一種利用慣性力產(chǎn)生微液滴的方法和裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種微液滴的產(chǎn)生裝置和方法，及其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 近年來，生物技術(shù)發(fā)展對液滴化技術(shù)提出越來越高的要求：第一方面，樣品低損失 需求。微量測序樣品如單細(xì)胞樣品（如受精卵），切片樣品，癌癥（如CTC細(xì)胞）樣品等 稀有樣品的制備、表征技術(shù)中，保持生物樣品的完整性尤其重要。而且對于digital PCR， digital MDA等其他數(shù)字定量技術(shù)，保持樣品的完整性達(dá)99%以上更是技術(shù)的必要條件，即 在樣品處理、檢測過程中需要保證盡量少的樣品損失。然而，使用傳統(tǒng)微流控芯片方案的液 滴化技術(shù)，難免產(chǎn)生液滴化介質(zhì)殘留，并導(dǎo)致樣品中的核酸、蛋白等待分析組分損失。
[0003] 第二方面，均勻性需求。這些針對微量樣品的精密制備、檢測技術(shù)，又需要產(chǎn)生的 液滴大小均勻，不能又過大差異，導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)中帶來傾向性和不確定性。
[0004] 第三方面，高通量需求。隨著上游樣品數(shù)的不斷增多，對大規(guī)模樣品同時(shí)制備的需 求不斷增長。現(xiàn)有微流芯片技術(shù)生成液滴的技術(shù)，每臺儀器最多僅能使8個(gè)樣品同時(shí)液滴 化，由于其繁瑣的管道設(shè)計(jì)，流體控制設(shè)計(jì)，已經(jīng)不能滿足擴(kuò)大規(guī)模，通量的需要了。
[0005] 第四方面，制冷需求。生物樣品，尤其是DNA，RNA，蛋白樣品比較脆弱。并且，有些 反應(yīng)液配置好后，常溫下便會(huì)發(fā)生反應(yīng)（如MDA)，需要快速的（< IOmin)在低溫（小于10 攝氏度，最好在0-4攝氏度）產(chǎn)生液滴。傳統(tǒng)方法不能對微流芯片進(jìn)行方便的降溫，并且產(chǎn) 生速度也不夠快。
[0006] 當(dāng)液體十分微小的時(shí)候，其表現(xiàn)出與宏觀液體截然不同的特性。比如端面尺寸 10 XlOym微通道中，流體處于層流狀態(tài)，傳熱和傳質(zhì)都與常規(guī)的宏觀流體，比如常見的實(shí) 驗(yàn)室燒杯或1厘米端面的橡膠管中不同。一直以來，快速精確的產(chǎn)生微米級別的液滴是一 項(xiàng)巨大的工程挑戰(zhàn)。微流控芯片可以快速產(chǎn)生直徑可控的液滴，但是其設(shè)備復(fù)雜，成本較 高。噴墨技術(shù)可以產(chǎn)生高速的液滴，但是其液滴直徑均勻性不好，并且需要噴墨裝置，不適 合普通的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。因此，發(fā)展便捷的快速產(chǎn)生均勻的小液滴，例如300微米以下， 具有十分重要的生物化學(xué)意義。
[0007] 本發(fā)明提供的基于高慣性力產(chǎn)生的液滴的技術(shù)，很好的滿足了上述四點(diǎn)需求。1) 無殘留。全部液滴在離心機(jī)的高離心力場中，完全經(jīng)由液滴化口，產(chǎn)生液滴，不會(huì)產(chǎn)生殘留。 2)可控單分散。全部液滴產(chǎn)生液滴的平衡態(tài)均相同，所以液滴尺寸精確相同，并且重復(fù)性 好，可控范圍大，沒有液體湍流等影響。3)高通量。由于僅需要離心力即可產(chǎn)生液滴，僅需 一臺常規(guī)桌上離心機(jī)（如 thermo PIC017，PIC0 21，eppendorf 5430R 等），使用 I. 5mL 離心 管收集便可同時(shí)使24個(gè)樣品的液滴化，進(jìn)一步如果使用8聯(lián)排管、96孔板、384孔板、甚至 1536孔板的形式，并加以堆疊，很容易使用一臺離心機(jī)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)幾千甚至上萬個(gè)獨(dú)立的樣 品的液滴化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種簡單的等大水相液滴產(chǎn)生新方法。利用慣 性力驅(qū)動(dòng)液滴化介質(zhì)，穿過微孔道，在流出空道口后斷裂，產(chǎn)生液滴，并落在收集介質(zhì)中。與 產(chǎn)生液滴接觸的液體可以為空氣或低密度的異相。
[0009] 液滴在慣性力條件下的斷裂，滿足一個(gè)明確的物理過程：當(dāng)液滴所受地球引力大 于最薄弱處的表面張力時(shí)，液滴斷裂。利用確定的慣性力常數(shù)，這個(gè)原理被普遍應(yīng)用在測定 溶液表面張力上，稱為滴液法，尺寸由〇· 5-2mm不等。而使用變化的慣性力和調(diào)整張力，來 高速產(chǎn)生小體積，5-200 μ m直徑的液滴，不僅僅利用了表面張力的原理，更具備廣闊的生物 化學(xué)意義。均勻的微小液滴，在生物或者化學(xué)的檢測方面，具備了巨大的潛力。
[0010] 本發(fā)明中，所稱的加速度指的是，在外界非自然力的作用下，例如向心力、牽引力， 使得液體受到加速度方向相反的力，從而使得液體有向相反于加速度方向運(yùn)動(dòng)的趨勢。本 發(fā)明中，第一液體受到慣性力的作用，通過液滴化裝置形成液滴。第一液體也稱之為液滴化 介質(zhì)。
[0011] 本發(fā)明一種液滴的產(chǎn)生裝置，其特征在于，包含加速度產(chǎn)生裝置，其用于產(chǎn)生向心 加速度；包含第一液體；包含液滴化裝置，其具備微通道，第一液體在加速度產(chǎn)生裝置的作 用下通過液滴化裝置的微通道產(chǎn)生5-300 μ m直徑的液滴；包含收集裝置，其用于收集產(chǎn)生 的液滴；其中，第一液體在液滴化裝置出口部分的表面呈疏水態(tài)。其中所述微通道的內(nèi)徑為 1-100 μ m，長度為 0· l-lOmm。
[0012] 本發(fā)明提供一種液滴的產(chǎn)生方法，其特征在于，包含加速度產(chǎn)生裝置，其用于產(chǎn)生 向心加速度；包含第一液體；包含液滴化裝置，其具備微通道，第一液體在加速度產(chǎn)生裝置 的作用下通過液滴化裝置的微通道產(chǎn)生5-300 μ m直徑的液滴；包含收集裝置，其用于收集 產(chǎn)生的液滴；其中，第一液體在液滴化裝置出口部分的表面呈疏水態(tài)。其中所述微通道的內(nèi) 徑為 1-100 μ m，長度為 0· l-10mm。
[0013] 其中第一液體指的是常見的低粘度的液體或溶液。比如第一液體是水、細(xì)胞培養(yǎng) 液、乙醇等物質(zhì)的溶液，或者液體中包含細(xì)胞、DNA、RNA或者蛋白質(zhì)的組合。
[0014] 液滴化裝置是帶微通道的裝置。比如常見的毛細(xì)管、帶小孔的膜或者帶小孔的板； 毛細(xì)管的內(nèi)徑或者小孔的直徑為1-100 μm ;液滴化裝置的材料可為無機(jī)材料如：玻璃，石 英，硅；或常見有機(jī)塑料材料如：聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚甲基丙烯酸，聚酰胺，聚乙烯，聚氯 乙稀，聚丙烯；含氟塑料如聚四氟乙烯，PVDF等。
[0015] 根據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述小孔為圓孔或者多邊形孔；所述方孔的內(nèi)徑即 其邊長為1-100 μ m。
[0016] 根據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述液滴的直徑為10-250 μ m，優(yōu)選20-200微米；所 述微通道的內(nèi)徑為2-90微米，優(yōu)選5-50微米；微通道的長度為0. 5-6mm，優(yōu)選l-5mm。
[0017] 根據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，液滴化裝置是1，2,.....η個(gè)，其中η是大于2的整 數(shù)。
[0018] 根據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，收集裝置是離心收集管。
[0019] 根據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，更進(jìn)一步還可以包括第一液體的儲(chǔ)存裝置，其用于 儲(chǔ)存第一液體。
[0020] 更進(jìn)一步還可以包括第二液體，位于收集裝置內(nèi)，用于收集產(chǎn)生的第一液體的液 滴，所述液滴化裝置的出口的部分和第二液體不接觸。第一液體在轉(zhuǎn)化成液滴前和轉(zhuǎn)化成 液滴中不與第二液體接觸。
[0021] 根據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的加速度產(chǎn)生裝置為離心機(jī)。
[0022] 根據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述加速度可以是恒定的或者變化的。
[0023] 根據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述微通道為直的或彎曲的。
[0024] 根據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，液滴化裝置為前端有開口的管狀物或錐狀物。
[0025] 根據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，更進(jìn)一步包括延遲介質(zhì)或者延遲裝置。
[0026] 根據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，液滴化裝置和儲(chǔ)存裝置是一個(gè)整體。
[0027] 根據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，液滴化裝置材料為無機(jī)材料、有機(jī)材料或復(fù)合材料。 無機(jī)材料為玻璃，石英，陶瓷，金屬中的一種。有機(jī)材料為聚苯乙烯，聚醚醚酮，聚酯高分子 材料中的一種。復(fù)合材料是一種或多種所述有機(jī)材料和/或無機(jī)材料的混合物。
[0028] 根據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述液滴化裝置的全部或者僅出口部分經(jīng)過疏水和 /或親水表面處理，使得第一液體在液滴化裝置出口部分的表面呈疏水態(tài)；表面處理的方 法有：直接覆涂，化學(xué)反應(yīng)修飾，化學(xué)沉積等。
[0029] 根據(jù)需求，可以不包括第一液體的儲(chǔ)存裝置，例如利用毛細(xì)管作為液滴化裝置，毛 細(xì)管本身就可以儲(chǔ)存一定量的液體，如圖1所示。根據(jù)需求，可以更進(jìn)一步包括第一液體的 儲(chǔ)存裝置，其可以是和液滴化裝置不同的材質(zhì)；也可以是和液滴化裝置相同的材質(zhì)，并且可 以和液滴化裝置形成一個(gè)整體。
[0030] 第二液體也稱為收集介質(zhì)，其主要有以下幾個(gè)作用：
[0031] (1)不與水相互溶。
[0032] (2)提供浮力，大幅減少液滴收到的重力，保持產(chǎn)生的液滴不因離心力破裂，融合。
[0033] (3)提供粘度，降低液滴下降速度，緩沖液滴，避免融合。
[0034] 提供活性劑，穩(wěn)定液滴。
[0035] (4)密度小于液滴化相，可以讓水相液滴沉降到收集介質(zhì)底部，避免與上方新產(chǎn)生 的下落液滴碰撞，產(chǎn)生融合。
[0036] (5)防止水分蒸發(fā)。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如PCR過程中防止水分蒸發(fā)
[0037] (6)作為成像介質(zhì)、后續(xù)分析，熒光采集等的流動(dòng)相。
[0038] 產(chǎn)生液滴用的裝置即液滴化裝置，最簡單的液滴化裝置是毛細(xì)管。毛細(xì)管可由一 根或多條組成?？捎梢桓?xì)管或多跟毛細(xì)管構(gòu)成，也可采用多孔毛細(xì)管或多孔膜、多孔 板，如圖2所示。
[0039] 細(xì)管的制造可由機(jī)械加工，機(jī)械加工后拉制，濕法腐蝕，干法腐蝕等工藝，配套有 切割、拋光等工序完成。
[0040] 細(xì)管材料可為無機(jī)材料如：玻璃，石英，硅；或常見有機(jī)塑料材料如：聚苯乙烯，聚 碳酸酯，聚甲基丙烯酸，聚酰胺，聚乙烯，聚氯乙烯，聚丙烯；含氟塑料如聚四氟乙烯，PVDF 等。
[0041] 細(xì)管或細(xì)管組表面需要修飾，修飾的結(jié)果應(yīng)當(dāng)使液滴化介質(zhì)不至于在微管管口鋪 開。液滴化介質(zhì)與表面的接觸角應(yīng)當(dāng)大于90度。
[0042] 該裝置整體結(jié)構(gòu)分為三部分。液滴化裝置（上），收集管（下）兩部分組成；液滴 化管包含液滴盛放區(qū)和微管區(qū)兩部分。
[