六烷基三甲基溴化胺(CATB)和7ml三甲苯(TMB)混合均勻，在80°C下劇烈攪拌4h，再加入5.0ml正硅酸四乙酯(TEOS)，混合均勻，繼續(xù)在80°C劇烈攪拌2h，冷卻，在9000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下離心過濾，用無水乙醇洗滌，重復(fù)三次。之后沉淀40°C下真空干燥，即得介孔S12納米微球。
[0034](2) S12納米微球胺基功能化
[0035]取上述Si02m米微球200mg于圓底燒瓶中同時加入磁力攪拌子，加入無水乙醇40mL，之后加入200mg 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)，混合后通N2半小時以排出空氣，在磁力攪拌器中水浴80°C條件下反應(yīng)6h，反應(yīng)完成后離心分離(9000轉(zhuǎn)/min，5min)，用乙醇洗滌沉淀物，離心產(chǎn)物真空干燥，得干燥后的胺基化的介孔Si02m米微球；
[0036](3) T12納米球的制備
[0037]2.0g油酸鈉于50ml燒杯中，加入15ml乙醇和1ml水，攪拌，并密封，逐漸緩慢滴入1.0ml鈦酸四丁酯(ΤΒ0Τ)，攪拌，將所得溶液移至水熱反應(yīng)釜，至于烘箱中150°C，反應(yīng)12ho將所得混濁液離心，取沉淀加二氯甲烷溶解離心，洗滌；之后沉淀40°C下真空干燥，即得介孔T12納米微球。
[0038](4) T12納米球羧基功能化
[0039]取200mg上述T12納米微球于50ml小燒杯中，加入40ml 二氯甲烷溶解，加攪拌子攪拌，并加入30mg 3-巰基丙酸(MPA)，混合后通隊(duì)半小時以排出空氣，置于30°C下反應(yīng)2h，反應(yīng)完成后離心分離(9000轉(zhuǎn)/min，5min)，用乙醇洗滌沉淀物，離心產(chǎn)物真空干燥，得干燥后的羧基化的T12納米微球。
[0040](5)功能化介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球的制備
[0041]在250mL圓底燒瓶中加入上述制備得到的胺基化的介孔3丨02納米微球150mg和T12納米球40mg，分散于50mL水中，然后加入交聯(lián)劑1-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) 10mg、琥珀酰亞胺(NHS) 10mg，混合后通N2半小時以排出空氣，在攪拌作用下于30°C條件下反應(yīng)2小時，反應(yīng)完成后離心分離5min，轉(zhuǎn)速為9000轉(zhuǎn)/min，用乙醇洗滌沉淀物，離心產(chǎn)物真空干燥，得功能化介孔3102/1102復(fù)合納米微球。
[0042]實(shí)施例2:介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球固相萃取小柱的制備
[0043]A.萃取柱的準(zhǔn)備
[0044]1、空柱材料和規(guī)格
[0045]現(xiàn)有的固相萃取小柱空柱規(guī)格從100 μ L?ImL不等?？罩牧蠟榫郾?，小柱上下各有20 μπι孔徑的聚乙烯篩板，上述空柱均可使用于本發(fā)明中。在下面的實(shí)驗(yàn)例中本發(fā)明采用ImL的規(guī)格。
[0046]2、固相萃取柱的填料
[0047]固相萃取柱的填料為功能化的介孔Si02/Ti0；^合納米微球，介孔S12納米微球直徑為50?150nm，平均孔徑為4?5nm，介孔S12納米微球表面附著T1 2納米球，T1 2納米球直徑為3?5nm ;固相萃取柱空管容積為100 μ L?lmL，填裝高度為0.2?0.5cm，空管材質(zhì)為聚烯烴。
[0048]所述的一種功能化介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球的固相萃取小柱，制備方法為:
[0049](I)將一片多孔性聚乙烯下篩板放入固相萃取柱空管的底部，聚乙烯篩板孔徑為5 ?20um ；
[0050](2)將相當(dāng)于固相萃取柱空管容積三分之一到三分之二的功能化介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球干法填裝入柱內(nèi)；
[0051](3)在填裝的功能化介孔3;102/1102復(fù)合納米微球上放入另一片多孔性聚乙稀上篩板，聚乙烯篩板孔徑為5?20 μ m，壓緊填料使填裝柱高度保持在0.2?0.5cm,制備得到固相萃取小柱。
[0052]3、填裝量和填裝高度的選擇
[0053]用前述A準(zhǔn)備的材料填裝ImL固相萃取柱，如附圖1，將一片多孔性聚乙烯下篩板3置于固相萃取柱管I底部，稱取相當(dāng)于固相萃取柱空管容積二分之一的功能化介孔S12/T12復(fù)合納米微球4放入固相萃取柱管I中，然后將多孔性上篩板2放在填料上部，壓緊填料使填裝柱高度保持在0.3cm，得到功能化介孔3102/1102復(fù)合納米微球固相萃取小柱。
[0054]實(shí)施例3:選擇β-酪蛋白作為研宄目標(biāo)物，對所述固相萃取小柱的各項(xiàng)性能指標(biāo)進(jìn)行測試
[0055]實(shí)驗(yàn)材料:β -酪蛋白購自于上海阿拉丁試劑有限公司，批號為:SLBK9882V ;胰蛋白酶(I: 250)購自于上海阿拉丁試劑有限公司，批號為:20130929 ;2，5_ 二羥基苯甲酸，批號為:J1312017，購自于南京化學(xué)試劑有限公司。
[0056]實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備:質(zhì)譜儀為MALD1-TOF-MS (AximaT0F2mass spectrometry,Shimadzu, Kyoto，Japan)、按上述實(shí)施例2中制備的功能化介孔3;102/1102復(fù)合納米微球固相萃取小柱。
[0057]實(shí)驗(yàn)過程:
[0058](I)取β -酪蛋白配成lmg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用(ρΗ8.0，50mM碳酸氫錢溶液為溶劑);取胰蛋白酶配成0.05mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用(pH8.0，50mM碳酸氫銨溶液為溶劑);取2，5- 二羥基苯甲酸配成20mg/mL基質(zhì)溶液備用(1.0 %磷酸水溶液:乙腈混合液(v/vI: 4)為溶劑)；
[0059](2) β -酪蛋白原消化樣品液的制備:在37°C條件下，β -酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液與胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)溶液以10: I摩爾比混合，振蕩2小時，得到β-酪蛋白的胰蛋白酶消化樣品液；
[0060](3) 酪蛋白富集液的制備:用前述A準(zhǔn)備的介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球固相萃取小柱尖端吸入β -酪蛋白原消化樣品液，用pH 4.0緩沖溶液(10mM醋酸鹽緩沖液:乙腈混合液(v/v4: I) pH 4.0)洗滌三次，分離出非磷酸化多肽；用？11 1.0解吸溶液(1%三氟乙酸水溶液:乙腈混合液(v/v I: 1)ρΗ1.0)洗脫被吸附的磷酸化多肽，收集到容器中而得到酪蛋白富集液；
[0061 ] (4)取IuL β -酪蛋白富集液沉積到MALDI革巴，同時滴入IuL基質(zhì)溶液至試樣斑；樣品在空氣中干燥后，用MALD1-TOF-MS分析得到經(jīng)固相萃取小柱富集后的β -酪蛋白的質(zhì)譜圖，如附圖4所示；
[0062](5)取IuL β -酪蛋白原消化樣品液沉積到MALDI革巴，同時滴入IuL基質(zhì)溶液至試樣斑；樣品在空氣中干燥后，用MALD1-TOF-MS分析得到?jīng)]有經(jīng)過富集的β _酪蛋白的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，如附圖5所示。
[0063](6)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將固相萃取小柱用乙腈、甲醇各ImL依次洗滌，以備重復(fù)使用。
[0064]質(zhì)譜測定條件如下:
[0065]采用正離子反射模式，加速電壓20kV，平均200個激光點(diǎn)產(chǎn)生一個波譜。樣品基質(zhì)為20mg/mL的2，5- 二輕基苯甲酸溶液，其組成為乙腈:1.0%的磷酸水溶液=4: 1lyL樣品點(diǎn)在樣品臺上，隨后基質(zhì)溶液I μ L點(diǎn)樣，當(dāng)樣品點(diǎn)空氣中風(fēng)干后開始分析。
[0066]結(jié)果表明對于上述磷酸化蛋白的富集加標(biāo)回收率均能達(dá)到92% -105%，解吸過程簡單，乙腈就可將上述物質(zhì)洗脫下來，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將固相萃取小柱用乙腈、甲醇各ImL依次洗滌，無需其他操作，即可重復(fù)使用。
[0067]以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式，在所述領(lǐng)域普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替代和改進(jìn)等，其均應(yīng)在本發(fā)明請求保護(hù)的技術(shù)方案范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種介孔S1 2/Ti02復(fù)合納米微球固相萃取小柱，其特征在于所述的固相萃取柱的基質(zhì)為功能化的介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球，介孔Si02m米微球直徑為50?150nm，平均孔徑為4?5nm，介孔S12納米微球表面附著T1 2納米球，T1 2納米球直徑為3?5nm ;固相萃取柱空管容積為100 μ L?lmL，填裝高度為0.2?0.5cm,空管材質(zhì)為聚烯烴。
2.—種制備權(quán)利要求1所述的功能化介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球的方法，其特征在于由原始介孔S12納米微球及T12納米球分別經(jīng)胺基化、羧基化共價化學(xué)修飾所得，共價化學(xué)修飾按以下步驟進(jìn)行: (1)介孔S12納米微球表面胺基化:在無水乙醇溶劑中加入介孔S12納米微球和3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)，介孔S12納米微球與APS的質(zhì)量比為2:1?1: 5，介孔S12納米微球的質(zhì)量濃度為2mg/mL?20mg/mL，混合后通N2半小時以排出空氣，然后在攪拌作用下于50?90°C條件下反應(yīng)5?24小時，反應(yīng)完成后離心分離5min，轉(zhuǎn)速為9000轉(zhuǎn)/min，用乙醇洗滌沉淀物，離心產(chǎn)物真空干燥，得干燥后的胺基化的介孔Si02m米微球； (2)T12納米球表面羧基化:在二氯甲烷溶劑中加入制備得到的1102納米球及3-巰基丙酸(MPA)，1102納米球和MPA的質(zhì)量比為20:1?4:1，T12納米球的質(zhì)量濃度為2mg/mL?20mg/mL，混合后通隊(duì)半小時以排出空氣，然后在攪拌作用下于10?40°C條件下反應(yīng)0.5?2小時，反應(yīng)完成后離心分離5min，轉(zhuǎn)速為9000轉(zhuǎn)/min，用乙醇洗滌沉淀物，離心產(chǎn)物真空干燥，得干燥后的羧基化的1102納米球。 (3)功能化介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球的制備:在水溶液中加入制備得到的介孔S12納米微球和T12納米球以及交聯(lián)劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、琥珀酰亞胺(NHS)，Si02/Ti0,量比為4:1?3:1，S1 2與EDC、NHS質(zhì)量比為(20?5):1: 1，介孔S12納米球的質(zhì)量濃度為2mg/mL?20mg/mL，混合后通1^2半小時以排出空氣，然后在攪拌作用下于10?40°C條件下反應(yīng)0.5?2小時，反應(yīng)完成后離心分離5min，轉(zhuǎn)速為9000轉(zhuǎn)/min，用乙醇洗滌沉淀物，離心產(chǎn)物真空干燥，得功能化介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球。
3.如權(quán)利要求1所述的一種功能化介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球固相萃取小柱，其特征在于制備方法為: (1)將一片多孔性聚乙烯下篩板放入固相萃取柱空管的底部，聚乙烯篩板孔徑為5?20 μπι ； (2)將相當(dāng)于固相萃取柱空管容積三分之一到三分之二的功能化介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球干法填裝入柱內(nèi)； (3)在填裝的功能化介孔3102/1102復(fù)合納米微球上放入另一片多孔性聚乙烯上篩板，聚乙烯篩板孔徑為5?20 μm，壓緊填料使填裝柱高度保持在0.2?0.5cm，制備得到固相萃取小柱。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種功能化介孔SiO2/TiO2復(fù)合納米微球固相萃取小柱及其制備方法，固相萃取小柱的基質(zhì)為功能化的SiO2/TiO2復(fù)合納米微球，是由原始介孔SiO2納米微球經(jīng)胺基化、TiO2羧基化共價化學(xué)修飾，然后通過酰胺反應(yīng)復(fù)合所得。該功能化介孔SiO2/TiO2復(fù)合納米微球的填裝高度為(0.2～0.5)cm。主要適于富集生物體液以及復(fù)雜基質(zhì)中的磷酸化肽。本發(fā)明固相萃取柱具有對目標(biāo)物質(zhì)回收率高(92％-105％)，制備成本低，材料易得，功能化過程簡單，適應(yīng)性強(qiáng)，易于批量生產(chǎn)的特點(diǎn)，具有很好的應(yīng)用前景。
【IPC分類】B01J20-283, G01N30-08, B01J20-30
【公開號】CN104689806
【申請?zhí)枴緾N201510124489
【發(fā)明人】胡玥, 朱棟, 王軍, 朱俊明, 顧超前, 倪雯婷, 周雪蓮
【申請人】南京中醫(yī)藥大學(xué)
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月18日