一種細(xì)菌納米磁小體-凝集素復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)菌納米磁小體-凝集素及其制備方法與應(yīng)用，屬于分離純化技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]糖可以與蛋白質(zhì)或脂類等共價(jià)結(jié)合形成糖蛋白、蛋白聚糖及糖脂等糖復(fù)合物，是人體內(nèi)重要的信息分子，在許多生命和疾病過(guò)程中起著特異性的識(shí)別和介導(dǎo)作用。其結(jié)構(gòu)或數(shù)量的微小變化就可能引起其功能的改變，從而導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，這引起了人們對(duì)糖組學(xué)研宄的極大熱情。隨著科技的進(jìn)步和生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的技術(shù)被應(yīng)用于糖組學(xué)的研宄之中，如凝集素親和層析技術(shù)、前沿親和層析技術(shù)、高效液相色譜、質(zhì)譜、糖芯片技術(shù)等。在糖組學(xué)的研宄的中，主要分為三大部分:結(jié)構(gòu)糖組學(xué)、功能糖組學(xué)以及信息生物學(xué)。
[0003]糖復(fù)合物的獲取及分離是糖組學(xué)研宄的基礎(chǔ)，目前常用的捕獲技術(shù)為凝集素親和層析技術(shù)。凝集素是一種從各種植物、無(wú)脊椎動(dòng)物或者高等動(dòng)物中分離提純的非免疫來(lái)源、非酶類物質(zhì)，能與一類糖基特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，在糖蛋白質(zhì)組學(xué)的研宄過(guò)程中非常重要，被廣泛應(yīng)用于鑒定細(xì)胞中糖蛋白和糖脂糖鏈的類型。凝集素親和層析技術(shù)就是利用凝集素與糖鏈的親和性，從而應(yīng)用于親和色譜層析中分離糖復(fù)合物，而由于凝集素與糖鏈的親和力相對(duì)較低，所以更容易被洗脫從而可以達(dá)到回收糖復(fù)合物的目的。
[0004]雖然目前已有報(bào)道，將凝集素固定于人工合成環(huán)氧化磁納米顆粒以抓取糖復(fù)合物的方法。但人工合成環(huán)氧化磁納米顆粒的制備較為繁瑣且納米顆粒的粒徑均一性較差。而細(xì)菌納米磁小體(Bacterial Magnetic Particles, BMP) BMPs表面擁有天然氨基基團(tuán)，并可進(jìn)一步衍生化用于凝集素的偶聯(lián)。在粒徑方面，BMPs粒徑較小約40nm，且因其由趨磁細(xì)菌合成，粒徑較為均一。
[0005]本發(fā)明可為糖組學(xué)的研宄提供方便可行的研宄材料，方便糖復(fù)合物的獲取，以更好地對(duì)糖組學(xué)進(jìn)行研宄。本發(fā)明的制備方法較人工磁納米顆粒簡(jiǎn)單，磁納米顆粒均一性更好，粒徑均一可以提高顆粒與凝集素的偶聯(lián)效率及其與糖蛋白的相互結(jié)合的效率。本發(fā)明的制備的BMPs-凝集素復(fù)合物在富集和分離特定糖蛋白的步驟和時(shí)間比傳統(tǒng)色譜柱要快，較傳統(tǒng)親和色譜分離糖蛋白步驟少，時(shí)間短。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種細(xì)菌納米磁小體-凝集素復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用，本發(fā)明將凝集素偶聯(lián)于BMPs上，用于富集相關(guān)糖蛋白，并利用表面活性劑去除BMPs表面蛋白，避免引入無(wú)關(guān)蛋白，同時(shí)添加PE等以增加伯氨基數(shù)量，提高了偶聯(lián)效率。
[0007]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種細(xì)菌納米磁小體-凝集素復(fù)合物，所述復(fù)合物是將經(jīng)表面去蛋白、添加伯氨基處理的細(xì)菌納米磁小體與凝集素進(jìn)行偶聯(lián)而生成的。
[0008]所述表面去蛋白是用表面活性劑處理細(xì)菌納米磁小體；所述添加伯氨基是用磷脂對(duì)細(xì)菌納米磁小體表面進(jìn)行修飾；所述偶聯(lián)是通過(guò)交聯(lián)劑完成。
[0009]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備權(quán)利要求1所述復(fù)合物的方法。
[0010]所述方法包括:⑴BMPs表面修飾:秤取BMPs，加入表面活性劑進(jìn)行處理，以去除BMPs表面的蛋白，然后收集BMPs，重懸于磷脂溶液中，超聲，孵育，得到表面修飾的BMPs，即BMPs-磷脂復(fù)合物；(2) BMPs-交聯(lián)劑復(fù)合物的制備:將上一步得到的BMPs-磷脂復(fù)合物懸浮、打散，然后加入交聯(lián)劑溶液進(jìn)行反應(yīng)，收集，即得到BMPs-交聯(lián)劑復(fù)合物；(3) BMPs-交聯(lián)劑-凝集素復(fù)合物的制備:將上一步得到的BMPs-交聯(lián)劑復(fù)合物加入到凝集素溶液中，超聲打散，反應(yīng)，收集，即得到BMPs-交聯(lián)劑-凝集素復(fù)合物，即BMPs-凝集素復(fù)合物。
[0011]所述步驟I中的表面活性劑進(jìn)行處理，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是在60-100°C加熱5-20min或者室溫震蕩l_3h，其中采用加熱的方法，快速更快、效果更好。去除磁小體表面本身蛋白，可以避免后續(xù)試驗(yàn)中引入無(wú)關(guān)蛋白。
[0012]所述步驟I中磷脂，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為磷脂酰乙醇胺(PE)及磷脂酰絲氨酸(PS)，可以為BMPs表面提供更多的伯氨基，為下一步偶聯(lián)凝集素提供更多位點(diǎn)。
[0013]所述步驟I通過(guò)超聲法形成的磷脂包裹磁顆粒的形態(tài)處于亞穩(wěn)定狀態(tài)，可保證磁顆粒偶聯(lián)脂質(zhì)的效率更尚。
[0014]所述步驟I中的孵育，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是避光孵育，可保證磁顆粒偶聯(lián)脂質(zhì)的效率更尚。
[0015]所述步驟2，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，BMPs-磷脂復(fù)合物是懸浮于PB緩沖液(即只添加Na2HPO4及KH 2P04)中，使用超聲打散。
[0016]所述步驟2，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是選用濃度在1mM以下的、pH 7_9的PB緩沖液。所述緩沖液能調(diào)節(jié)離子濃度，使溶液處于較低離子濃度下，此時(shí)BMPs膠體溶液更加穩(wěn)定，BMPs顆粒更加分散，不易聚集，從而提高偶聯(lián)效率。
[0017]所述步驟1、步驟2、步驟3的每一步收集BMPs或其復(fù)合物后，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，還包括將收集的BMPs或其復(fù)合物用緩沖液或水懸浮、超聲打散，收集，取上清，重復(fù)清洗3次。清洗時(shí)，優(yōu)選采用高濃度的緩沖液，可以破壞膠體溶液的穩(wěn)定性，使BMPs更快的聚集，可縮短時(shí)間。所述清洗用緩沖液，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，采用40mM以上的PB緩沖液。
[0018]所述收集，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是使用磁鐵或者磁力架進(jìn)行收集。BMPs溶液實(shí)則為膠體溶液，在每一步的收集過(guò)程中，需先用外力將BMPs吸附，即破壞膠體的穩(wěn)定性。
[0019]所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，具體包括:(I) BMPs表面修飾:秤取BMPs，按每Img BMPsdPA 50 μ L-1OOmL的濃度為0.5_2%的表面活性劑溶液進(jìn)行加熱或者震蕩處理，以去除BMPs表面的蛋白，然后收集BMPs，清洗后重懸于lmg-100mg/mL的磷脂酰乙醇胺PE或磷脂酰絲氨酸PS溶液中，超聲，孵育，得到表面修飾的BMPs，即BMPs-磷脂復(fù)合物；⑵BMPs-交聯(lián)劑復(fù)合物的制備:用與BMPs質(zhì)量體積比為10:1_1:10的緩沖液將上一步得到的BMPs-磷脂復(fù)合物懸浮、打散，然后加入交聯(lián)劑質(zhì)量與BMPs-磷脂復(fù)合物質(zhì)量比為1:10至5:1的交聯(lián)劑溶液，于4-40°C震蕩反應(yīng)10-60min，收集，即得到BMPs-交聯(lián)劑復(fù)合物；
(3)BMPs-交聯(lián)劑-凝集素復(fù)合物的制備:配制0.l-10mg/ml凝集素溶液，按凝集素與上一步得到的復(fù)合物的質(zhì)量比1: 10至10:1，將上一步得到的復(fù)合物加入到凝集素溶液中，超聲打散，于4-40°C震蕩反應(yīng)10-120min，收集，即得BMPs-凝集素復(fù)合物。
[0020]所述交聯(lián)劑與BMPs-磷脂復(fù)合物質(zhì)量比，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為1:2-2:
1
[0021]所述BMPs-交聯(lián)劑復(fù)合物與凝集素質(zhì)量比，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為1:2-2:1。
[0022]所述表面活性劑，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，可以是以下任意一種:十二烷基硫酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)。
[0023]所述交聯(lián)劑，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，可以是以下任意一種:戊二醛、丁二醛、N, Nr -二琥珀酰亞胺基碳酸酯、3，3' -二硫雙磺基琥珀酰亞胺丙酸酯、二甲基己二酰亞胺。
[0024]所述交聯(lián)劑，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為雙琥珀酰亞胺辛二酸酯鈉鹽(BS3)。
[0025]所述凝集素可以是任意一種凝集素。
[0026]所述凝集素，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為以下任意一種:刀豆凝集素(conA)、麥胚凝集素(WGA)、槐凝集素(SJA)、扁豆凝集素(LCA)。
[0027]所述制備得到的BMPs-凝集素復(fù)合物，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，于牛血清白蛋白(BSA)中封閉、保藏。
[0028]所述制備得到的BMPs-凝集素復(fù)合物，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，加入封閉液(1mM PBS 含 1% BSA，并含有 2% PEG 4000,2% PEG 6000)，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0029]所述BMPs的制備方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是采用文獻(xiàn)Xiang L, WeiJ, Jianbo S et al.Purified and sterilized magnetosomes from MagnetospiriIIumgryphiswaldense MSR-1were not toxic to mouse fibroblasts in vitro[