、出口分別與所述通道連接，使所述底片、中間層、蓋片貼合壓緊后進(jìn)行封接；步驟s5，封接完成，獲得所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片?，F(xiàn)有技術(shù)中一般采用注塑工藝來生產(chǎn)芯片，當(dāng)使用注塑工藝加工精細(xì)結(jié)構(gòu)時，經(jīng)常出現(xiàn)低平面度、熔接痕、澆口斷裂等問題，很難達(dá)到設(shè)計要求；對于薄膜式芯片來說，其厚度很小，反應(yīng)池和通道的結(jié)構(gòu)非常精細(xì)，注塑工藝無法完成如此精細(xì)的結(jié)構(gòu)，使得薄膜式芯片的生產(chǎn)工藝成為一個難題。為避免注塑工藝產(chǎn)生的上述問題，本發(fā)明使用先切/削后封接的生產(chǎn)工藝：先在中間層切/削獲得切口平整、結(jié)構(gòu)精細(xì)的通道和反應(yīng)池；再將所述底片、中間層和蓋片封接貼合在一起。由于薄膜在一定角度范圍內(nèi)能任意變形，因此封接不容易卷翹或者斷裂，密封性好。采用上述先切/削、后封接的技術(shù)方案，生產(chǎn)工藝簡單、高效，采用這種工藝生產(chǎn)的薄膜式核酸微流控芯片，厚度小，有利于提高溫控效率；切口平整；薄膜的柔性好，使得芯片邊緣被加工后不容易卷翹或者斷裂，密封性好。實(shí)施例4在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的，所述步驟s2中，所述切/削方式包括機(jī)器沖切、機(jī)加工、裁剪、激光切割的一種或多種方式；所述步驟s3中，所述加工方式包括沖切、機(jī)加工、裁剪、激光切割和注塑成型中的一種或多種方式；所述步驟s4中，所述封接方式包括激光焊接、熱壓封接、高強(qiáng)度化學(xué)膠粘接或超聲焊接中的一種或多種方式。采用此技術(shù)方案，可以根據(jù)工廠的設(shè)備情況，采用多種方式組合進(jìn)行生產(chǎn)加工，如采用焊接的方式進(jìn)行封接，可以提高封接效率。進(jìn)一步的，所述步驟s2中，所述切/削采用機(jī)器沖切方式；所述步驟s4中，先使所述底片、中間層、蓋片貼合壓緊，放入激光焊接設(shè)備中，再通過線激光掃描進(jìn)行焊接。采用機(jī)器沖切的優(yōu)點(diǎn)是：沖切表面光滑、生產(chǎn)效率高、成本低。由于涉及核酸擴(kuò)增反應(yīng)，通道或反應(yīng)池的側(cè)壁也盡量光滑，減少生物分子吸附，提高擴(kuò)增效率。機(jī)器沖切使用沖床，切口光滑，符合需求。沖切工藝是機(jī)械加工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)工藝，工藝成熟度高，配套廠家多，批量生產(chǎn)成本很低，只需使用相應(yīng)的沖切模具，就能快速生產(chǎn)。采用激光焊接的方式，有利于提高焊接效率。采用熱塑性彈性體的中間層進(jìn)行激光焊接的優(yōu)點(diǎn)是：激光焊接的難點(diǎn)在于薄膜對位后，在薄膜之間很容易形成氣穴，氣穴不僅造成激光焊接后強(qiáng)度不夠，而且形成不規(guī)則的燒痕，嚴(yán)重影響產(chǎn)品美觀。而采用彈性材料的中間層，由于具有彈性，薄膜之間在外界壓力下不會產(chǎn)生氣穴，避免了出現(xiàn)燒痕。采用環(huán)烯烴類共聚物的底片和蓋片，以及采用鏤空結(jié)構(gòu)的中間層的基礎(chǔ)上進(jìn)行激光焊接的優(yōu)點(diǎn)是：激光焊接時不再需要掩膜輔助。線掃描式激光焊接設(shè)備，通常需要金屬掩膜輔助，掩膜會保護(hù)通道或反應(yīng)池等流體區(qū)域，激光只焊接非保護(hù)區(qū)域。但是由于光學(xué)折射、機(jī)械定位等原因，掩膜的設(shè)計位置和芯片結(jié)構(gòu)位置很容易發(fā)生偏差，此時激光就會照射通道或反應(yīng)池等關(guān)鍵區(qū)域，造成反應(yīng)區(qū)域表面的粗糙化，極大影響了生物反應(yīng)效率。中間層設(shè)有鏤空結(jié)構(gòu)，由于鏤空結(jié)構(gòu)的上方和下方均為薄膜，薄膜的透明度高，而優(yōu)選為環(huán)烯烴類共聚物的透明度更高，因此在對底片、中間層和蓋片進(jìn)行激光焊接時，薄膜極少吸收激光，使通道和反應(yīng)池的內(nèi)表面在激光焊接后仍能保持光滑，保證后續(xù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。實(shí)施例5、實(shí)施例6分別是兩個優(yōu)選的實(shí)施例，進(jìn)一步對實(shí)施例1-4中的一種薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片及其制備方法進(jìn)行說明。實(shí)施例5如圖1-4所示的一種薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片，包括依次貼合的底片1、中間層2和蓋片3，所述中間層2設(shè)有鏤空結(jié)構(gòu)，所述鏤空結(jié)構(gòu)包括一個通道21和一個反應(yīng)池22，所述通道21與反應(yīng)池22連接，所述蓋片3設(shè)有一個進(jìn)口和一個出口，所述進(jìn)口和出口均為通孔31，所述進(jìn)口、出口分別與所述通道連接，所述底片1、中間層2和蓋片3均為薄膜高分子材料。進(jìn)一步的，所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的長為75mm，寬為25mm；所述通道寬2mm，反應(yīng)池寬5mm；所述進(jìn)樣口和出樣口的直徑均為2mm。進(jìn)一步的，所述底片為0.1mm，蓋片的厚度為0.05mm，所述底片和蓋片均為環(huán)烯烴類共聚物；所述中間層的厚度為0.5mm，材質(zhì)為黑色熱塑性彈性體。上述的薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的制備方法為，包括以下步驟：步驟s1，制備底片、蓋片和中間層，所述底片、蓋片和中間層均為薄膜；步驟s2，在所述中間層上采用機(jī)器沖切的方式?jīng)_切出一個通道和一個反應(yīng)池；步驟s3，在所述蓋片上采用機(jī)器沖切的方式加工出一個進(jìn)口和一個出口；步驟s4，將所述底片、中間層和蓋片依次對位，使所述進(jìn)口、出口分別與所述通道連接，使所述底片、中間層、蓋片貼合壓緊后，放入激光焊接設(shè)備中，進(jìn)行線激光掃描焊接，焊接時無需掩膜輔助；需正反兩次焊接；焊接時激光的功率為：300w，激光掃描速度為：80mm/s；步驟s5，封接完成，獲得所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片。上述實(shí)施例使用的機(jī)器型號如下：沖床型號為q35y系列聯(lián)合沖剪機(jī)，生產(chǎn)廠家為北京市巨星鍛壓機(jī)床廠。激光焊接設(shè)備型號為workstationatsystem，生產(chǎn)廠家為萊丹塑料焊接技術(shù)（上海）有限公司。實(shí)施例5所述的薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的使用方法是：如圖4所示的配套框架的設(shè)有固定件（圖中未示出），所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的兩側(cè)通過固定件與所述配套框架連接，然后放入配套檢測儀器中使用。采用實(shí)施例5的技術(shù)方案，得到一種用于簡單反應(yīng)檢測的微流控芯片，這種芯片的厚度小，溫控效率高，密封性好，生物兼容性好，生產(chǎn)工藝簡單高效。實(shí)施例6如圖5所示的另一種薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片，包括底片、中間層和蓋片三層，所述底片、中間層和蓋片依次貼合，所述中間層設(shè)有鏤空結(jié)構(gòu)，所述鏤空結(jié)構(gòu)包括一個通道21和十五個反應(yīng)池22，所述通道21與反應(yīng)池22連接，所述蓋片上設(shè)有一個進(jìn)樣口和一個出樣口，所述進(jìn)樣口、出樣口均為通孔31，所述進(jìn)樣口、出樣口分別與所述通道21連接，所述底片、中間層和蓋片均為高分子材料。進(jìn)一步的，所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的長為75mm，寬為45mm；所述通道寬1mm，反應(yīng)池為圓形，直徑2.5mm；所述進(jìn)樣口和出樣口的直徑均為2mm；進(jìn)一步的，所述底片的厚度為0.5mm，蓋片的厚度為0.5mm，中間層的厚度為2mm；所述底片和蓋片均為透明環(huán)烯烴類共聚物；所述中間層為黑色環(huán)烯烴類共聚物。進(jìn)一步的，所述反應(yīng)池內(nèi)有固態(tài)試劑，為固定劑包裹的taq酶和引物。固定劑在50-60℃時可以分解，釋放出酶和引物。其中，taq酶是從水生棲熱菌thermusaquaticus(taq)中分離出的具有熱穩(wěn)定性的dna聚合酶。上述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的制備方法為，包括以下步驟：步驟s1，制備底片、蓋片和中間層，所述底片、蓋片和中間層均為薄膜；步驟s2，先在中間層上用激光切割的方式切割出一個通道；再用機(jī)器沖切的方式?jīng)_切出十五個反應(yīng)池。這樣反應(yīng)池的側(cè)壁仍然為光滑，能減少生物吸附；步驟s3，在所述蓋片上采用激光切割的方式加工出一個進(jìn)口和一個出口；步驟s4，將所述底片、中間層和蓋片依次對位，使所述進(jìn)口、出口分別與所述通道連接，使所述底片、中間層、蓋片貼合壓緊后，放入激光焊接設(shè)備中，進(jìn)行線激光掃描焊接，焊接時無需掩膜輔助；需正反兩次焊接。焊接時激光的功率為：300w，激光掃描速度為：50mm/s；步驟s5，封接完成，獲得所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片。上述實(shí)施例使用的機(jī)器型號如下：沖床型號為q35y系列聯(lián)合沖剪機(jī)，生產(chǎn)廠家為北京市巨星鍛壓機(jī)床廠；激光焊接設(shè)備型號為workstationatsystem，生產(chǎn)廠家為萊丹塑料焊接技術(shù)（上海）有限公司。激光切割機(jī)器型號為lf1390，生產(chǎn)廠家為濟(jì)南金威刻科技發(fā)展有限公司。實(shí)施例5所述的薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片的使用方法是，包括以下步驟：步驟a1，向所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片內(nèi)加入液態(tài)反應(yīng)試劑，封閉進(jìn)口和出口。步驟a2，將所述薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片放入配套檢測儀器，底部貼近所述配套檢測儀器的溫控模塊。步驟a3，控制溫度為50℃，保持5分鐘，使得薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片內(nèi)的固態(tài)試劑與加入的液態(tài)反應(yīng)試劑混合均勻。步驟a4，進(jìn)行溫度循環(huán)，擴(kuò)增參數(shù)為：變性95℃50s，退火45℃30s，延伸74℃60s，進(jìn)行45個循環(huán)。同時實(shí)時熒光檢測。步驟a5，反應(yīng)完畢，得到實(shí)時熒光擴(kuò)增曲線，與軟件內(nèi)預(yù)置的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，對比得到各反應(yīng)池內(nèi)指標(biāo)的濃度、陰陽性信息。以下為檢測結(jié)果：表1菌種檢測結(jié)果序號菌種指標(biāo)陰陽性濃度cfu/ml1金黃色葡萄球菌陰性-2沙門氏菌陽性10003艱難梭菌陰性-4布魯氏菌陽性1005阪崎腸桿菌陽性1000-6大腸桿菌陰性-7單核細(xì)胞增生李斯特菌陰性-8副溶血弧菌陽性10009銅綠假單胞菌陰性-10空腸彎曲桿菌陽性1000011志賀氏菌陽性1000012霍亂弧菌陰性-13溶藻弧菌陰性-這里使用的配套檢測儀器指的是實(shí)時熒光pcr核酸擴(kuò)增儀，實(shí)時熒光定量pcr（real-timequantitativepcr）技術(shù)是在pcr反應(yīng)體系中加熱特異性的熒光染料或探針，熒光信號的變化真實(shí)地反映了體系中模板的增加，通過檢測熒光信號達(dá)到定量的目的。采用實(shí)施例6的薄膜式核酸擴(kuò)增微流控芯片，在檢測過程中，未發(fā)生泄漏，溫控效率高，采用常規(guī)技術(shù)的配套檢測儀器就可以實(shí)現(xiàn)精確的檢測。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12