變性），這可對(duì)容器中的樣品的溫度產(chǎn)生影響。如果該溫度與預(yù)期溫度不 同，實(shí)際樣品溫度在時(shí)間標(biāo)尺（使用校準(zhǔn)曲線）上的位置將改變。例如，如果樣品比預(yù)期冷， 樣品的加熱時(shí)間將比預(yù)期長(zhǎng)，使得在將MRD 160置于模塊200中之后的任何特定時(shí)間，樣品 溫度都將低于預(yù)期。對(duì)這種潛在可變性來源的一種解決方法涉及在樣品中使用一個(gè)或多個(gè) 具有已知熔解溫度的校準(zhǔn)物（例如，分子信標(biāo)）。通常，使用兩個(gè)或更多個(gè)校準(zhǔn)物，它們各自 具有不同的已知熔解溫度。
[0146] 在已知溫度下，使自雜交信標(biāo)保持其發(fā)夾形狀的鍵斷裂，導(dǎo)致熒光團(tuán)與附接到信 標(biāo)的淬滅劑部分分離（熒光團(tuán)可以在與任何熒光團(tuán)相同或不同的波長(zhǎng)下因測(cè)試樣品而發(fā) 出熒光）。由于該分離，熒光團(tuán)的熒光變得可檢測(cè)，因?yàn)槠洳辉俦淮銣?。在校?zhǔn)物變得可檢 測(cè)時(shí)，樣品的溫度將是已知的。通常，根據(jù)校準(zhǔn)曲線預(yù)計(jì)在將MRD置于模塊中之后校準(zhǔn)物變 得可檢測(cè)的特定時(shí)間。當(dāng)校準(zhǔn)物在與預(yù)期時(shí)間不同的時(shí)間變得可檢測(cè)時(shí)，對(duì)校準(zhǔn)曲線的參 考將允許技術(shù)人員準(zhǔn)確地調(diào)節(jié)樣品的溫度軌線，從而準(zhǔn)確地對(duì)比樣品溫度與熒光測(cè)量值。 這通常導(dǎo)致RFU與溫度曲線沿著溫度軸改變，以根據(jù)實(shí)際樣品溫度準(zhǔn)確地繪制熔解曲線。
[0147] 此類校準(zhǔn)物雖然不是有效實(shí)踐本發(fā)明方法的必要條件，但它們通常消除了對(duì)主動(dòng) 監(jiān)測(cè)容器器皿中包含的樣品的溫度的需要。當(dāng)例如不同樣品類型、不同環(huán)境溫度、不同樣品 體積、不同容器器皿材料、不同容器器皿壁厚度、容器器皿與熱源之間的不同空氣間隙和/ 或其他來源的樣品間或樣品內(nèi)可變性存在時(shí)，此類校準(zhǔn)物可以有利地將單獨(dú)的熔解分布設(shè) 置到預(yù)定的、同步確定的或者是說已知的熔解曲線上。
[0148] 在容器器皿162的流體內(nèi)容物的溫度響應(yīng)的精度和重復(fù)性存在足夠置信度的情 況下，可以不必測(cè)量容器器皿162或容器器皿162內(nèi)容物的溫度。在此類情況下，可以記錄 樣品的熒光與時(shí)間數(shù)據(jù)并與已知基因型的熒光相對(duì)時(shí)間的曲線進(jìn)行比較。
[0149] 本發(fā)明不限于使用任何特定激發(fā)源或發(fā)射檢測(cè)器或其配置。用于結(jié)合本發(fā)明使用 的示例性信號(hào)檢測(cè)器400在圖13中示出。如圖13所示，該圖為信號(hào)檢測(cè)器的透視圖，檢測(cè) 器400包括外殼，該外殼包括檢測(cè)器外殼418和激發(fā)外殼402,兩者相對(duì)于彼此以直角連接 到透鏡和過濾器或光學(xué)器件外殼434。外殼組件402、418和434中的每一個(gè)可由例如機(jī)械 加工鋁制成，并且通過諸如螺釘?shù)暮线m緊固件彼此固定，并且優(yōu)選地經(jīng)過陽極化處理。激發(fā) 印刷電路板（"PCB"）406連接到激發(fā)外殼402的末端，并且檢測(cè)器PCB 422連接到檢測(cè)器 外殼418的末端。柔性電纜454將激發(fā)PCB 406與檢測(cè)器PCB 422連接。此類示例性信號(hào) 檢測(cè)器的詳細(xì)信息在先前并入的美國(guó)專利申請(qǐng)公布No. US20120221252中有所描述。
[0150] 在一個(gè)實(shí)施例中，信號(hào)檢測(cè)器包括熒光計(jì)，該熒光計(jì)被配置以通過在包含混合有 熒光染料的樣品的容器內(nèi)導(dǎo)向指定的相關(guān)激發(fā)波長(zhǎng)的光學(xué)激發(fā)信號(hào)來激發(fā)具體波長(zhǎng)（即 顏色）的熒光染料，以及檢測(cè)具有與具體染料的波長(zhǎng)或顏色相對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)的發(fā)射信號(hào)。 不同熒光染料以不同波長(zhǎng)激發(fā)。在本發(fā)明的一個(gè)多重應(yīng)用中，合適的染料包括羅丹明染 料四甲基-6-羅丹明（"TAMRA"）和四丙醇-6-羧基羅丹明（"R0X"），以及熒光素染料 6_羧基熒光素（"FAM"），并且它們各自均與DABCYL淬滅劑組合。其他合適的染料包括 例如5' -六氯熒光素亞磷酰胺（"HEX"）、2'，7' -二甲氧基-4'，5' -二氯-6-羧基熒光 素（"JOE"）、BIOSEARCH BLUE? (BG5-5088)、CAL FLUOR? 金 540、CAL FLUOR? 橙 560、CAL FLUOR? 紅 590、CAL FLUOR? 紅 610、CAL FLUOR?:紅 635、PULSAR? 650、 Quasar 670、Quasar 705等等。由于優(yōu)選的染料以不同波長(zhǎng)激發(fā)，每個(gè)信號(hào)檢測(cè)器400優(yōu) 選地受到調(diào)控，以在所需的激發(fā)波長(zhǎng)（即顏色）下或附近針對(duì)熒光計(jì)將要檢測(cè)的特定染料 發(fā)出激發(fā)光。因此，檢測(cè)器/熒光計(jì)的組件選擇在多種情況下將取決于信號(hào)檢測(cè)器400將 要針對(duì)的特定染料。
[0151] 熱焙分析
[0152] 示例性熱熔分析過程600的流程圖在圖14中示出。為執(zhí)行熱熔分析，在一個(gè)實(shí)施 例中,在步驟602中，將熱塊組件260加熱至例如90°C的穩(wěn)態(tài)高溫?？赏ㄟ^嵌入熱塊組件 260的溫度傳感器測(cè)量熱塊組件的溫度。在步驟604中，通過系統(tǒng)控制器控制下的容器傳送 機(jī)構(gòu)將MRD 160插入熱熔模塊200的容器固定器202中。在步驟606中，通過容器升降機(jī) 220將容器固定器202中裝載的MRD 160的容器器皿162下降到器皿接納熱組件242中， 使得保持內(nèi)容物的容器162的下端被設(shè)置在熱塊組件260的容器孔264中。在一個(gè)實(shí)施例 中，在熱熔模塊200內(nèi)提供MRD檢測(cè)傳感器225 (參見圖4)，以檢測(cè)插入MRD固定器202的 MRD的存在。傳感器225可包括例如任何類型的存在傳感器/開關(guān)，諸如光學(xué)傳感器、機(jī)械 傳感器、磁傳感器、電容傳感器，該傳感器可在接近MRD固定器202的與MRD插入固定器的 末端相對(duì)的末端的位置附接到壁218,以檢測(cè)MRD何時(shí)完全插入MRD固定器202。系統(tǒng)控制 器接收來自MRD檢測(cè)傳感器225的信號(hào)后，系統(tǒng)控制器生成用于使容器升降機(jī)220自動(dòng)將 MRD 160下降到器皿接納熱組件242中的命令。
[0153] 在步驟608中，MRD 160的容器器皿162停留于熱塊組件260內(nèi)，從而升高容器器 皿162的內(nèi)容物的溫度。在一個(gè)例子中，容器器皿162在熱塊組件260內(nèi)保持憑經(jīng)驗(yàn)確定 的停留時(shí)間，該停留時(shí)間足以使容器器皿162的內(nèi)容物達(dá)到高于預(yù)期熔解溫度（例如，高至 多幾°C)的溫度，諸如300秒（5分鐘）。盡管不希望受任何具體理論的束縛，但容器器皿 162中每一個(gè)的液體內(nèi)容物的溫度以反指數(shù)方式向受熱的熱塊組件260的溫度上升。
[0154] 在一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)容器器皿162首次下降到熱塊組件260內(nèi)時(shí)，容器器皿162的 內(nèi)容物的初始溫度為大約42°C。在其他實(shí)施例中，可通過在將容器器皿162下降到熱塊組 件260內(nèi)之前首先預(yù)熱容器內(nèi)容物來縮短執(zhí)行熱熔分析所需的時(shí)間。然而，應(yīng)當(dāng)注意避免 將容器器皿162的內(nèi)容物預(yù)熱至接近某一溫度的溫度，所述某一溫度約等于具有低G/C含 量并且包含不匹配性的雜交寡核苷酸或多核苷酸的熔解溫度。
[0155] 在一個(gè)實(shí)施例中，與步驟608同步，在步驟610中，信號(hào)檢測(cè)器400測(cè)量并記錄 隨著溫度上升容器162中每一個(gè)的液體內(nèi)容物中的一個(gè)或多個(gè)熒光團(tuán)的熒光RFU(t)。 為檢測(cè)單個(gè)樣品內(nèi)的多個(gè)熔解溫度，需要多個(gè)熒光顏色（染料）（每個(gè)熔解溫度一種顏 色）。圖16示出了五個(gè)不同熒光信號(hào)相對(duì)于溫度的導(dǎo)數(shù)相對(duì)溫度的曲線圖，如曲線圖 620,622,624,626,628所示。每個(gè)不同的曲線圖或線代表不同的熒光信號(hào)（顏色）。每條 線的峰值代表熒光相對(duì)于溫度的變化從正變?yōu)樨?fù)的拐點(diǎn)，由此指示熱熔溫度。在一個(gè)實(shí)施 例中，信號(hào)檢測(cè)器的每個(gè)通道對(duì)應(yīng)于不同的熒光顏色，因此，通過平移機(jī)構(gòu)320對(duì)信號(hào)檢測(cè) 器進(jìn)行分度，以相對(duì)于MRD 160的每個(gè)容器器皿162將每個(gè)信號(hào)接收通道依次放置到可操 作位置。在一個(gè)實(shí)施例中，以每0. 25秒一個(gè)通道的速率對(duì)信號(hào)檢測(cè)器400進(jìn)行分度，并且 每0. 125秒進(jìn)行一次信號(hào)測(cè)量。不同的離散信號(hào)測(cè)量值編譯成不同的熔解曲線，分別對(duì)應(yīng) 于不同的熒光顏色。在其中信號(hào)檢測(cè)器400的每個(gè)通道被配置以測(cè)量不同熒光信號(hào)的另選 實(shí)施例中，可以不必相對(duì)于MRD 160對(duì)信號(hào)檢測(cè)器400進(jìn)行分度。
[0156] 如果熔解溫度彼此差距足夠大，可使用單個(gè)熒光顏色檢測(cè)所有熔解溫度。單個(gè)所 得熔解曲線將具有多個(gè)拐點(diǎn)，分別對(duì)應(yīng)于不同的熱熔溫度。
[0157] 解釋容器間溫度變化和容器內(nèi)溫度變化和/或使其降至最低是本發(fā)明的用于使 多個(gè)樣品的熔解分析保持一致高的整體準(zhǔn)確度的裝置和方法的一個(gè)重要方面。這非常重 要，因?yàn)闊嵩礈囟群愣ǘ鴺悠窚囟壬仙?。影響從熱源到樣品的熱傳遞的因素，諸如容器器皿 材料、容器器皿材料厚度、每個(gè)容器器皿和每個(gè)容器孔之間的空氣間隙、樣品類型、樣品體 積以及其他因素對(duì)于評(píng)價(jià)非常重要。
[0158] 在涉及多個(gè)樣品的同步熱熔分析的一個(gè)實(shí)施例中，每個(gè)樣品包含在容器器皿中， 該容器器皿包含與彼此同步分析的樣品相同的材料并且具有相同或基本上相同的壁厚度。 在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，多個(gè)樣品中的每一個(gè)包含的樣品體積相同或基本上相同。
[0159] 降低容器間和容器內(nèi)溫度變化的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例涉及在容器器皿162被定位在 受熱的熱塊261中時(shí)，降低每個(gè)容器器皿162相對(duì)于受熱的熱塊261的位置可變性。例如， 在一個(gè)實(shí)施例中，在每個(gè)容器孔264的內(nèi)表面與每個(gè)容器器皿162之間形成預(yù)定空氣間隙。 該預(yù)定空氣間隙通常由每個(gè)容器器皿162與每個(gè)容器孔264的內(nèi)表面之間的距離限定。由 于本發(fā)明不限于容器孔264或容器器皿的任何具體幾何取向，因此空氣間隙可由每個(gè)容器 孔264的內(nèi)表面上的一個(gè)或多個(gè)特定點(diǎn)與每個(gè)容器器皿162的外表面上的一個(gè)或多個(gè)對(duì)應(yīng) 特定點(diǎn)之間的距離限定。在某些實(shí)施例中，空氣間隙為零"〇 "意指每個(gè)容器孔264的內(nèi)表面 上的一個(gè)或多個(gè)特定點(diǎn)與每個(gè)容器器皿162的外表面上的對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)特定點(diǎn)之間 沒有空氣間隙。在某些其他實(shí)施例中，每個(gè)容器孔264的內(nèi)表面上的一個(gè)或多個(gè)特定點(diǎn)與 每個(gè)容器器皿162的外表面上的對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)特定點(diǎn)之間的空氣間隙有所不同（即， 由不同的距離限定）。在另外的實(shí)施例中，每個(gè)容器孔264的內(nèi)表面上的一個(gè)或多個(gè)特定點(diǎn) 與每個(gè)容器器皿162的外表面上的對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)特定點(diǎn)之間的空氣間隙一致（即，由 一致的距離限定）。
[0160] 在步驟612中，通過容器升降機(jī)220將容器固定器202中裝載的MRD 160的容器 器皿162升高到器皿接納熱組件242之外。在步驟614中，將MRD 160從熱熔工位200的 容器固定器202移除。然后，可針對(duì)在其中執(zhí)行熱熔的每個(gè)后續(xù)MRD 160重復(fù)步驟604至 614。很多情況下，616包括的步驟在約5分鐘內(nèi)、約4分鐘內(nèi)、約3分鐘內(nèi)、約2分鐘內(nèi)或約 1分鐘內(nèi)完成。最經(jīng)常的情況下，616包括的步驟在約5分鐘或更短時(shí)間內(nèi)完成。
[0161] 示例性核酸診斷程序1900的過程步驟以流程圖的形式在圖15中示出。程序1900 可以通過診斷分析儀100執(zhí)行，其中一個(gè)或多個(gè)溫育箱（諸如溫育箱112U14和/或116) 和熱熔模塊200為該診斷分析儀的組件，并且由系統(tǒng)控制器控制該診斷分析儀，該系統(tǒng)控 制器執(zhí)行包括體現(xiàn)為被編碼或存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上的程序1900的算法的軟件。圖15 中所示過程在先前并入的美國(guó)專利申請(qǐng)No. 13/404,437中詳細(xì)描述。所述步驟僅代表示例 性TAA程序。普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，下文所述步驟可以有所不同或被省略，或者可以根 據(jù)其他擴(kuò)增分析程序（包括現(xiàn)在已知或尚待開發(fā)的等溫和/或溫度循環(huán)依賴性擴(kuò)增分析） 增加或替換其他步驟。用于執(zhí)行大量擴(kuò)增程序的試劑配方是本領(lǐng)域熟知的，并且可用于或 易于調(diào)整用于本發(fā)明。參見如Kacian等人的美國(guó)專利No. 5, 399, 491 ;Becker等人的美國(guó) 專利 No. 7, 374, 885 ;Linnen 等人的名稱為 "Compositions and Methods for Detecting West Nile Virus"（用于檢測(cè)西尼羅河病毒的組合物和方法）的美國(guó)專利No. 7, 115, 374 ; Weisburg 等人的名稱為 "Compositions, Methods and Kits for Determining the Presence of Trichomonas Vaginalis in a Test Sample"（用于確定試樣中陰道毛滴蟲 存在的組合物、方法和試劑盒）的美國(guó)專利No. 7, 381，811 ;以及Kacian的名稱為"Methods for Determining the Presence of SARS Coronavirus in a Sample"（用于石角定樣品中 是否存在SARS冠狀病毒的方法）的美國(guó)專利申請(qǐng)公布No. 20f 0-0279276 Al,這些專利的 相應(yīng)公開內(nèi)容據(jù)此以引用方式并入。
[0162] 在擴(kuò)增之后，在圖15所示的示例性過程步驟中，可以將MRD 160移動(dòng)到熱熔模塊 200,以執(zhí)行諸如上文所述和圖14所示的熱熔分析步驟600。
[0163] 在完成基于核酸的分析（包括熱熔）之后，并且為了避免后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)的可能污 染，可用滅活劑處理反應(yīng)混合物，該滅活劑破壞反應(yīng)器皿中的核酸和相關(guān)擴(kuò)增產(chǎn)物。在此例 子中，在擴(kuò)增和實(shí)時(shí)測(cè)量之后，在步驟1952中，將容器移動(dòng)到滅活隊(duì)列或模塊（未示出），并 在步驟1954中，向每個(gè)容器提供2mL基于漂白劑的試劑以滅活存在于容器中的核酸（即， 改變核酸使之不可擴(kuò)增）。此類滅活劑可包括氧化劑、還原劑和反應(yīng)性化學(xué)品等等，其改變 核酸的一級(jí)化學(xué)結(jié)構(gòu)。這些試劑通過使核酸對(duì)于擴(kuò)增反應(yīng)呈惰性而發(fā)揮作用，無論核酸是 RNA還是DNA。此類化學(xué)試劑的例子包括次氯酸鈉溶液（漂白劑）、高錳酸鉀溶液、甲酸、肼、 硫酸二甲酯和類似化合物。滅活方案的更多詳細(xì)信息可見于如Dattagupta等人的美國(guó)專 利No. 5, 612, 200和Nelson等人的美國(guó)專利申請(qǐng)公布No. US 2005-0202491 A1，這些專利的 相應(yīng)公開內(nèi)容據(jù)此以引用方式并入。
[0164] 硬件和軟件
[0165] 通過控制和計(jì)算硬件組件、用戶創(chuàng)建的軟件、數(shù)據(jù)輸入組件以及數(shù)據(jù)輸出組件來 實(shí)施本發(fā)明的多個(gè)方面。硬件組件包括計(jì)算和控制模塊（例如，系統(tǒng)控制器），諸如微處理 器和計(jì)算機(jī)，它們被配置以通過接收一個(gè)或多個(gè)輸入值，執(zhí)行存儲(chǔ)于非瞬時(shí)性機(jī)器可讀介 質(zhì)（例如軟件）上的一個(gè)或多個(gè)提供用于操縱或以其他方式作用于輸入值的指令的算法， 并且輸出一個(gè)或多個(gè)輸出值來執(zhí)行計(jì)算和/或控制步驟?？梢韵蛴脩麸@示或以其他方式指 示此類輸出，以向用戶提供信息，例如，關(guān)于器械狀態(tài)或因此執(zhí)行的過程的信息，或者此類 輸出可包括對(duì)其他過程和/或控制算法的輸入。數(shù)據(jù)輸入組件包括元件，通過該元件輸入 數(shù)據(jù)以供控制和計(jì)算硬件組件使用。此類數(shù)據(jù)輸入可包括位置傳感器、電機(jī)編碼器以及手 動(dòng)輸入元件，諸如鍵盤、觸摸屏、麥克風(fēng)、開關(guān)、手動(dòng)操作的掃描儀等。數(shù)據(jù)輸出組件可包括 硬盤驅(qū)動(dòng)器或其他存儲(chǔ)介質(zhì)、監(jiān)測(cè)器、打印機(jī)、指示燈或聽覺信號(hào)元件（例如，蜂鳴器、喇叭 等）。
[0166] 軟件包括存儲(chǔ)于非瞬時(shí)性計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上的指令，當(dāng)控制和計(jì)算硬件執(zhí)行該指 令時(shí)，將使得控制和計(jì)算硬件執(zhí)行一個(gè)或多個(gè)自動(dòng)化或半自動(dòng)化過程。
[0167] 實(shí)魁
[0168] 以下實(shí)例的提供是為了演示和進(jìn)一步說明本公開的某些實(shí)施例和方面，并且不旨 在被理解為限制本公開的范圍。
[0169] 實(shí)例 1
[0170] 將100 μ L HCV-2B合成靶標(biāo)連同200 μ L油加入每組五個(gè)的五組容器中。然后，將 每組容器置于被配置以執(zhí)行熱熔分析的裝置中，該裝置在圖4中示例性地示出。在引入容 器之前，將被配置以執(zhí)行熱熔分析的裝置加熱至90°C。一旦被引入裝置，在5個(gè)單獨(dú)的熔解 周期中自始至終監(jiān)測(cè)每個(gè)容器的內(nèi)容物的溫度。按單獨(dú)的容器以及在所有容器中計(jì)算熔解 溫度平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果匯總于下表和圖18中。在下表中，容器以縮寫"R"來表示。 在本實(shí)例中，容器縮寫中R后的數(shù)字（例如，虹、1?2、1?3、1?4或1?5)提供關(guān)于特定容器在裝置 內(nèi)的物理位置的信息。同樣，每個(gè)