專(zhuān)利名稱(chēng)：分離材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以含羥基的載體為基礎(chǔ)的分離材料及其制備方法。載體的表面涂有用共價(jià)鍵結(jié)合的聚合物，而聚合物含有式Ⅰ所示的相同的或不同的重復(fù)單元。
式中R2為H或CH3Y為
，-CN，-CHO，-OH，-CH2-NH2或-CH2NR2R3，R′和R″各為H或CH3，若Y＝-OH，則R′和R″基之一亦可以是-OH，X為-OH，-NR2R3或OR4，R2和R3各為一個(gè)烷基，苯基，苯烷基或烷基苯，在烷基中有多至10個(gè)碳原子，而這些基中可被烷氧基，氰基，氨基，一烷氧基或二烷氧基，三烷銨基，羧基，磺酸基，醋酸基或乙酰氨基進(jìn)行一次或多次取代，
式中R＊和R1為H或CH3，本發(fā)明的對(duì)象也包括將該分離材料應(yīng)用于生物高聚物的分級(jí)。
本發(fā)明分離材料的結(jié)構(gòu)與EP0154246中所述的那些相載體相似，但與那里所述的材料相反的是在本發(fā)明的化合物中，在載體粒子表面的高聚物有不同的結(jié)構(gòu)和性能，在EP0154246所述的材料在兩相體系中，首先用作分配色層分離法的相載體，而本身不含有色層分離法的活性基，與此相反，本發(fā)明的材料本身具有色層分離法的活性，并可作離子交換劑，也可作為親合色層分離法或疏水色層分離法的載體。
本發(fā)明分離材料由含有羥基的載體粒子組成，在載體上在羥基的α-碳原子上用式Ⅱ和/或Ⅲ所示的單體將聚合物材料進(jìn)行接枝。
作為載體粒子一般參考的是已知的多孔和非多孔色層分離法載體，此載體表面具有脂肪族的伯或仲羥基官能團(tuán)。
其中優(yōu)先選用的有例如以丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯為基礎(chǔ)的親水聚合物，聚乙烯醇為基礎(chǔ)的聚合物，二元取代硅凝膠，以瓊脂糖為基礎(chǔ)的聚糖類(lèi)，纖維素，纖維素衍生物或以葡聚糖為基礎(chǔ)的聚合物，當(dāng)然也可使用以單體如乙烯基化合物，丙烯酰胺，(甲基)丙烯酸酯或(甲基)丙烯腈為基礎(chǔ)的其它聚合物或共聚物。
在羥基的α-碳原子上與載體粒子結(jié)合的聚合物材料以式Ⅱ和/或Ⅲ所示單體為基礎(chǔ)，這些單體是(甲基)丙烯酸(Y＝-COOH)，(甲基)丙烯酸衍生物(Y＝
)，烯丙胺(Y＝-CH2NH2，-CH2NR2R3)，(甲基)丙烯腈(Y＝-CN)，丙烯醛(Y＝-CHO)，乙烯基羧酸酯(Y＝-OCOCHR5R6)或式Ⅲ所示的碳酸次乙烯酯。
所有這些單體是在水溶液中完全可以聚合的，具有可逆結(jié)合基的物質(zhì)，這些物質(zhì)可以是中性、酸性或堿性。
如果將式Ⅲ所示的碳酸次乙烯酯或Ⅱ所示的乙烯基羧酸酯CR＊R＊＊＝CR1-OCOCHR5R6作為單體使用，最好將所得到的產(chǎn)品轉(zhuǎn)化為帶羥基的分離材料。這種轉(zhuǎn)化成為一個(gè)羥基相的過(guò)程可通過(guò)已知的適度堿性皂化或適度酸性皂化來(lái)完成，例如此反應(yīng)可用碳酸鉀甲醇溶液于室溫下進(jìn)行，Y.Tezuka等在高分子化學(xué)186，685-694，(1985)文獻(xiàn)中作了說(shuō)明。
在式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中R1最好為H，也就是說(shuō)丙烯酸衍生物是最好的，在式Ⅱ中的Y最好為
，-OCOCHR5R6或-CH2NH2，其次最好為-CN或-CHO，與此相應(yīng)的是在式Ⅰ的Y首先最好為
，-OH(因?yàn)?OCOCHR5R6最好轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基相)或-CH2NH2，其次最好為-CN或-CHO。
R5和R6互不相關(guān)地為H或有直至5個(gè)碳原子的烷基，最好是R5和R6中至少一個(gè)為H，其它基特別好的有乙酰氧基，丙酰氧基，丁酰氧基，戊酰氧基和己酰氧基。
X不僅在式Ⅰ中而且在式Ⅱ中均為OR4，-OH或NR2R3，最好為NR2R3，X為NR2R3，而R2和R3中之一為H的化合物為最佳。
R2和/或R3最好為一個(gè)烷基，苯基，苯烷基或烷苯基，其中烷基和/或苯基或被烷氧基、氰基、氨基、一烷氨基或二烷氨基、三烷銨基、羧酸基、磺酸基、乙酰氧基或乙酰氨基進(jìn)行一次或多次取代，更好是進(jìn)行一次或二次取代，最好是進(jìn)行一次取代。
R2和/或R3基最好為烷基，烷氧基烷基，氰烷基，氨基烷基、一烷基氨基烷基或二烷基氨基烷基，三烷基銨烷基，羧基烷基或磺酸烷基，烷基中可至10碳原子，更好至6碳原子，最好至4碳原子，烷基可以是直鏈的或分支的。因此，R2和/或R3最好為甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、甲氧基甲基、乙氧基甲基、2-甲氧基乙基、2-，3-或4-惡戊基、2-，3-，4-或5-惡己基、2-，3-，4-，5-或6-惡庚基、異丙基、2-丁基、異丁基、2-甲基丁基、異戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2-惡-3-甲基丁基、3-惡-4-甲基丁基、2-甲基-3-惡戊基、2-甲基-3-惡己基，此外也可以是庚基、辛基、壬基或癸基。
另外，被氰基、羧基或磺酸基取代了的烷基也是最好的，因此，R2和/或R3最好為氰甲基、氰乙基、氰丙基、氰丁基、氰戊基、氰己基、2-氰丙基、2-氰丁基、羧甲基、羧乙基、羧丙基、羧異丙基、羧丁基、羧戊基、羧己基、羧-2-甲基丙基、羧-2-甲基丁基、磺酸甲基、磺酸乙基、磺酸丙基、磺酸丁基、磺酸戊基、磺酸己基、磺酸2-甲基丙基、磺酸2-甲基丁基、磺酸3-甲基丁基、磺酸-2-甲基戊基、磺酸-3-甲基己基或磺酸-2-乙基戊基。
此外，這些烷基最好被氨基、一烷基氨基或二烷基氨基或三烷基銨基進(jìn)行一次取代，這些烷基可以相同也可以不同，可以有多至10個(gè)碳原子，更好是多至6個(gè)碳原子，最好是多至4個(gè)碳原子，因此，最好為二甲基氨乙基、二乙基氨乙基、甲基氨乙基、甲基氨丙基、二甲基氨丙基、乙基氨乙基、丙基氨乙基、丙基氨丙基、二丙基氨乙基、二丙基氨丁基、二乙基氨乙基、三甲基銨乙基、三甲基銨丙基、三甲基銨丁基、三乙基銨乙基、三乙基銨丙基、三乙基銨丁基、氨乙基、氨丙基、氨丁基或氨戊基，所以這些烷基和被取代的烷基同樣最好作為苯基上的取代基。
R2和/或R3最好也有-(CH2)n-SO2-(CH2)-S-(CH2)nOH結(jié)構(gòu)的硫砜，其中n＝2，3，4，5或6，最好地為2，3或4。
R2和/或R3最好也有一個(gè)苯基的意義，這個(gè)苯基是被氰基、氰烷基、氨基、氨烷基、一烷基氨基或二烷基氨基、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、一烷氨基烷基或二烷氨基烷基、三烷基銨一或三烷基胺烷基、羧基、羧烷基、磺酸或磺酸烷基進(jìn)行過(guò)一次取代的。這些取代基的特殊意義與上述指定最好的烷基和被取代的烷基相符，苯基上的取代基最好是在對(duì)位上。
對(duì)-乙酰氧苯基、對(duì)-氨基苯基或?qū)?乙酰氨基苯基同樣有R2和/或R3的特殊意義。
另外，R2和/或R3最好為烷苯基或苯烷基，其中所說(shuō)明的特殊意義同樣適用于烷基，被取代的烷基或被取代的苯基。
因此下述的一些被取代的苯基被認(rèn)為特別好，例如4-氰苯基、4-烷苯基、4-(N，N-二甲氨基)-苯基、4-(N，N-二烷基氨乙基)-苯基、4-乙氧基苯基、4-乙氧基乙苯基、4-三烷基銨苯基、4-羧基苯基、4-磺酸苯基、苯乙基、4-(N-乙氨基)苯基丙基或4-氰苯基-乙基。
其它的有式Ⅰ所示的單元或式Ⅱ所示的單體，在這些式中R2和/或R3為有5-10碳原子的環(huán)狀基或雙環(huán)基，這個(gè)環(huán)狀基或雙環(huán)基可以是芳香環(huán)或飽和環(huán)，環(huán)中一個(gè)或及幾個(gè)CH-或CH2基由N或NH，N或NH和S，或N或NH和O所取代。
因此，R2和/或R3最好為一個(gè)吡啶基、咪唑基、吲哚基，此外，最好為一個(gè)吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基或異喹啉基。
R2和/或R3例如亦可為一個(gè)噻唑基、噻二唑基、嗎啉基、三嗪基、哌嗪基、苯并噻唑基、嘌呤基、吡唑基、三唑基、吡咯烷基或異惡唑基，這里尤其好的是芳基、雜環(huán)基。
為了達(dá)到適宜的離子交換，R2和R3基團(tuán)必須這樣配合;要么兩個(gè)基含有一個(gè)酸性基或一個(gè)堿性基，要么兩個(gè)基團(tuán)中一個(gè)為中性。根據(jù)所希望離子交換劑的功能和任務(wù)將這些基作相應(yīng)的安排并因此為R2和R3配上合適的基，這不會(huì)給技術(shù)人員造成困難。R2和R3兩個(gè)基中的一個(gè)最好是中性基。
R4最好為烷基、烷氧基烷基、氰烷基、羧烷基或磺酸烷基，在烷基中有多至10個(gè)碳原子，更好為多至6個(gè)碳原子，最好為有多至4個(gè)碳原子，該烷基可以是直鏈的或分支的，因此R4最好為甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、甲氧基甲基、乙氧基甲基、2-甲氧基乙基、2-惡戊基、3-惡戊基或4-惡戊基、異丙基、2-丁基、異丁基、2-甲基丁基、異戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2-惡-3-甲基丁基、3-惡-4-甲基丁基、2-甲基-3-惡戊基或2-甲基-3-惡己基。
此外，被氰基，羧基或磺酸基取代了的烷基也是最好的，因此R4最好為氰甲基、氰乙基、氰丙基、氰丁基、氰戊基、氰己基、2-氰丙基、2-氰丁基、羧基甲基、羧基乙基、羧基丙基、羧基異丙基、羧基丁基、羧基戊基、羧基己基、羧基-2-甲基丙基、羧基-2-甲基丁基、磺酸甲基、磺酸乙基、磺酸丙基、磺酸丁基、磺酸戊基、磺酸己基、磺酸-2-甲基丙基、磺酸-2-甲基丁基、磺酸-3-甲基丁基、磺酸-2-甲基戊基、磺酸-3-甲基己基或磺酸-2-乙基戊基。
所有這些烷基和被取代的烷基作為苯基上的取代基。同樣最好。
R4最好也有一個(gè)苯基的意義，這個(gè)苯基最好被氰基、氰烷基、烷基、烷氧基、烷氧烷基、羧基、羧基烷基、磺酸或磺酸烷基進(jìn)行過(guò)一次取代。這些取代基的特殊意義符合于上述的最好烷基和被取代的烷基。苯基上的取代基最好在對(duì)位上。
在式Ⅱ所示單體中的R＊和R＊＊最好為H，因此式Ⅰ中的R′和R″最好亦為氫。
在式1中Y＝-OH的分離材料也是最好的，而R′和R″基之一也是-OH，作為單體那就必須使用式Ⅲ所示的碳酸次乙烯酯。并接著將聚合產(chǎn)生的產(chǎn)品轉(zhuǎn)化成一個(gè)羥基相。
在式Ⅲ中R＊和R1最好為H，式Ⅰ中的n表示重復(fù)單元數(shù)，為2-100，最好為5-60，特別是鏈長(zhǎng)為10-30最好。
為了制備本發(fā)明材料，將含有羥基的載體粒子懸浮在一種單體溶液中，最好是懸浮在水溶液中，聚合物材料的接枝是在隔絕氧的情況下，用通常的氧化還原聚合一步實(shí)現(xiàn)的。聚合催化劑可采用鈰(Ⅳ)離子，因該催化劑在載體離子的表明上形成自由基，在此自由基處開(kāi)始進(jìn)行單體的接枝聚合。技術(shù)人員可按愿望通過(guò)調(diào)節(jié)鈰(Ⅳ)鹽和單體的濃度有效地控制生成鏈的長(zhǎng)度和數(shù)目。
關(guān)于這種已知方法的細(xì)節(jié)可參見(jiàn)E.MinoundS.KaizermaninJ.ofPolymerSci.Vol.ⅩⅩⅪ，Nr.122(1958)，242-243。
為了制取結(jié)合在共聚物表面上的分離材料，可簡(jiǎn)單地將式Ⅱ和/或式Ⅲ所示相應(yīng)的不同的單體懸浮于溶液中。
為了得到本發(fā)明的離子交換劑，這里必須這樣選擇式Ⅰ所示的共聚用單體或兩個(gè)單體含有酸性或堿性基團(tuán)，或者一個(gè)單體是中性。在其它方面，技術(shù)人員由當(dāng)前技術(shù)水平得知的一般規(guī)則和條件適于用來(lái)選擇適合作共聚用的單體。
從式Ⅱ和/或式Ⅲ所示的可采用眾多單體，可以得到從弱堿性、弱酸性到強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性的離子交換劑以及載體的許多品種，它們可用于親合色層分離法或疏水色層分離法。
本發(fā)明的材料特別適用于生物高分子，例如縮氨酸，旦白質(zhì)和核酸的分級(jí)。
這種材料另外還可用于病毒，細(xì)胞器原核的或真核的細(xì)胞以及蛋白質(zhì)絡(luò)合物的分離和提純。
對(duì)于每一個(gè)分離課題可用一系列單體制取最理想分離材料，以致可將親合作用和離子鍵聯(lián)系起來(lái)。
在式Ⅰ中含有
，-CH2NH2或-CH2NR2R3的分離材料特別適宜于作離子交換材料，含有式Ⅰ中的-CHO基的材料特別適用于親合色層分離法。
實(shí)踐表明可以制成有很多高結(jié)合容量的本發(fā)明材料，它可作為通常的離子交換劑或作親合色層分離法的通常載體。
此外，在這些材料中例如脫氧核糖核酸結(jié)合是完全可逆的，而限制片斷(Restriktionsfragment)則按其大小被分離開(kāi)。
這種新離子交換劑的一大優(yōu)點(diǎn)在于每個(gè)帶電的大分子通過(guò)接枝上去的鏈狀高聚物的運(yùn)動(dòng)，可在距基體的最佳距離處找到一個(gè)對(duì)應(yīng)的相反基團(tuán)。
此外，因?yàn)閹в袎A性離子交換基的離子交換劑與一大分子的酸性基的排列相適用，而不是相反，故被結(jié)合的大分子沒(méi)有出現(xiàn)結(jié)構(gòu)的變化。因此就本發(fā)明材料來(lái)說(shuō)，結(jié)構(gòu)和作用原理都是新的、不同類(lèi)型的許多分離材料，可用于分離大分子，尤其是分離生物高聚物。
下述實(shí)施例可對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明在這些實(shí)施例中，將下述含羧基的載體用作原料Fractogel TSK HW65(S)-5S(S)-以乙烯基為基礎(chǔ)的多孔性的混合聚合物，1毫當(dāng)量OH/克(Fa.E.Merck)。
Lichrospher -Diol二元醇被取代的硅膠(Fa.E.Merck)實(shí)施例1一種弱酸性陽(yáng)離子交換劑的制備將50毫升抽濾過(guò)的Fractogal HW65(S)懸浮在由19克丙烯酸和150毫升水組成的溶液中，用氬氣沖洗，在隔絕氧條件下于25℃加入15毫升0.4摩爾的由硝酸鈰(Ⅳ)銨溶于0.1摩爾硝酸中形成的溶液，在同一溫度下攪拌3小時(shí)，將反應(yīng)產(chǎn)物抽濾，用水洗，隨后用500毫升亞硫酸鈉的10%醋酸溶液洗，接著再用500毫升0.2摩爾NaOAC-溶液洗，最后再用水洗滌。
該產(chǎn)品每毫升含有0.8mVal酸性基，和結(jié)合溶菌酶為每毫升被填充(gepackten)凝膠(由20微摩爾磷酸鈉緩沖劑組成，pH為7.0)99毫克(溶菌酶)，此溶菌酶以0.5摩爾/升NaCl在磷酸鹽中再完全放出。
實(shí)施例2一種弱酸性離子交換劑的制備將100毫升沉降的Lichrospher -Diol(孔徑1000 ，粒度10微米)用蒸餾水洗，用0.2摩爾的NaOAC溶液洗，并再用水徹底洗滌，接著使其懸浮在帶有恒溫夾套的1000毫升反應(yīng)器內(nèi)的，由104克N，N-二甲基氨乙基丙烯酰胺(A)和700毫升水(用HNO3調(diào)到pH為5.0)組成的溶液中。調(diào)溫至25℃并用氬氣排出懸浮液中的空氣氧。在隔絕空氣狀態(tài)下加入1000毫升0.4摩爾的硝酸鈰-銨在1摩爾硝酸中的溶液，此懸浮液用翼形攪拌器以約200轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速攪拌3小時(shí)，通入空氣停止反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)品過(guò)濾，用500毫升水洗滌，再用500毫升0.2摩爾Na2SO3在10%醋酸中的溶液洗滌，隨后用500毫升0.2摩爾NaOAC沖洗，再用水洗至中性。
N-含量1.1%對(duì)牛血清白朊的結(jié)合容量60毫克/毫升凝膠(0.05摩爾Tris-緩沖劑，pH8.3)實(shí)施例3
一種堿性離子交換劑的制備在Li Chrospher -Diol上(孔徑1000 ，粒度10微米)接枝聚合，制備過(guò)程與實(shí)施例2相似;但用123克N，N-二乙基氨乙基-丙烯酰胺(B)代替(A)。
N-含量0.5%;對(duì)牛血清白朊的結(jié)合容量45毫克/毫升凝膠(0.5摩爾Tris-緩沖劑，pH8.3)實(shí)施例4一種強(qiáng)堿性的陰離子交換劑的制備原料Li Chrospher -Diol(孔徑1000 ，粒度10微米)制備過(guò)程類(lèi)似于實(shí)施例2;用113克三甲基銨乙基-丙烯酰胺(C)代替(A)。
N-含量0.5%，對(duì)牛血清白朊的結(jié)合容量76.3毫克/毫升凝膠(0.05摩爾Tris緩沖劑，pH8.3)實(shí)施例5一種強(qiáng)酸性離子交換劑的制備原料Li Chrospher -Diol(孔徑1000 ，粒度10微米)制備過(guò)程類(lèi)似于實(shí)施例2;用150克2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸(D)代替(A)。
N0.2%;S0.2%，對(duì)溶菌酶的結(jié)合容量36毫克/毫升凝膠(20毫摩爾PO4，pH7.0)實(shí)施例6一種弱堿性離子交換劑的制備原料Fractogel TSK HW55(S)制備過(guò)程類(lèi)似于實(shí)施例2，用100毫升Fractogel 代替Li Chrospher -Diol，并加入60gN，N-二甲基氨乙基-丙烯酰胺(A)。
N5.31%;對(duì)牛血清白朊的結(jié)合容量57毫克/毫升凝膠(0.05摩爾Tris，pH8.3)實(shí)施例7一種堿性的離子交換劑的制備原料Fractogel TSK HW65(M)制備過(guò)程類(lèi)似于實(shí)施例2，用123gN，N-二乙基氨乙基-丙烯酰胺代替(A)。
N2.5%;對(duì)牛血清白朊的結(jié)合容量79毫克/毫升凝膠(0.5摩爾Tris-緩沖劑，pH8.3)實(shí)施例8一種強(qiáng)堿陰離子交換劑的制備原料Fractogel TSK HW65(M)100毫升
113g三甲基銨乙基丙烯酰胺制備過(guò)程類(lèi)似于實(shí)施例2。
N3.80%;對(duì)牛血清白朊的結(jié)合容量154毫克/毫升凝膠(0.05摩爾Tris-緩沖劑，pH8.3)實(shí)施例9類(lèi)似于實(shí)施例2由100毫升Fractogel
TSK HW65(S)和150克2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸制備一種強(qiáng)酸性的離子交換劑。
N0.5%，S0.7%;對(duì)溶菌酶的結(jié)合容量51毫克/毫升凝膠(20毫摩爾PO4，pH7.0)在上述實(shí)例中Tris為三(羧甲基)氨基甲烷·HClPO4為磷酸鈉緩沖劑實(shí)施例10類(lèi)似于實(shí)施例1，通過(guò)100毫升Fractogel
TSK HW65(S)和60克丙烯腈反應(yīng)制備適用于反相色層分離法用的Cyano-Fractogel。
N的含量8.9%。
實(shí)施例11
類(lèi)似于實(shí)施例2可由100毫升Li Chrospher -Diol(孔徑1000 ，粒度10微米)，39.2克丙烯醛和50g N-甲基丙烯酰胺通過(guò)混合接枝聚合制備一種適合于伯胺色層分離法，或適合于固定伯胺和蛋白質(zhì)以及適合于親合色層分離法的醛相。
實(shí)施例12類(lèi)似于實(shí)施例1由100毫升Fractogel TSK HW65(S)和160g烯丙胺制備一種氨相。
N的含量0.55%實(shí)施例13類(lèi)似于實(shí)施例2由100毫升沉降的Li Chrospher -Diol(孔徑1000 和粒度10微米)和36克醋酸乙烯制備一種醋酸基相，該醋酸基相可在室溫下用K2CO3甲醇溶液處理轉(zhuǎn)化成一種羧基相。(參見(jiàn)Y.Tezuka et.al.，Macromol.Chem.186，685-694(1985))。
實(shí)施例14類(lèi)似于實(shí)施例2由100毫升沉降的Li Chrospher -Diol(孔徑1000 和粒度10微米)和140克碳酸次乙烯酯制備一種相，此種相通過(guò)緩和堿性或酸性皂化，容易轉(zhuǎn)化成所希望得到的羧基相。下面實(shí)例涉及應(yīng)用實(shí)施例
實(shí)施例A脫氧核糖核酸一限制斷片(DAN-Restriktionsfragmenten)的分級(jí)將按實(shí)施例2制成的堿性離子交換劑加入在一個(gè)Superformance 一柱(50×10毫米，制造廠(chǎng)E.Merck)內(nèi)的20毫摩爾Tris-HCl中(pH6.5)，并用同一緩沖劑以2毫升/分速度使之達(dá)到平衡，把3個(gè)吸附單元(260毫微米)加到由pDSI質(zhì)粒組成的限制片斷中，pDSI質(zhì)粒有長(zhǎng)度為11，18，31，45，80，85，87，222，262，267，270，314，434，458，587和657的堿基配對(duì)(Basenpaaren)，繼而在1毫升/分的平衡緩沖劑中用呈梯度(0-1摩爾NaCl)的NaCl進(jìn)行洗提，結(jié)果是每一種限制斷片都得到很好分離。
實(shí)施例B山羊血清的分級(jí)將按實(shí)施例8制成的材料裝入Superformance 柱(50×10毫米)中，用20毫摩爾Tris-HCl，pH8.3使達(dá)到平衡，加入處在250微升緩沖劑中的50微升血清，用線(xiàn)形梯度為0-500毫摩爾的Na2SO4在同一緩沖劑中進(jìn)行洗提，結(jié)果是白蛋白和球蛋白顯著分離。
實(shí)施例C
β-乳球蛋白A和B的分離將按實(shí)施例3制成的材料裝入一個(gè)Superformance
柱中(50×10mm)中，用20毫摩爾Na-PO4′pH6.8使之達(dá)到平衡，將0.6毫克市售的β乳球蛋白A和B混合物加到100微升緩沖劑中，并用50毫升線(xiàn)形梯度為0-500毫摩爾的Na2SO4在上述的緩沖劑中洗提，結(jié)果是β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B獲得很好的分離。
實(shí)施例D帶單克隆抗體的鼠腹水液體的分級(jí)將按實(shí)施例3制成的材料裝入一個(gè)Superformance
柱(50×10毫米)中，用20毫摩爾Tris-HCl pH8.3使之達(dá)到平衡，加入1.5毫升處在4.5毫升緩沖劑中的腹水液體，用梯度(100毫升)為0-250毫摩爾的Na2SO4在起始緩沖劑中進(jìn)行洗提。
實(shí)施例E人血清免疫球蛋白(IgG)的分級(jí)1.將按實(shí)施例5制成的材料裝入一Superformance
柱(50×10mm)中，用10毫摩爾Na OAC/HOAC，pH5.0使之達(dá)到平衡，加入3.5毫克IgG，用呈梯度(100毫升，0-1M)的NaCl在相同的緩沖劑中洗提，可得到相當(dāng)好的分級(jí)。
2.用實(shí)施例9制成的材料，進(jìn)行類(lèi)似于1的分級(jí)。
3.用傳統(tǒng)的SP-Tractogel650(S)類(lèi)似于E1對(duì)IgG進(jìn)行分級(jí)，得到的洗提分布圖表明在此幾乎沒(méi)有得到分級(jí)。
從這些試驗(yàn)得知，應(yīng)用傳統(tǒng)材料比用本發(fā)明的離子交換劑的分離效果差。
實(shí)施例F帶單克隆抗體的鼠腹水液體的分級(jí)將按實(shí)施例5制成的強(qiáng)酸性離子交換劑裝入一Superformance (50×10毫米)中，用10毫摩爾Na OAC/HOAC，pH5.0使之達(dá)到平衡，加入100微升腹水，并用梯度(50毫升)從0到50毫摩爾的NaCl洗提，可使帶單克隆抗體的免疫球蛋白很好地分離。
從上述實(shí)例中可看出，用本發(fā)明的離子交換劑可達(dá)到很好的分離結(jié)果。這些材料用于分離生物高分子是有利的。
權(quán)利要求
1.以含有羥基的載體為基礎(chǔ)的分離材料，載體表面涂有用共價(jià)鍵結(jié)合的聚合物，其特征在于聚合物含有式Ⅰ所示的相同的或不同的重復(fù)單元。
式中R1為H或CH3
或-CH2NR2R3，R′和R″各為H或CH3，如果Y=-OH，R′和R″基之一也可以是-OH。X為-OH，-NR2R3或OR4，R2和R3各為一個(gè)烷基，苯基，苯烷基或烷基苯，在烷基中有多至10個(gè)碳原子，而這些基中可被烷氧基，氰基，氨基，一烷氨基或二烷氨基，三烷銨基，羧基，磺酸基，醋酸基或乙酰氨基進(jìn)行一次或多次取代。一個(gè)帶有5-10個(gè)碳原子的環(huán)基或雙環(huán)基，其中一個(gè)或幾個(gè)CH基或CH2基由N或NH，N或NH和S或N或NH和O取代?；蛞粋€(gè)-(CH2)n-SO2-(CH2)nS(CH2)nOH結(jié)構(gòu)的硫砜化合物，其中n=2-6，而R2和R3基之一也可以是H。其中R2和R3可這樣相互配合；要么兩個(gè)基都是酸性或堿性要么一個(gè)基或二個(gè)基是中性，n為2至100，而R4為一個(gè)烷基、苯基、苯烷基或烷苯基，在烷基上有多至10個(gè)碳原子，這些基中可被烷氧基、氰基、羧基、磺酸基或醋酸基進(jìn)行一次或多次取代。
2.按照權(quán)利要求1所述的分離材料，其特征在于式1中的Y為
，而X＝-OH或-OR4，其中R4具有權(quán)利要求1中所述的意義。
3.按照權(quán)利要求1所述的分離材料，其特征在于式1中的Y為
，而X＝NR2R3，其中R2和R3各為烷基、烷氧基烷基、氰基烷基、氨基烷基、一烷基氨烷基或二烷基氨烷基、三烷基氨烷基、羧烷基、磺酸烷基，烷基中各有多至10個(gè)碳原子。不被取代的或被一個(gè)或幾個(gè)烷基、烷氧基、烷氧烷基、氰基、氰烷基、氨烷基、氨基、一烷基氨基或二烷基氨基、一烷基氨基烷基或二烷基氨基烷基、三烷基氨基、三烷基氨烷基、羧基、羧烷基、磺酸基、磺酸烷基、醋酸基或乙酰氨基，被取代的苯基，在烷基中有多至10個(gè)碳原子。一個(gè)帶有5-10個(gè)碳原子的環(huán)基或雙環(huán)基，其中一個(gè)或幾個(gè)CH-基或CH2-基被N或NH，N或NH和S，或N或NH和O取代?；蛞粋€(gè)-(CH2)n-SO2-(CH2)nS(CH2)nOH結(jié)構(gòu)的硫砜化合物，其中n＝2-6，而R2和R3基之一也可以是H。其中R2和R3可這樣相互配合;要么兩個(gè)基都是酸性或堿性要么一個(gè)基或二個(gè)基是中性。
4.按照權(quán)利要求1所述的分離材料，其特征在于式1中的Y為-CH2NH2或-CH2NR2R3，該處理R2和R3具有權(quán)利要求1給定的意義。
5.按照權(quán)利要求1所述的分離材料，其特征在于式1中的Y為-CH、-CHO或-OH。
6.以含有羥基的載體為基礎(chǔ)，載體表面涂有在鈰(Ⅳ)離子存在下通過(guò)接枝共聚以共價(jià)鍵結(jié)合的聚合物的分離材料的制備方法，其特征在于將含有羥基的載體粒子懸浮在式Ⅱ和/或式Ⅲ所示的單體溶液中并使之聚合，而且必要時(shí)將所得的產(chǎn)品繼而轉(zhuǎn)化成帶有羥基的分離材料。CR＊R＊＊＝CR1-Y Ⅱ式中R1，R＊和R＊＊各為H或CH3，Y為
，-CN，-CHO，-OCOCHR5R6，-CH2NH2或-CH2NR2R3，X為-OH，-NR2R3或OR4，R2和R3各為一個(gè)烷基、苯基、苯基烷基或烷基苯基，在烷基中有多至10個(gè)碳原子，而這些基中可被烷氧基、氰基、氨基、一烷氨基或二烷氨基、三烷氨基、羧基、磺酸基、醋酸基或乙酰氨基進(jìn)行一次或多次取代。一個(gè)有5-10個(gè)碳原子的環(huán)基或雙環(huán)基，其中一個(gè)或幾個(gè)CH-基或CH2-基被N或NH，N或NH和S，或N或NH和O取代?；蛞粋€(gè)-(CH2)n-SO2-(CH2)nS(CH2)nOH結(jié)構(gòu)的硫砜化合物，其中n＝2-6，而R2和R3基之一也可以是H。這里R2和R3可這樣相互配合;要么兩個(gè)基都是酸性或堿性要么一個(gè)基或二個(gè)基是中性。R4為一個(gè)烷基、苯基、苯基烷基或烷基苯基，在烷基中有多至10個(gè)碳原子，這些基中可被烷氧基、氰基、羧基、磺酸基或醋酸基進(jìn)行一次或多次取代。而R5和R6各為H或有多至5個(gè)碳原子的烷基
一個(gè)帶有5-10個(gè)碳原子的環(huán)基或雙環(huán)基，其中一個(gè)或多個(gè)CH基或CH2基由N或NH，N或NH和S或N或NH和O取代?；蛞粋€(gè)-(CH2)n-SO2-(CH2)nS(CH2)nOH結(jié)構(gòu)的硫砜化合物，其中n＝2-6，而R2和R3基之一也可以是H。其中R2和R3可這樣相互配合;要么兩個(gè)基都是酸性或堿性要么一個(gè)基或二個(gè)基是中性，n為2至100，而R4為一個(gè)烷基、苯基、苯烷基或烷苯基，在烷基上有多至10個(gè)碳原子，這些基中可被烷氧基、氰基、羧基、磺酸基或醋酸基進(jìn)行一次或多次取代。本發(fā)明的分離材料可用于分離高分子，尤其是用于生物聚合物的分級(jí)。分離和凈化生物高分子如核酸、蛋白質(zhì)、酶、亞細(xì)胞單元、縮氨酸、單克隆抗體或完整細(xì)胞對(duì)基因工程和生物工程有重要意義。對(duì)于生物高聚物的一些分離方法在文獻(xiàn)中已有敘述。例如已知，在多水的聚乙二醇-葡聚糖兩相體系中的核酸的混合物和蛋白質(zhì)混合物可用逆流分配方法進(jìn)行分離(P.A.Albertson(1971)，2nd Ed.，Almquist & Wiksell，Stockholm)，在EP0154246中將兩相體系中生物高聚物分配色層分離法的相載體作為這方面的繼續(xù)發(fā)展做了說(shuō)明。相載體是由非吸附的、在相體系中不溶解的基礎(chǔ)載體粒子所組成，基礎(chǔ)載體粒子的表面涂上一層對(duì)于相體系的一個(gè)相有親合力的粘附牢固的物質(zhì)(例如化學(xué)結(jié)合的聚丙烯酰胺)。使用離子交換劑將一些生物高分子進(jìn)行分級(jí)，也是已知的。常用的材料由帶有相應(yīng)官能團(tuán)的高聚物組成，例如聚甲基丙烯酸酯，聚苯乙烯、瓊脂糖、交聯(lián)的葡聚糖或硅膠。但這些材料的溶解力和結(jié)合容量常常很不令人滿(mǎn)意，而要分離的生物分子經(jīng)常變性或不再能完全洗提出來(lái)。本發(fā)明的目的在于開(kāi)發(fā)能在色層分離法中通用的、可將生物高聚物分級(jí)的分離材料，該分離材料沒(méi)有上述的缺點(diǎn)，也就是說(shuō)，該分離材料能與要分離的分子結(jié)合，結(jié)合容量高，完全可逆而不變性。意外地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明分離材料能滿(mǎn)足上述條件，而且適用于高分子分級(jí)，特別是適用于生物聚合物分級(jí)。這些分離材料普遍用于親合色層分離法、反相色層分離法或疏水色層分離法或特別適用于離子交換色層分離法。所以本發(fā)明的對(duì)象是以含有羥基的載體為基礎(chǔ)的分離材料，載體的表面涂有用共價(jià)鍵結(jié)合的聚合物，其特征在于聚合物含有式Ⅰ所示的相同的或不同的重復(fù)單元。本發(fā)明另一對(duì)象是以含有羥基的載體為基礎(chǔ)，載體表面涂有用共價(jià)鍵結(jié)合的聚合物的分離材料的制造方法。通過(guò)在鈰(Ⅳ)離子存在下的接技結(jié)合，即在鈰存在下使含有羥基的載體粒子懸浮在式Ⅱ和/或式Ⅲ所示的單體溶液中，并進(jìn)行聚合，并在這種情況下，接著將由此得到的產(chǎn)品轉(zhuǎn)化成帶有羥基的分離材料。CR＊R＊＊＝CR1-Y Ⅱ式中R1，R＊和R＊＊各為H或CH3，Y為
，-CN，-CHO，-OCOCHR5R6，-CH2NH2或-CH2NR2R3，X為-OH，-NR2R3或OR4，R2和R3各為一個(gè)烷基、苯基、苯基烷基或烷基苯基，在烷基中有多至10個(gè)碳原子，而這些基中可被烷氧基、氰基、氨基、一烷氨基或二烷氨基、三烷銨基、羧基、磺酸基、醋酸基或乙酰氨基進(jìn)行一次或多次取代。一個(gè)有5-10個(gè)碳原子的環(huán)基或雙環(huán)基，其中一個(gè)或幾個(gè)CH-基或CH2-基被N或NH，N或NH和S，或N或NH和O取代?；蛞粋€(gè)-(CH2)n-SO2-(CH2)nS(CH2)nOH結(jié)構(gòu)的硫砜化合物，其中n＝2-6，而R1和R2基之一也可以是H。其中R2和R3可這樣相互配合;要么兩個(gè)基都是酸性或堿性要么一個(gè)基或二個(gè)基是中性。R4為一個(gè)烷基、苯基、苯基烷基或烷基苯基，在烷基中有多至10個(gè)碳原子，這些基中可被烷氧基、氰基、羧基、磺酸基或醋酸基進(jìn)行一次或多次取代。R5和R6各為H或有多至5個(gè)碳原子的烷基。
式中R＊和R1為H或CH3，
7.按權(quán)利要求6所述分離材料的制備方法，其特征在于使式Ⅱ和/或Ⅲ所示的不同單體進(jìn)行共聚合。
8.按權(quán)利要求1至5的至少一項(xiàng)所述的分離材料應(yīng)用于生物高分子的分級(jí)。
9.按權(quán)利要求1至5的至少一項(xiàng)所述的分離材料應(yīng)用于親和色層分離法或離子交換色層分離法中。
全文摘要
本發(fā)明涉及以含有羥基的載體為基礎(chǔ)的分離材料，以及將此材料用于生物高聚物的分級(jí)。載體的表面涂有用共價(jià)鍵結(jié)合的聚合物，而聚合物含有式I所示的相同的或不同的重復(fù)單元。
文檔編號(hào)B01D15/08GK1036516SQ8910187
公開(kāi)日1989年10月25日 申請(qǐng)日期1989年3月1日 優(yōu)先權(quán)日1988年3月31日
發(fā)明者沃那·牧勒, 焦基姆·金克爾 申請(qǐng)人:默克專(zhuān)利股份有限公司