本發(fā)明涉及一種基于海藻酸鈉和果膠的可控溶解微球制備方法，屬于高分子材料。

背景技術(shù)：

1、生物制藥通常是將細胞作為生產(chǎn)工廠進行大規(guī)模的細胞培養(yǎng)，由培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生單抗、病毒、外泌體等目標產(chǎn)物。細胞培養(yǎng)微球載體是一種能夠給貼壁細胞附著和生長提供支持的三維結(jié)構(gòu)的納米級顆粒，與傳統(tǒng)的二位結(jié)構(gòu)培養(yǎng)相比，細胞培養(yǎng)微載體與生物反應(yīng)器結(jié)合使用可以實現(xiàn)短時間內(nèi)細胞大量增值的同時保持其特異形態(tài)及表型。然而目前市場上銷售的微載體在科學(xué)研究及臨床應(yīng)用中仍然存在諸多不足，如細胞在微球表面生長鋪滿后，消化下來的細胞無法與微球分離，導(dǎo)致收獲細胞時細胞損失率較高。

2、而果鈣凝膠因其制備簡易和良好的生物相容性，成為研究最多的生物凝膠之一，廣泛應(yīng)用于載藥，重金屬吸附和細胞固定化領(lǐng)域。但由于制備的果膠鈣微球形狀各異且機械強度低不適用于細胞培養(yǎng)。相反的海藻酸鈉微球具有很好的機械強度，但完全溶解時不僅需要高濃度的edta，還需要極長作用時間(大約1-2小時)，對于包埋細胞等應(yīng)用來說，容易損傷細胞，從而導(dǎo)致細胞收獲率極低。在這之中，海藻酸和果膠都是天然的聚陰離子多糖，結(jié)構(gòu)相似，都能與鈣、鎂等二價離子結(jié)合形成凝膠。因此現(xiàn)在亟需一種結(jié)合海藻酸鈉和果膠優(yōu)點的可以進行基于海藻酸鈉和果膠的可控溶解微球制備方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種基于海藻酸鈉和果膠的可控溶解微球制備方法、裝置及計算機可讀存儲介質(zhì)，其主要目的在于解決果膠微球形狀各異且機械強度低不適用于細胞培養(yǎng)以及海藻酸鈉微球難以溶解的問題，同時制備成球率高并且可控溶解的微球。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種基于海藻酸鈉和果膠的可控溶解微球制備方法，包括：

3、獲取作為制備原料的海藻酸鈉溶液和果膠溶液，其中，海藻酸鈉溶液為1-3％濃度，果膠溶液為1-6％濃度；

4、將所述海藻酸鈉溶液和果膠溶液基于第一預(yù)設(shè)比例混合，并使用預(yù)設(shè)的攪拌設(shè)備進行攪拌混合均勻，得到混合凝膠溶液，其中，所述第一預(yù)設(shè)比例為體積比，進行混合的所述海藻酸鈉溶液和果膠溶液的體積比為4-1：1-4；

5、將預(yù)構(gòu)建的氯化鈣水溶液和無水乙醇基于第二預(yù)設(shè)比例混合，并通過所述攪拌設(shè)備進行攪拌混合均勻，得到交聯(lián)劑溶液，其中，氯化鈣水溶液濃度為1-9％，與無水乙醇以第二預(yù)設(shè)比例混合，所述第二預(yù)設(shè)比例混合為體積比為1-6：1；

6、將所述混合凝膠溶液通過預(yù)設(shè)滴入方法滴入所述交聯(lián)劑溶液中，并在所述交聯(lián)劑溶液中得到混合凝膠珠，其中，所述預(yù)設(shè)滴入方法為高壓靜電噴霧法，使用的流速為1-5ml/min，電壓為2-20kv，電極距離為2.5-5cm；

7、洗滌所述混合微凝膠珠，得到可控溶解微球，其中，通過無菌純化水洗滌所述混合微凝膠珠，所述混合微膠珠的直徑為10-1000um，形狀為球形或類球形。

8、可選地，所述混合微凝膠珠，可實現(xiàn)可控溶解，所述方法還包括：

9、取所述可控溶解微球1ml加入溶解劑4-10ml，并觀察所述可控溶解微球的溶解狀況，對所述混合微凝膠珠的溶解情況進行檢測，其中，溶解劑為edta或檸檬酸鈉螯合劑，所述edta或檸檬酸鈉的濃度為4mm-20mm，溶解時間為20s-3min。

10、可選地，所述所述混合微凝膠珠，具有較高的機械強度，所述方法還包括：

11、提取4ml滅菌后的所述可控溶解微球加入到50ml培養(yǎng)基中，并轉(zhuǎn)移至125ml磁力攪拌瓶中進行攪拌，其中，所述微球載體在培養(yǎng)基中，在40-80rpm下持續(xù)高速攪拌，能夠保持30天不出現(xiàn)裂痕或破碎，從而驗證制備的微球具有較高的機械強度。

12、可選地，所述獲取作為制備原料的海藻酸鈉溶液和果膠溶液之前，所述方法還包括：

13、從所述海藻酸鈉溶液中獲取檢定樣品，得到海藻酸鈉溶液樣品；

14、通過在所述海藻酸鈉溶液樣品中添加去離子水和固體碳酸鈉，并在80-90℃條件下攪拌加熱1.5-3小時，得到混合海藻酸鈉溶液樣品；

15、將所述混合海藻酸鈉溶液樣品離心分離，并留取上層清液，得到待檢定海藻酸鈉溶液；

16、將所述待檢定海藻酸鈉溶液計加入反應(yīng)容器，并添加濃鹽酸和間苯三酚顯色液，搖勻后在沸水浴中顯色反應(yīng)40-50分鐘，得到顯色反應(yīng)液；

17、在所述顯色反應(yīng)液定容后，在420-460nm波長下測定所述顯色反應(yīng)液的吸光度，并根據(jù)標準曲線計算出所述海藻酸鈉溶液中海藻酸鈉的濃度，并在所述藻酸鈉溶液中海藻酸鈉的濃度達到預(yù)設(shè)濃度要求時，檢定通過。

18、可選地，所述將所述海藻酸鈉溶液和果膠溶液基于第一預(yù)設(shè)比例混合，并使用預(yù)設(shè)的攪拌設(shè)備進行攪拌混合均勻，得到混合凝膠溶液，包括：

19、獲取所述混合凝膠溶液的攪拌轉(zhuǎn)速和攪拌時長；

20、將所述海藻酸鈉溶液和果膠溶液基于第一預(yù)設(shè)比例混合得到混合溶液，并通過啟動所述攪拌設(shè)備攪拌所述混合溶液，逐漸調(diào)整到所述攪拌速度，觀察所述混合溶液是否有結(jié)塊和沉淀，根據(jù)是否有結(jié)塊和沉淀調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速；

21、攪拌所述攪拌時長，關(guān)閉所述攪拌設(shè)備，并取樣檢查所述混合溶液的均勻性，在所述混合溶液的均勻性達到預(yù)設(shè)要求時，得到所述混合凝膠溶液。

22、可選地，所述洗滌所述混合微凝膠珠，得到可控溶解微球，包括：

23、取預(yù)設(shè)容量的洗滌溶液，將收集到的所述混合微凝膠珠置入所述洗滌溶液中，輕輕攪拌或搖晃，并通過過濾將溶液與微凝膠珠分離，棄去所述洗滌溶液；

24、重復(fù)上述步驟預(yù)設(shè)次數(shù)，直至所述洗滌溶液中不再有雜質(zhì)時，得到初始可控溶解微球；

25、通過測量所述初始可控溶解微球的直徑，獲取所述初始可控溶解微球的微球變異系數(shù)值，并在所述微球變異系數(shù)值小于預(yù)設(shè)的變異閾值時，得到所述可控溶解微球。

26、可選地，所述通過測量所述初始可控溶解微球的直徑，獲取所述初始可控溶解微球的微球變異系數(shù)值，包括：

27、利用工業(yè)顯微鏡拍攝所述可控溶解微球洗滌前后的光學(xué)照片，測量微球直徑時，每個條件至少測量100顆微球，并根據(jù)下式計算微球變異系數(shù)(cv)值：

28、

29、其中，為可控溶解微球的平均直徑，di為第i個可控溶解微球的直徑，n為所測量可控溶解微球的個數(shù)。

30、可選地，所述攪拌設(shè)備為磁力攪拌器。

31、可選地，所述通過測量所述初始可控溶解微球的直徑，獲取所述初始可控溶解微球的微球變異系數(shù)值之前，所述方法還包括：

32、通過下式計算所述初始可控溶解微球洗滌前和所述初始可控溶解微球洗滌后的體積變化率：

33、

34、其中，v為所述初始可控溶解微球洗滌前和所述初始可控溶解微球洗滌后的體積變化率，da為所述初始可控溶解微球洗滌前的平均直徑，db為所述初始可控溶解微球洗滌后的平均直徑；

35、當(dāng)所述體積變化率大于或等于預(yù)設(shè)體積變化閾值時，減少所述可控溶解微球的洗滌時間或者重新為所述初始可控溶解微球配置洗滌溶液。

36、為了解決上述問題，本發(fā)明還提供一種電子設(shè)備，所述電子設(shè)備包括：

37、至少一個處理器；以及，

38、與所述至少一個處理器通信連接的存儲器；其中，

39、所述存儲器存儲有可被所述至少一個處理器執(zhí)行的指令，所述指令被所述至少一個處理器執(zhí)行，以實現(xiàn)上述所述的基于海藻酸鈉和果膠的可控溶解微球制備方法。

40、為了解決上述問題，本發(fā)明還提供一種計算機可讀存儲介質(zhì)，所述計算機可讀存儲介質(zhì)中存儲有至少一個指令，所述至少一個指令被電子設(shè)備中的處理器執(zhí)行以實現(xiàn)上述所述的基于海藻酸鈉和果膠的可控溶解微球制備方法。

41、相比于背景技術(shù)所述問題，本發(fā)明先獲獲取作為制備原料的海藻酸鈉溶液和果膠溶液，其中，海藻酸鈉溶液為1-3％濃度，果膠溶液為1-6％濃度，可見本發(fā)明采用了藻酸鈉溶液和果膠溶液地混合溶液，而不是單一的果膠溶液或者海藻酸鈉溶液制備微球，解決果膠微球形狀各異且機械強度低不適用于細胞培養(yǎng)以及海藻酸鈉微球難以溶解的問題。其后，將所述海藻酸鈉溶液和果膠溶液基于第一預(yù)設(shè)比例混合，并使用預(yù)設(shè)的攪拌設(shè)備進行攪拌混合均勻，得到混合凝膠溶液，其中，所述第一預(yù)設(shè)比例為體積比，進行混合的所述海藻酸鈉溶液和果膠溶液的體積比為4-1：1-4，可見本發(fā)明為了體現(xiàn)出兩種材料的優(yōu)點，設(shè)置了嚴格的濃度標準，之后將預(yù)構(gòu)建的氯化鈣水溶液和無水乙醇基于第二預(yù)設(shè)比例混合，并通過所述攪拌設(shè)備進行攪拌混合均勻，得到交聯(lián)劑溶液，其中，氯化鈣水溶液濃度為1-9％，與無水乙醇以第二預(yù)設(shè)比例混合，所述第二預(yù)設(shè)比例混合為體積比為1-6：1；為了制備出具有良好形狀、粒徑均勻和高機械強度的微球，調(diào)配適合濃度的交聯(lián)劑溶液。其后，將所述混合凝膠溶液通過預(yù)設(shè)滴入方法滴入所述交聯(lián)劑溶液中，并在所述交聯(lián)劑溶液中得到混合凝膠珠，其中，所述預(yù)設(shè)滴入方法為高壓靜電噴霧法，使用的流速為1-5ml/min，電壓為2-20kv，電極距離為2.5-5cm。最后洗滌所述混合微凝膠珠，得到可控溶解微球，其中，通過無菌純化水洗滌所述混合微凝膠珠，所述混合微膠珠的直徑為10-1000um，形狀為球形或類球形?？梢姳景l(fā)明不僅擬定了微球制備過程中的具體條件，還考慮了結(jié)合實際情況及目標產(chǎn)物的性能要求去調(diào)配各個組分的濃度，進而，得到符合實驗需求的可控溶解微球。因此本發(fā)明提出的基于海藻酸鈉和果膠的可控溶解微球制備方法、裝置、電子設(shè)備及計算機可讀存儲介質(zhì)，其主要目的在于果膠微球形狀各異且機械強度低不適用于細胞培養(yǎng)以及海藻酸鈉微球難以溶解的問題，同時制備成球率高并且可控溶解的微球。