本發(fā)明涉及一種具有ph響應(yīng)納濾膜的制備方法，屬于膜制備，該納濾膜具有純水通量高，選擇性高，抗污效果好等優(yōu)點(diǎn)，適用于生物分子純化等領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、肽一種有機(jī)化合物，由氨基酸脫水而成，含有羧基和氨基，是一種兩性化合物。分子量段在50～5000之間的才能稱為肽。分子量段在5000～10000之間的稱為大肽。分子量段在50～2000之間的稱為小肽、寡肽、低聚肽，也稱為小分子活性多肽。生物學(xué)家將肽稱為“氨基酸鏈”，將小分子活性多肽統(tǒng)稱為“生物活性肽”。通常十肽以下者較具醫(yī)藥及商業(yè)實(shí)用性小肽在生物體內(nèi)作為載體和運(yùn)輸工具，將人們平常所食的營養(yǎng)輸送到人體各個(gè)部位，充分發(fā)揮其功能；小肽在生物體內(nèi)作為神經(jīng)遞質(zhì)，傳遞信息；小肽具有極強(qiáng)的活性和多樣性，可全面調(diào)節(jié)人體生理功能，增強(qiáng)人體生理活性。

2、大豆肽是將大分子的大豆蛋白質(zhì)，利用生物技術(shù)酶分解成由2到10個(gè)氨基酸組成的小分子片段。大豆肽富含22種氨基酸，其中包含9種人體不能合成的必需氨基酸。大豆肽是大豆蛋白水解的小分子產(chǎn)物，具有多種健康益處。除了提高免疫力外;大豆肽還可以影響氨基酸殘基的電子傳遞能力和上調(diào)細(xì)胞抗氧化酶活性，調(diào)節(jié)腸道菌群，降低膽固醇。

3、目前，大豆肽的制備方法主有3種：即酶水解法、化學(xué)水解法和微生物發(fā)酵法，在生產(chǎn)中常用的方法主要是酶水解法和微生物發(fā)酵法。酶解法生產(chǎn)的大豆肽容易分離純化，氨基酸不易被破壞，用于工業(yè)化生產(chǎn)具有明顯的優(yōu)勢。目前水解大豆蛋白常用的酶制劑主要有木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶等。這些酶的最適ph在7左右。在工業(yè)生產(chǎn)中，酶解反應(yīng)完成后，利用10%三氯乙酸調(diào)節(jié)其ph值至大豆蛋白等電點(diǎn)（ph值為4.3），一方面為了以除去未水解的蛋白質(zhì)，另一方面將酶解液的ph調(diào)節(jié)至等電點(diǎn)附近，蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)凈電荷為零，容易沉淀，這時(shí)候利用離心將沉淀分離，但是這個(gè)時(shí)候得到的產(chǎn)物純度不高，并且可能會(huì)有蛋白質(zhì)丟失，同時(shí)需要后續(xù)加入乙醇洗滌去除殘余的三氯乙酸，操作相對(duì)復(fù)雜。在后續(xù)的提純精制實(shí)驗(yàn)中，由于目標(biāo)活性肽在生產(chǎn)反應(yīng)體系中含量甚微，傳統(tǒng)分離技術(shù)往往無能為力，必須采用吸附分離、色譜分離、超濾膜分離、反滲透等現(xiàn)代分離技術(shù)和脫色、脫臭、脫苦等技術(shù)，然而這些方法能耗大，產(chǎn)量也不高。例如色譜方法是高度選擇性的，但它們消耗大量有毒和昂貴的溶劑，并且它們提供低傳質(zhì)和低輸出。

4、研究表明，利用膜技術(shù)分離的產(chǎn)率、純度和產(chǎn)品質(zhì)量與色譜法相當(dāng)，但生產(chǎn)率更高，成本更低。膜過濾可以在低溫下進(jìn)行，能耗更少，不需要添加劑或溶劑，并且可以很容易地?cái)U(kuò)大到高流速，與色譜法相比，可以提高批量處理量。中國發(fā)明專利申請(qǐng)201610536913.4，一種新型的大豆分肽離精制法，它的特點(diǎn)在于采用兩級(jí)分離，第一級(jí)過濾后濾出液的分子量為300da到3000da，第二級(jí)過濾后平均分子量低于1000da,雖然最后得到的大豆肽分子量分布集中，平均低于1000da，但是并沒有完全實(shí)現(xiàn)不同分子量大豆肽的分級(jí)分離。本發(fā)明采用ph響應(yīng)的納濾膜，通過調(diào)節(jié)進(jìn)料液的ph,膜的孔徑發(fā)生變化，實(shí)現(xiàn)了一種膜分離不同分子量大豆肽的目的，設(shè)備更為簡單，更具有工業(yè)化應(yīng)用前景。

5、近年來，由于刺激反應(yīng)材料在許多領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景，因此對(duì)其的利用是一個(gè)新興的話題，對(duì)于納濾膜來說，它可以克服傳統(tǒng)納濾膜不能適應(yīng)環(huán)境變化的缺點(diǎn)。使用ph敏感聚合物材料作為膜的一個(gè)潛在好處是，它不僅會(huì)在過濾過程中對(duì)不同的進(jìn)料ph產(chǎn)生不同的響應(yīng)，而且可以通過改變進(jìn)料液的ph來控制聚合物鏈在膜形成過程中的狀態(tài)，進(jìn)而可以調(diào)節(jié)膜的孔徑。因此我們可以通過改變進(jìn)料液的ph值，從而實(shí)現(xiàn)膜孔徑的精準(zhǔn)調(diào)控，更加高效的進(jìn)行分離。

6、由于酶解實(shí)驗(yàn)最終的ph在7附近，并且酶解液中主要含有分子量150?-?1000?da的大豆肽，以及其他小分子氨基酸。如果利用沉淀法來分離大豆肽會(huì)有收率低、純度低和能耗大等缺點(diǎn)。本發(fā)明利用可以ph響應(yīng)的納濾膜來提純大豆肽，具體來說，通過調(diào)節(jié)酶解液的ph來進(jìn)行分離，此時(shí)膜的孔徑會(huì)隨著ph的變化而變化，從而達(dá)到利用一種納濾膜來實(shí)現(xiàn)對(duì)不同分子量大豆肽的分段分離。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種具有ph響應(yīng)納濾膜的制備方法用于提純小分子肽，通過調(diào)節(jié)進(jìn)料液的ph,?所制備納濾膜的截止分子量可以從400da增大到600da，從而可以獲得不同分子量的大豆肽，使得在小分子肽的生產(chǎn)過程中，實(shí)現(xiàn)高效分離的同時(shí)保證其生物活性。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種具有ph響應(yīng)納濾膜的制備方法用于提純小分子肽，其具體步驟如下：

3、（1）水相單體混合溶液的制備

4、水相單體混合溶液的制備過程中涉及的物質(zhì)按下列質(zhì)量百分比組成，表面活性劑0.5-1.5%、殼聚糖（不同分子量）0.05-0.2%、二胺類有機(jī)物0.5-2.5%、剩余量為超純水。配制一定濃度的醋酸水溶液，稱取一定量的殼聚糖粉末，緩慢加入到醋酸水溶液當(dāng)中，接著磁力攪拌1-2?h。殼聚糖全部溶解后，加入二胺類有機(jī)物，等待全部溶解后，滴加表面活性劑。將混合溶液磁力攪拌10-15?min，即得到水相單體混合溶液；

5、配制2?mol/l?的氫氧化鈉溶液，將商品膜浸泡于配置的氫氧化鈉溶液中，在60?℃下恒溫水浴2?h，取出膜片用用純水清洗3次，然后在純水浸泡24?h備用；

6、（2）具有ph響應(yīng)納濾膜的制備

7、將（1）中制備的水相溶液攪拌均勻后靜置5min備用，從純水中取出商品膜，使用工業(yè)擦拭紙擦去多余水分；將1,3,5-苯三甲酰氯溶于有機(jī)溶劑中配制成油相溶液，油相溶液中1,3,5-苯三甲酰氯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15-0.3%。將25?ml水相溶液傾倒在基膜表面，保持1-3min后，使用工業(yè)擦拭紙擦去多余水相溶液，然后倒入25?ml油相溶液發(fā)生界面聚合反應(yīng)，反應(yīng)1-2?min后倒出多余的油相溶液，經(jīng)有機(jī)溶劑清洗兩次后，將制備好的納濾膜浸泡到不同ph值的溶液中30?min，將膜冷凍干燥儲(chǔ)存使用。

8、優(yōu)選步驟（1）中表面活性劑為三甲胺、三乙胺、十二烷基二甲基芐基溴化銨中的一種。

9、優(yōu)選步驟（1）中分子量分別為50000da，100000?da，?200000da的殼聚糖中的一種。

10、優(yōu)選步驟（1）中二胺類有機(jī)物為鄰苯二胺、間苯二胺、對(duì)苯二胺中的一種。

11、優(yōu)選步驟（1）中商品膜為聚丙烯腈、聚偏氟乙烯、聚醚砜、聚砜中的一種。

12、優(yōu)選步驟（2）中所述有機(jī)溶劑為正己烷、正庚烷、十二烷、十四烷中的一種。

13、本發(fā)明通過選用殼聚糖作為ph響應(yīng)材料，將其與鄰苯二胺按一定比例混合作為水相單體與酰氯單體進(jìn)行界面聚合反應(yīng)，在低ph的緩沖溶液中，殼聚糖的大部分功能胺基團(tuán)被質(zhì)子化。帶電荷的殼聚糖鏈之間的靜電斥力導(dǎo)致聚合物網(wǎng)絡(luò)膨脹，緩沖液在凝膠內(nèi)部擴(kuò)散和膨脹。當(dāng)溶液ph值升高時(shí)，殼聚糖的電離度降低，形成結(jié)構(gòu)更致密、平衡膨脹比（seq）更低的凝膠。通過調(diào)節(jié)進(jìn)料溶液的ph值，影響聚酰胺層交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的膨脹與收縮情況，從而實(shí)現(xiàn)膜孔徑的精確調(diào)控此外相比于其他ph響應(yīng)材料，殼聚糖具有更為良好的抗污染性能和可降解性。

14、有益效果：

15、由于ph響應(yīng)材料是通過和傳統(tǒng)水相單體混合的方式引入的，聚酰胺層的交聯(lián)程度更為密集。大豆肽的發(fā)酵液呈現(xiàn)酸性，通過略微調(diào)節(jié)發(fā)酵液的ph，可以得到不同分子量的大豆肽溶液。本發(fā)明的膜制備方法可用多種小分子肽的提純，具有廣泛的適用性。

16、本發(fā)明運(yùn)用的殼聚糖是一個(gè)鏈狀的聚合物，它所形成膜表面具有大量功能胺基團(tuán)，隨著溶液ph的降低，這些功能胺基團(tuán)的質(zhì)子化程度增加，進(jìn)而電離度增加，電離度的增加會(huì)導(dǎo)致相鄰nh3+基團(tuán)之間的靜電斥力變大，導(dǎo)致鏈膨脹，進(jìn)而影響大分子鏈的弛豫，膜孔徑變小。相反隨著ph值的升高時(shí)，電離程度的降低，分子鏈?zhǔn)湛s，膜的孔徑變大。通過改變進(jìn)料液的ph來調(diào)控膜的孔徑，從而可以獲得不同分子量的大豆肽，同時(shí)胺基團(tuán)的存在可以增加膜表面的電荷密度，增強(qiáng)道南效應(yīng)。