專(zhuān)利名稱(chēng)：用于從血漿中去除致病抗體及其復(fù)合物的蛋白免疫吸附介質(zhì)的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種ProteinA免疫吸附介質(zhì)的合成方法。具體的說(shuō)是以SepharoseCL-4B瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，采用環(huán)氧氯丙烷活化的方法，用氨基作為開(kāi)環(huán)試劑，醛基作為偶聯(lián)基團(tuán)與基因重組Protein A進(jìn)行共價(jià)連接。這種合成方法無(wú)毒無(wú)害，Protein A與基質(zhì)結(jié)合的可靠性高，對(duì)致病抗體及其復(fù)合物的吸附效果好。
免疫吸附療法是近年來(lái)興起的一種治療疑難病癥的新方法，其目的是通過(guò)在體外建立的人體血液循環(huán)支路使血液通過(guò)免疫吸附柱吸附除去患者血液中的致病物質(zhì)，凈化人體內(nèi)環(huán)境，達(dá)到治療疾病的目的。免疫吸附柱中含有的免疫吸附劑可與血液中的致病物質(zhì)特異結(jié)合，而對(duì)血液中的其它成分則無(wú)損害。由于免疫吸附療法是直接從血液中去除致病物質(zhì)，對(duì)于急危病人和惡性病癥如癌癥、艾滋病、自身免疫性疾病、內(nèi)毒素休克等療效顯著，副作用小。國(guó)外應(yīng)用免疫吸附的方法已成功地治療了幾千個(gè)病例，達(dá)到了搶救危重病人，延長(zhǎng)病人生命的目的。免疫吸附治療的關(guān)鍵是免疫吸附柱的研制，具體的說(shuō)就是免疫吸附劑的選擇及其與固載基質(zhì)的偶聯(lián)，免疫吸附劑與固載的固相基質(zhì)形成的免疫吸附介質(zhì)必須符合如下要求，才能進(jìn)行人體治療(1)吸附介質(zhì)應(yīng)具有較高的選擇性，非特異吸附要?。?2)吸附介質(zhì)的血液相容性要好，即無(wú)毒、不溶解、不激活補(bǔ)體和凝血系統(tǒng)、不致敏；(3)穩(wěn)定性好，便于儲(chǔ)存和消毒。
Protein A是某些金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上的一種蛋白質(zhì)，其分子量為42000，其氨基末端有4個(gè)高度類(lèi)同的Fc結(jié)合區(qū)，可與人血漿中的IgG及其免疫復(fù)合物的Fc段特異結(jié)合，Protein A與IgG及其免疫復(fù)合物結(jié)合后叉可被pH2.3～2.5的酸性溶液解離。人類(lèi)的很多疾病都是由抗體和免疫復(fù)合物引起，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血小板減少性紫癜、重癥肌無(wú)力等，這些都是無(wú)法治愈的疑難病癥，利用Protein A與抗體和免疫復(fù)合物特異結(jié)合的特性從血液中除去這些致病物質(zhì)，將明顯地緩解病情。國(guó)外在這方面進(jìn)行了大量的動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)，取得了很好的療效。現(xiàn)在臨床上使用的商品化的Protein A免疫吸附柱(瑞典GABRO公司)采用的基質(zhì)是Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠，與Protein A的偶聯(lián)方式為溴化氰活化偶聯(lián)，這種活化方法的缺點(diǎn)在于溴化氰是劇毒物質(zhì)，合成過(guò)程對(duì)人體和環(huán)境危害較大，另一個(gè)缺點(diǎn)是有些實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用溴化氰方法偶聯(lián)的蛋白基團(tuán)容易脫落(Tesser等，1974)，因而這一合成工藝不甚理想。
本發(fā)明的目的在于提供一種用于從血漿中去除致病抗體及其復(fù)合物的蛋白免疫吸附介質(zhì)的合成方法，該方法可以取代溴化氰活化工藝，無(wú)毒、無(wú)害，且偶聯(lián)Protein A效果好。
本發(fā)明提供了一種用于從血漿中去除致病抗體及其復(fù)合物的蛋白免疫吸附介質(zhì)的合成方法，其特征在于合成過(guò)程依下述步驟進(jìn)行(1)用環(huán)氧氯丙烷活化Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠，反應(yīng)溫度40～80℃，時(shí)間1～4小時(shí)，環(huán)氧氯丙烷充分過(guò)量；(2)用環(huán)氧Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠與Protein A直接反應(yīng)合成免疫吸附介質(zhì)，反應(yīng)溫度為24～26℃，反應(yīng)時(shí)間16～20小時(shí)，Protin A充分過(guò)量，pH值控制在9～10范圍內(nèi)；用甘氨酸乙酯鹽酸鹽或乙醇氨封閉未反應(yīng)活性基團(tuán)；放入保存液中。
本發(fā)明還提供了另一種用于從血漿中去除致病抗體及其復(fù)合物的蛋白免疫吸附介質(zhì)的合成方法，其特征在于合成過(guò)程如下(1)用環(huán)氧氯丙烷活化Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠，反應(yīng)溫度40～80℃，時(shí)間1～4小時(shí)，環(huán)氧氯丙烷充分過(guò)量；(2)用氨基或雙氨基試劑對(duì)帶有活性環(huán)氧基團(tuán)的Sepherose CL-4B進(jìn)行開(kāi)環(huán)反應(yīng)，雙氨基試劑選自乙二胺、丁二胺、己二胺之一種，反應(yīng)溫度為50～80℃，反應(yīng)時(shí)間1～4小時(shí)，氨水或雙氨基試劑充分過(guò)量；(3)用雙醛基試劑與帶有活性氨基的Sepharose CL-4B反應(yīng)得到醛基Sepharose CL-4B，雙醛基試劑選自戍二醛、對(duì)苯二甲醛之一種，反應(yīng)溫度為30～40℃，雙醛基試劑充分過(guò)量，pH值控制在7.0～9.0；(4)用醛基Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠與Protein A直接反應(yīng)合成免疫吸附介質(zhì)，反應(yīng)溫度在24～26℃，反應(yīng)時(shí)間16～20小時(shí)，Protein A充分過(guò)量，pH值控制在7.0～8.5范圍內(nèi)；
用甘氨酸乙酯鹽酸鹽或乙醇氨封閉未反應(yīng)活性基團(tuán)；用硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉還原反應(yīng)中產(chǎn)生的雙鍵；放入保存液中。
本發(fā)明中采用0.2mol/l pH＝2.3甘氨酸-HCl緩沖液作為洗脫液，用0.1mol/lpH＝7.4的磷酸緩沖液作平衡液，用含0.02～0.1％迭代鈉的0.1mol/l pH＝7.4的磷酸緩沖液作保存液。
本發(fā)明提供的上述兩種方法中第二種更為優(yōu)越。
本發(fā)明中采用的基質(zhì)為Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠，采用的Protein A為基因重組產(chǎn)品，純度達(dá)98％以上。實(shí)驗(yàn)證明Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠是一種優(yōu)良的免疫吸附基質(zhì)，滿(mǎn)足血液凈化對(duì)免疫吸附介質(zhì)的要求，基因重組Protein A比從金黃色葡萄球菌中提純的Protein A純度高、毒性小、價(jià)格低。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中活性基團(tuán)與介質(zhì)間的鍵合均為共價(jià)連接，將Protein A泄漏降到最低。下面通過(guò)實(shí)施例詳述本發(fā)明。
實(shí)施例1帶有活性環(huán)氧基團(tuán)的Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠的合成在裝有攪拌器、溫度計(jì)及冷凝器的100ml三口燒瓶中，加Sepharose CL-4B10ml，1mol/l NaOH溶液10.5ml，加熱升溫至40℃，加入環(huán)氧氯丙烷10ml，在40℃恒溫反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)過(guò)程中要攪拌均勻。停止反應(yīng)，降至室溫后，用大量的水洗去未反應(yīng)的環(huán)氧氯丙烷和氫氧化鈉，濾干備用。
實(shí)施例2帶有氨基活性基團(tuán)的Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠的合成在裝有攪拌器、溫度計(jì)及冷凝器的100ml三口燒瓶中，加帶有活性環(huán)氧基團(tuán)的Sepharose CL-4B 10ml，加入己二胺5ml，加去離子水20ml，50℃恒溫反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)停止后，用大量的水洗至中性，濾干備用。
實(shí)施例3帶有醛基活性基團(tuán)的Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠的合成在裝有攪拌器、溫度計(jì)及冷凝器的100ml三口燒瓶中，加帶有活性氨基的Sepharose CL-4B 10ml，加入戍二醛4ml，用硼酸鹽或磷酸鹽作緩沖液，pH值控制在9.0范圍內(nèi)，加入緩沖液20ml，30℃恒溫反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)停止后，用大量的水洗去所用的戍二醛，濾干備用。
實(shí)施例4由環(huán)氧Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠與Protein A直接反應(yīng)合成免疫吸附介質(zhì)在裝有攪拌器、溫度計(jì)及冷凝器的100ml三口燒瓶中，加環(huán)氧Sepharose CL-4B 10ml，0.5mol/l的NaHCO3-Na2CO3緩沖溶液20ml，pH＝10，將60mg Protein A加入其中，在25℃恒溫反應(yīng)20小時(shí)，停止反應(yīng)，回收未反應(yīng)的Protein A，用甘氨酸乙酯鹽酸鹽或乙醇氨封閉未反應(yīng)活性基團(tuán)，用水沖洗干凈未反應(yīng)組分，保存在50mmol/l pH＝7.0的磷酸緩沖液中，加入0.02～0.1％的迭代鈉作防腐劑。用紫外法吸光度檢測(cè)Protein A的鍵合量為2.0mg/ml，結(jié)合IgG量15mg/ml。
實(shí)施例5醛基Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠與Protein A直接反應(yīng)合成免疫吸附介質(zhì)在裝有攪拌器、溫度計(jì)及冷凝器的100ml三口燒瓶中，加醛基Sepharose CL-4B 10ml，加入0.1mol/l的磷酸或硼酸緩沖液20ml，pH值控制在7.0～8.5范圍內(nèi)，加入60mg Protein A，在25℃恒溫反應(yīng)20小時(shí)，停止反應(yīng)，回收未反應(yīng)的Protein A，用甘氨酸乙酯鹽酸鹽或乙醇氨封閉未反應(yīng)活性基團(tuán)，用硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉還原反應(yīng)中產(chǎn)生的雙鍵，用水沖洗干凈未反應(yīng)組分，保存在0.1mol/lpH＝7.4的磷酸緩沖液中，加入0.02～0.1％的迭代鈉作防腐劑。用紫外法檢測(cè)Protein A的鍵合量為4.0mg/ml，結(jié)合IgG量25mg/ml。
實(shí)施例6 Protein A免疫吸附柱的離體實(shí)驗(yàn)按上述合成方法合成Protein A免疫吸附介質(zhì)60ml，其中Protein A的鍵合量為168mg，裝于Φ40×50的柱中，用生理鹽水充分沖洗柱子，將體重25Kg的狗麻醉，從狗的股動(dòng)脈中抽取肝素化血液600ml，分離出血漿300ml，以30ml/min的速度過(guò)柱后與血球混合一同注入狗的股靜脈中。用生理鹽水沖出柱中血漿直到在280nm的吸收值為零，用0.2mol/l pH＝2.3甘氨酸-HCl緩沖液洗脫柱中吸附的抗體及其免疫復(fù)合物，由于是健康的狗，免疫復(fù)合物很少，吸附物主要為抗體，檢測(cè)洗脫下的抗體量為1.08g，用0.1mol/l pH＝7.4的磷酸緩沖液平衡柱子，加入0.02～0.1％的迭代鈉作防腐劑備用。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中及實(shí)驗(yàn)后，狗的生理狀態(tài)未發(fā)生改變。
實(shí)施例7 Protein A免疫吸附柱在體外建立血液循環(huán)支路進(jìn)行連續(xù)實(shí)驗(yàn)按上述合成方法合成Protein A免疫吸附介質(zhì)120ml，等量裝入兩根Φ40×50的柱中，其中每根柱子Protein A的鍵合量均為168mg。用生理鹽水充分沖洗柱子，將體重13Kg的狗麻醉，實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)脈端、靜脈端的切換管路連接好，充分熏蒸達(dá)到無(wú)菌要求，接好免疫吸附柱，用生理鹽水大量沖洗，置換出里面的疊代鈉，管路、柱子全部肝素化。狗全身麻醉后，頸動(dòng)脈插管測(cè)血壓、脈博、血流等，血從狗的后腿股動(dòng)脈引出，經(jīng)膜分離器將血液分成血球、血漿兩部分，血漿流過(guò)柱1系統(tǒng)，柱2系統(tǒng)關(guān)閉，過(guò)柱血漿與血球在混合器中混合，輸入狗體內(nèi)，運(yùn)行10～15分鐘以后，關(guān)閉柱1系統(tǒng)入口，開(kāi)起柱2系統(tǒng)，將柱1系統(tǒng)中的血漿用約50ml生理鹽水頂出，進(jìn)入混合器。關(guān)閉柱1系統(tǒng)出口，柱1系統(tǒng)進(jìn)行洗脫、平衡過(guò)程，先通過(guò)250ml的洗脫液洗去吸附的蛋白，再用約150ml的平衡緩沖液平衡柱子，用約150ml的生理鹽水沖洗掉平衡緩沖液，再生過(guò)程完畢。開(kāi)起柱1系統(tǒng)入口，同時(shí)關(guān)閉柱2系統(tǒng)入口，重復(fù)以上操作。每個(gè)柱各切換3次，其間共取血樣4次進(jìn)行各種指標(biāo)的檢測(cè)。兩個(gè)血泵流速，A泵80ml/min，B泵40ml/min。指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)1小時(shí)的實(shí)驗(yàn)，從狗的血漿中共去除6.5克抗體，狗的生理指標(biāo)、生化指標(biāo)、血常規(guī)等未發(fā)生變化，麻醉蘇醒后，生理活動(dòng)恢復(fù)正常。同一條狗進(jìn)行兩次實(shí)驗(yàn)，獲得了類(lèi)似的結(jié)果。
以上結(jié)果證實(shí)，Protein A免疫吸附柱具有較好的安全性和可靠性。
權(quán)利要求
1.一種用于從血漿中去除致病抗體及其復(fù)合物的蛋白免疫吸附介質(zhì)的合成方法，其特征在于合成過(guò)程依下述步驟進(jìn)行(1)用環(huán)氧氯丙烷活化Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠，反應(yīng)溫度40～60℃，時(shí)間1～4小時(shí)，環(huán)氧氯丙烷充分過(guò)量；(2)用環(huán)氧Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠與Protein A直接反應(yīng)合成免疫吸附介質(zhì)，反應(yīng)溫度為24～26℃，反應(yīng)時(shí)間16～20小時(shí)，Protein A充分過(guò)量，pH值控制在9～10范圍內(nèi)；用甘氨酸乙酯鹽酸鹽或乙醇氨封閉未反應(yīng)活性基團(tuán)；放入保存液中。
2.一種用于從血漿中去除致病抗體及其復(fù)合物的蛋白免疫吸附介質(zhì)的合成方法，其特征在于合成過(guò)程如下(1)用環(huán)氧氯丙烷活化Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠，反應(yīng)溫度40～80℃，時(shí)間1～4小時(shí)，環(huán)氧氯丙烷充分過(guò)量；(2)用氨基或雙氨基試劑對(duì)帶有活性環(huán)氧基團(tuán)的Sepherose CL-4B進(jìn)行開(kāi)環(huán)反應(yīng)，雙氨基試劑選自乙二胺、丁二胺、己二胺之一種，反應(yīng)溫度為50～80℃，反應(yīng)時(shí)間1～4小時(shí)，氨水或雙氨基試劑充分過(guò)量；(3)用雙醛基試劑與帶有活性氨基的SepharoseCL-4B反應(yīng)得到醛基SepharoseCL-4B，雙醛基試劑選自戍二醛、對(duì)苯二甲醛之一種，反應(yīng)溫度為30～40℃，雙醛基試劑充分過(guò)量，pH值控制在7.0～9.0；(4)用醛基Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠與Protein A直接反應(yīng)合成免疫吸附介質(zhì)，反應(yīng)溫度在24～26℃，反應(yīng)時(shí)間16～20小時(shí)，Protein A充分過(guò)量，pH值控制在7.0～8.5范圍內(nèi)；用甘氨酸乙酯鹽酸鹽或乙醇氨封閉未反應(yīng)活性基團(tuán)；用硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉還原反應(yīng)中產(chǎn)生的雙鍵；放入保存液中。
全文摘要
一種用于從血漿中去除致病抗體及其復(fù)合物的蛋白免疫吸附介質(zhì)的合成方法,合成過(guò)程依下述步驟進(jìn)行:(1)用環(huán)氧氯丙烷活化Sepharose CL－4B瓊脂糖凝膠,反應(yīng)溫度40～80℃,時(shí)間1～4小時(shí),環(huán)氧氯丙烷充分過(guò)量;(2)用環(huán)氧Sepharose CL－4B瓊脂糖凝膠與ProteinA直接反應(yīng)合成免疫吸附介質(zhì),反應(yīng)溫度為24～26℃,反應(yīng)時(shí)間16～20小時(shí),ProteinA充分過(guò)量,pH值控制在9～10范圍內(nèi);用甘氨酸乙酯鹽酸鹽或乙醇氨封閉未反應(yīng)活性基團(tuán);放入保存液中。本發(fā)明可以取代溴化氰活化工藝,無(wú)毒、無(wú)害,且偶聯(lián)Protein A效果好。
文檔編號(hào)B01J20/26GK1271621SQ99112880
公開(kāi)日2000年11月1日 申請(qǐng)日期1999年4月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月26日
發(fā)明者賈凌云, 楊利, 鄒漢法, 張玉奎 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所