一種羰基化合物的親和色譜介質(zhì)及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及色譜介質(zhì)的制備，具體涉及一種羰基化合物的親和色譜介質(zhì)及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在中藥材質(zhì)量研宄領(lǐng)域里，如欲主觀、有效地控制中藥材的相應(yīng)單一或者多個有效成分含量，以達(dá)到穩(wěn)定中醫(yī)藥療效或提高療效等目的，最行之有效的思路之一是開展中藥材原植物代謝網(wǎng)絡(luò)研宄。然而如何構(gòu)建中藥原植物體內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)便成為解決問題的瓶頸。目前國內(nèi)外許多專家學(xué)者已開展大量的中藥原植物體內(nèi)分子生物學(xué)、生物化學(xué)等方面的研宄。如開展中藥原植物體生源代謝途徑研宄、生物合成代謝關(guān)鍵酶研宄等，取得了一些突破性進(jìn)展。本發(fā)明是基于中藥原植物體代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建新方法的這一思路，制備一種以中藥成分為“親和中心”的親和色譜介質(zhì)，然后借助中藥成分代謝酶組學(xué)或中藥超分子理論的相關(guān)科學(xué)，運(yùn)用中藥成分與其原植物體代謝酶的天然親和力，從中藥原植物體內(nèi)所有代謝酶蛋白中釣取與該成分的相關(guān)代謝酶系，為進(jìn)一步構(gòu)建植物代謝網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的第一目的在于運(yùn)用羰基類中藥成分與其相關(guān)酶系的天然親好能力，研宄得到一種羰基化合物的親和色譜介質(zhì)的制備方法，為其酶系的獲取技術(shù)奠定基礎(chǔ)。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0005]一種羰基化合物的親和色譜介質(zhì)的制備方法，以柱層析硅膠為原料，在酸性環(huán)境中利用柱層析硅膠分子中的羥基與硅烷偶聯(lián)劑進(jìn)行偶聯(lián)，再經(jīng)強(qiáng)酸水解得到表面含有羥基的活化硅膠，后加入含羰基的中藥單一成分進(jìn)一步反應(yīng)，即得羰基化合物的親和色譜介質(zhì)。
[0006]其中，所述的柱層析硅膠選自已知的市售產(chǎn)品，優(yōu)選為大孔C型硅膠，更選100?300目，以制備得到更理想的羰基化合物的親和色譜介質(zhì)。
[0007]其中，所述的硅烷偶聯(lián)劑可選采用Y-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷或Y —氨丙基三乙氧基硅烷；優(yōu)選為γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，其在具體的制備過程中，能實(shí)現(xiàn)最理想的偶聯(lián)作用。
[0008]更具體而言，本發(fā)明所述的方法包括如下步驟:
[0009](I)取柱層析硅膠，用2?4倍量(優(yōu)選3倍量)的4.0-8.0moI/L鹽酸浸泡處理30?50min，抽濾，經(jīng)去離子水洗滌后置100?120°C的恒溫干燥箱中干燥0.5_2h ；
[0010](2)向干燥后的硅膠中加入pH4.0?6.0的醋酸鈉緩沖液和硅烷偶聯(lián)劑形成反應(yīng)體系，其中，所述硅膠、緩沖液及硅烷偶聯(lián)劑的用量按g:ml:ml計(jì)為50:100:2?5 ;所述反應(yīng)體系在105?120°C油浴下反應(yīng)60?120min，濾出產(chǎn)物；
[0011](3)將所述產(chǎn)物置于55?65°C的油浴下，用0.1?0.2moL/L的強(qiáng)酸水解4?6h，抽濾，濾餅先用蒸餾水洗滌，再用甲醇溶液洗滌干凈后，即得到表面含有羥基的活化硅膠；
[0012](4)將含羰基的中藥單一成分溶于有機(jī)溶劑，充分?jǐn)嚢韬?，加入所述活化硅膠在室溫下攪拌反應(yīng)10?15h，其中含羰基的中藥單一成分為活化硅膠用量比的0.02-0.05倍，優(yōu)選0.041倍；將反應(yīng)所得產(chǎn)物進(jìn)行抽濾分離后，用PBS緩沖溶液洗滌即得羰基化合物的親和色譜介質(zhì)。
[0013]其中，所述步驟(I)具體為:取柱層析硅膠，用3倍量的6.0moI/L鹽酸浸泡處理40min，抽濾，經(jīng)去離子水洗滌后置100?120°C的恒溫干燥箱中干燥lh。
[0014]其中，所述緩沖液pH4.7的醋酸鈉，所述硅膠、緩沖液及硅烷偶聯(lián)劑的用量按g:ml:ml 計(jì)最優(yōu)為 50:100:2。
[0015]本發(fā)明所述的方法，所述步驟(2)中，反應(yīng)體系在110°C油浴下反應(yīng)90min。
[0016]本發(fā)明所述的方法，步驟(3)中所述的強(qiáng)酸包括硫酸、鹽酸及其他常見強(qiáng)酸類，優(yōu)選硫酸。
[0017]本發(fā)明所述的方法，所述的含羰基的中藥單一成分為含酮基的中藥成分，如黃酮類、蒽醌類化合物，優(yōu)選甲基正壬酮。
[0018]本發(fā)明所述的方法，所述PBS緩沖溶液的pH7.0?8.0，濃度為0.lmol/L。
[0019]本發(fā)明所述的方法，步驟(4)中優(yōu)選進(jìn)一步加入苯和對甲苯磺酸，其中，苯作為吸水劑，對甲苯磺酸是催化劑。當(dāng)羰基化合物與鄰二醇(γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷等硅烷偶聯(lián)劑與硅膠鍵合后，在硫酸環(huán)境中水解后形成鄰二醇)發(fā)生鍵合反應(yīng)時，苯與對甲苯磺酸的加入有利于反應(yīng)的進(jìn)行，二者的用量為常規(guī)，屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握，本發(fā)明對此不作特別限定。
[0020]本發(fā)明所述的方法，步驟⑷中所述有機(jī)溶劑為甲醇或乙醇，優(yōu)選無水乙醇。
[0021]本發(fā)明的第二目的在于保護(hù)上述制備方法得到的羰基化合物的親和色譜介質(zhì)。
[0022]本發(fā)明所得羰基化合物的親和色譜介質(zhì)具有特異性吸附其相關(guān)代謝酶的特點(diǎn)，可有效用于從中藥原植物體總代謝酶蛋白中“捕獲”該含羰基類化合物成分的相應(yīng)代謝蛋白酶系，可達(dá)到良好的效果。
[0023]使用該介質(zhì)時，可按如下步驟:①將該中藥材原植物體的所有活性總蛋白提取出來(注意采用適當(dāng)?shù)奶崛》椒ㄊ沟每偟鞍踪|(zhì)未失活，具體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握，本發(fā)明對此不作特別限定)；?將上述活性總蛋白制成凍干粉或者制成高濃度的蛋白質(zhì)濃縮提取液將所得的親和色譜介質(zhì)制備成親和色譜柱；④將步驟②所得總蛋白樣品上樣，用去離子水和PBS緩沖液洗脫，從而捕獲得到該與中藥單一成分相關(guān)的原植物代謝蛋白酶系，完成有效分離。
[0024]或者將制備所得的親和色譜介質(zhì)直接放置活性總蛋白提取液中捕獲，經(jīng)過過濾、洗脫等程序，捕獲得到該與成分相關(guān)的原植物代謝蛋白酶系。
[0025]本發(fā)明所述制備方法本身具備了收率產(chǎn)率高、工序簡單、操作簡便等特點(diǎn)?？上驳氖牵么朔ㄖ苽渌玫募谆赏H和色譜介質(zhì)能有效地捕獲相應(yīng)的代謝蛋白酶。本發(fā)明僅從中藥成分中含羰基化合物(含C = O鍵)成分為突破口，實(shí)現(xiàn)該類親和色譜介質(zhì)的制備。因此，本發(fā)明對于中藥材的質(zhì)量植物代謝網(wǎng)絡(luò)的“面”控制具備積極意義。
【附圖說明】
[0026]圖1為各對象樣品的電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0028]實(shí)施例1
[0029]以魚腥草中甲基正壬酮為羰基類化合物實(shí)例制備其親和色譜介質(zhì)。
[0030]1.取柱層析硅膠適量，用3倍量的6.0mol/L鹽酸浸泡處理約40min，抽濾后，用去離子水洗滌后置100?120°C的恒溫干燥箱中干燥Ih左右，置干燥器中保存?zhèn)溆茫?br>[0031]2.取上述干燥后的硅膠約50g置三頸瓶內(nèi)，滴加緩沖液(PH4.0?6.0)約10mUr-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷約2.0mL，在105?120°C油浴下反應(yīng)90min左右，濾出產(chǎn)物；
[0032]3.再將上述濾出物置于55?65°C的油浴下，用0.1?0.2moL/L硫酸水解5h左右后抽濾，濾餅先用蒸餾水洗滌，再用甲醇溶液洗滌干凈后，即得到表面含有羥基的活化硅膠。
[0033]4.取一燒杯，加入約5mL無水乙醇、0.1mL甲基正壬酮，充分?jǐn)嚢?.5h左右后，加入上述活化硅膠約2.0g、苯1.0mL和少許對甲苯磺酸，在室溫下攪拌12h后。將所得的產(chǎn)物進(jìn)行抽濾分離后，用0.lmol/L PBS緩沖溶液(PH7.0?8.0)洗滌，得到鍵合有甲基正壬酮的活性硅膠親和色譜介質(zhì)。
[0034]利用本實(shí)施例所得的鍵合有甲基正壬酮的活性硅膠親和色譜介質(zhì)可有效用于從鮮魚腥草植株總代謝蛋白酶中捕獲與甲基正壬酮相關(guān)的代謝酶系，并洗脫分離獲得相應(yīng)的代謝酶。
[0035]實(shí)施例2
[0036]與實(shí)施例1相比，區(qū)別點(diǎn)僅在于:本實(shí)施例所述方法包括如下步驟:
[0037]1.取柱層析硅膠適量，用2倍量的8.0mol/L鹽酸浸泡處理