一種用于蛋白質(zhì)分離的wax/hic雙功能混合模式色譜固定相及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于蛋白質(zhì)分離的高效液相色譜固定相，具體地說(shuō)是一種弱陰離 子交換/疏水雙功能混合模式色譜固定相及其制備方法，屬于色譜分離介質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 隨著生物技術(shù)和生命科學(xué)的發(fā)展，無(wú)論重組蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)還是蛋白質(zhì)組學(xué)研宄 都依賴于蛋白質(zhì)的高效快速的分離技術(shù)。復(fù)雜樣品的分析對(duì)分離科學(xué)提出了越來(lái)越高的要 求，而發(fā)展新型高效分離材料、分離模式和高靈敏度的檢測(cè)方法是解決該問(wèn)題的有效途徑 之一。
[0003] 多維液相色譜（MDLC)是蛋白質(zhì)組學(xué)等復(fù)雜樣品分離分析的關(guān)鍵技術(shù)。通常 的一根色譜柱，只能利用一種分離模式對(duì)生物大分子進(jìn)行分離純化，如反相（RPLC)、疏 水（HIC)、離子交換（IEC)和親合（AFC)等，其特征是"一柱一用"。目前二維液相色譜 (2DLC)的構(gòu)建就需要兩根作用力性質(zhì)完全不同的色譜柱。"混合模式色譜"（Mixed mode chromatography, MMC)是利用蛋白質(zhì)與固定相配基之間多種相互作用力進(jìn)行分離的?；?合保留機(jī)理的分離介質(zhì)可提供兩種以上的作用力用于溶質(zhì)的分離，與單一色譜分離模式相 比，MMC具有更高的選擇性和吸附量。雖然現(xiàn)在MMC有反相和離子交換混合模式、反相和 親水混合模式、親水和離子交換混合模式等類型，但MMC仍以一種作用力為主，另一種力為 輔，所以混合保留機(jī)理的色譜填料都是以一種分離模式為主的，即一種分離模式的分離較 好，而另一種分離差，不能有效地用于蛋白質(zhì)樣品的二維分離，因此不能稱之為二維色譜填 料。
[0004] 早期在制備HIC填料時(shí)，先用溴化氰活化載體，再與疏水配基進(jìn)行偶聯(lián)。由于配 體上帶有胺基，這種疏水填料在與蛋白質(zhì)相互作用時(shí)除了具有疏水作用以外還會(huì)表現(xiàn)出 靜電相互作用的性質(zhì)。Kennedy [Kennedy L A, ei a/, / 4 1986，359: 73-84]等合成了一種弱陰離子交換填料，該填料具有一定的疏水相互作用性質(zhì)。Horvath 等[Melander W R, et al, J Chromatogr, 1989, 469: 3-27]]曾合成了一種聚合物基 質(zhì)的混合模式弱陰離子交換分離介質(zhì)。目前IEC/HIC MMC色譜柱已有商品化，如美國(guó)GE Healthcare公司的Capto MMC and Capto adhere，前者配基中含有苯基和羧基，后者則含 有季按鹽和苯基。Pall Life Sciences公司設(shè)計(jì)生產(chǎn)的HEA, PPA and MEP HyperCel耐 鹽層析介質(zhì)，其配基含有己基和叔胺基。在流動(dòng)相中易于質(zhì)子化而帶正電荷，在較低的鹽濃 度下可通過(guò)疏水和靜電引力兩種作用力來(lái)吸附等電點(diǎn)小于流動(dòng)相pH值的酸性蛋白。耐鹽 層析填料的制備一般是通過(guò)增加疏水配基密度或疏水配基的疏水性從而使填料表面具有 較強(qiáng)的疏水性，以保證蛋白質(zhì)在填料上的吸附量基本與鹽濃度無(wú)關(guān)。洗脫時(shí)，通過(guò)調(diào)低流動(dòng) 相的PH值，使蛋白質(zhì)表面和固定相帶上相同的正電荷，依靠靜電斥力將蛋白排斥下來(lái)，這 便是疏水電荷誘導(dǎo)色譜（hydrophobic charge induction chromatography, HCIC) 〇
[0005] 與傳統(tǒng)單一模式色譜相比，MMC具有高選擇性、高負(fù)載量和高峰容量等優(yōu)點(diǎn)，但目 前大多數(shù)MMC在分離過(guò)程中都是利用一種主要作用模式進(jìn)行分離，另一種模式只是起到輔 助分離的作用，也就是說(shuō)一種模式分離效果好而另一種模式并不能達(dá)到理想的分離效果。 因此，這樣一根MMC柱僅能用于一種分離模式，并不能代替相應(yīng)的兩根單模式色譜柱使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種新型弱陰離子交換/疏水混合模式色譜固定相，以滿 足采用一根色譜柱可分別在離子交換模式和疏水模式下實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的高效分離的要求， 實(shí)現(xiàn)"一柱二用"的功能。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種反應(yīng)選擇性高、鍵合效率高、反應(yīng)條件溫和的上 述固定相簡(jiǎn)便的制備方法，即"點(diǎn)擊化學(xué)"法。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為： 結(jié)構(gòu)式（I)所示的弱陰離子交換/疏水雙功能混合模式色譜固定相，
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 結(jié)構(gòu)式（I)所示的弱陰離子交換/疏水雙功能混合模式色譜固定相，
X 為 _0〇13或-OCH 2CH3， R2獨(dú)立地選自Cl至C6的烷基、苯基或芐基。
2. 權(quán)利要求1所述弱陰離子交換/疏水雙功能混合模式色譜固定相的制備方法，包括 以下步驟： (1) 將硅烷偶聯(lián)劑與硅膠反應(yīng)得環(huán)氧鍵合硅膠衍生物；
(2) 環(huán)氣鍵合砝腔衍牛物加入疊氮化鈉得疊氮鍵合砝腔衍牛物：
(3) 將疊氮鍵合硅膠衍生物與N，N-二烴基丙炔胺反應(yīng)得弱陰離子交換/疏水雙功能混 合模式色譜固定相；
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述弱陰離子交換/疏水雙功能混合模式色譜固定相的制備方法， 其特征在于：步驟（1)中硅膠為全多孔硅膠小球，粒徑為3~40 μ m，孔徑為50~500 A， 經(jīng)1:1鹽酸活化3~7小時(shí)，然后洗至中性，100~160°C真空干燥10~24 h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述弱陰離子交換/疏水雙功能混合模式色譜固定相的制備方法， 其特征在于：將活化硅膠加至甲苯或二甲苯中，再加入硅烷偶聯(lián)劑和催化劑三乙胺，攪拌回 流反應(yīng)，過(guò)濾、洗滌、干燥得環(huán)氧化硅膠衍生物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述弱陰離子交換/疏水雙功能混合模式色譜固定相的制備方法， 其特征在于：步驟（2)中，將環(huán)氧化硅膠衍生物加至體積比為1:1的水與乙醇混合液中， 加入疊氮化鈉和氯化銨于60~78°C下反應(yīng)，過(guò)濾、洗滌、干燥得疊氮化硅膠衍生物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述弱陰離子交換/疏水雙功能混合模式色譜固定相的制備方法， 其特征在于：步驟（3)中，將環(huán)氧化硅膠衍生物加至體積比為1:1的水與乙醇混合液中， 加入N，N-二烴基丙炔胺，然后再加入一價(jià)銅催化劑，于室溫下反應(yīng)，經(jīng)過(guò)濾、洗滌、干 燥得廣品。
7.權(quán)利要求1所述的色譜固定相在蛋白質(zhì)分離及純化中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了結(jié)構(gòu)式（I）所示的弱陰離子交換/疏水雙功能混合模式色譜固定相，其中為-OCH3或-OCH2CH3，R1、R2獨(dú)立地選自C1至C6的烷基、苯基或芐基。本發(fā)明采用點(diǎn)擊化學(xué)的方法合成，該方法選擇性高、鍵合效率高、反應(yīng)條件溫和、合成成本低，同時(shí)制備的固定相穩(wěn)定、使用壽命長(zhǎng)、分離效果好，該弱陰離子交換/疏水雙功能混合模式色譜固定相可以在離子交換和疏水兩種模式下分別實(shí)現(xiàn)對(duì)混合蛋白質(zhì)的有效分。
【IPC分類】C07K1-18, C07K1-20, B01J20-286, B01J20-30
【公開(kāi)號(hào)】CN104826617
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410110558
【發(fā)明人】白泉, 趙開(kāi)樓
【申請(qǐng)人】西北大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2014年3月25日