一種以膽固醇為配基的高效疏水相互作用色譜填料制備與應(yīng)用
【專利說明】-種以膽固醇為配基的高效疏水相互作用色譜填料制備與 應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種以膽固醇為配基的高效疏水相互作用的色譜填料的制備方法及 其用于蛋白質(zhì)復性與純化，屬于高效液相色譜技術(shù)和生物工程技術(shù)交叉領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 膽固醇是生物膜上的主要組成部分。在HPLC中，以膽固醇分子作為色譜配 基，采用表面化學修飾合成色譜填料引起了色譜工作者的極大興趣，并取得一定的 進展[Witkiewicz Z.，Mazur J.LC GC，1990,8(3) :224-236;Pesek J.J.，Matyska M.T. Interface Science，1997,5(2) :103-117]。已有的文獻報道，以膽固醇為配基的色譜 填料主要集中于反相液相色譜（RPLC)研宄，其高效分離性能已得到驗證和應(yīng)用[Soukup J.，Jandera P. Journal of Chromatography A，2012,1228:125-134]。對于具有活性功能 的蛋白質(zhì)而言，RPLC僅用于蛋白質(zhì)分析。
[0003] 而與反相液相色譜法機理相同的疏水相互作用色譜（HIC)是采用流動相為鹽-水 洗脫體系，色譜條件溫和，被廣泛應(yīng)用于天然活性蛋白質(zhì)分離和變性蛋白的復性與同時純 化。目前，在HIC中應(yīng)用最多的配基有兩類：一類是線性鏈烷基（如丁基或辛基）和芳香基 團（如苯基），另一類是疏水性溫和的配基有聚乙二醇（PEG)和聚丙二醇（PPG)等[Hubert P.，et al. Journal of Chromatography A，1991，539(2) :297_306]。前者配基所構(gòu)成的填料 容易導致蛋白質(zhì)，尤其是變性蛋白難以洗脫。后者疏水性弱的配基在變性蛋白復性過程中， 會造成吸附載量下降、變性蛋白易于直接穿透的缺點，從而使蛋白質(zhì)的復性效率很低。
[0004] 本發(fā)明以膽固醇分子作為色譜配基，制備一種硅膠基質(zhì)的高效疏水相互作用色譜 填料，并將該填料應(yīng)用于天然蛋白質(zhì)的分離和變性蛋白的復性與純化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于將細胞膜上的兩性功能分子膽固醇作為色譜填料配基，制備一 種具有特殊功能的硅膠基質(zhì)HPHIC填料，并對還原變性溶菌酶、重組人Flt31igand(FL)包 涵體和重組人干細胞因子（rhSCF)進行復性與同時純化，以期克服HPHIC配基在變性蛋白 復性與純化中由于其疏水作用較強或較弱會造成吸附載量過強或下降、變性蛋白難于洗脫 或易于直接穿透的缺點。
[0006] 為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取解決技術(shù)方案如下：
[0007] 1.以空白基質(zhì)為原材料，以膽固醇及其衍生物為配基，制備結(jié)構(gòu)式⑴所示膽固 醇配基的硅膠基質(zhì)高效疏水相互作用色譜填料；
[0008]
【主權(quán)項】
1. 結(jié)構(gòu)式（I)所示高效疏水相互作用色譜填料
其中，R基團可以是：〇1(〇13)〇12〇12〇1 2〇1(〇13)2,〇1(〇13)〇12〇1 2〇)011，〇1(〇13)CH2CH2CH(CH2CH3)CH(CH3) 2,CH(CH3)CH2CH2CHC(CH3) 2等。
2. 權(quán)利要求1高效疏水相互作用色譜填料結(jié)構(gòu)式（I)中的色譜配基為膽固醇類衍生物 即環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，如膽固醇；
3. 權(quán)利要求1所述的高效疏水相互作用色譜填料制備方法，包括以下步驟： (1) 將硅烷偶聯(lián)劑與活化硅膠反應(yīng)得到環(huán)氧基硅膠； (2) 將環(huán)氧基硅膠與膽固醇以及膽固醇類衍生物反應(yīng)得到高效疏水相互作用色譜填 料； (3) 將環(huán)氧基硅膠與含有羧基的膽固醇類衍生物反應(yīng)得到具有高效疏水相互作用/弱 陽離子交換作用色譜填料；
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述高效疏水相互作用色譜填料制備方法，其特征在于包括以下步 驟： (1) 所用的活化硅膠經(jīng)1 : 10~1 : 20 (g/mL，m/v) 15~20%鹽酸活化2~6小時， 用蒸餾水洗至中性，100~150°C真空干燥12~24小時。其孔徑在80~200A之間，粒徑為 5~10ym的球狀多孔硅膠。 (2) 按照1 : 1~1 : 2(g/mL，m/v)將干燥的活化硅膠和硅烷偶聯(lián)劑分別加入裝有 NaAc緩沖液的三頸圓底燒瓶中，調(diào)節(jié)溫度80~90°C，機械攪拌反應(yīng)3~5h，然后依次用 NaAc緩沖液、甲醇、水依次洗滌干凈，真空干燥即可得到環(huán)氧基硅膠。 所述NaAc緩沖溶液濃度為45~55mmol/L，pH值為4. 5~6. 5。 (3) 按照1 : 0. 5~1 :l(g/g，m/m)將干燥的環(huán)氧基硅膠和膽固醇或膽酸分別加入 到干燥三頸瓶中，再依次加入1 : 1 : 0.l(mL/mL/mL，v/v/v)的無水乙醚、干燥的1，4_二 氧六環(huán)以及三氟化硼乙醚，在4~5°C條件下機械攪拌反應(yīng)3. 5~4. 5h。反應(yīng)結(jié)束之后分 別用無水乙醚、丙酮、甲醇、水清洗填料，真空干燥得到色譜填料。
5. 權(quán)利要求1所述的高效疏水相互作用色譜填料在變性蛋白的復性與純化應(yīng)用，其特 征在于 (1) 將該色譜填料用于還原變性的溶菌酶的復性與純化。當在流動相中添加了 2.0~ 3.Omol/L脲時，其質(zhì)量回收率及活性回收率分別為80~90 %和95~98%。 (2) 將該色譜填料用于重組人酪氨酸激酶配體（RecombinedhumanFlt3ligand， rhFL)的復性與純化。將rhFL變性抽提液直接進樣至流動相A平衡的色譜柱中，在優(yōu)化色 譜條件下，采用0-100%流動相B的30min線性梯度洗脫，得到的目標峰餾分質(zhì)量回收率為 45~50 %，純度為95~97 %，生物比活為7. 2~8. 0X108IU/mg。 (3) 將該色譜填料用于重組人干細胞因子（Recombinedhumanstemcellfactor， rhSCF)的復性與純化。將rhSCF變性抽提液直接進樣至流動相A平衡的色譜柱中，在優(yōu)化 色譜條件下，采用0-100 %流動相B的30min線性梯度洗脫，得到的目標峰餾分純度為95~ 98%，質(zhì)量回收率為55~65%，生物比活為1. 1~1.3X106IU/mg。 (4)所述的流動相六為2.5~3.0111〇1/1(順4)2504,20 . 0~50.0111111〇1/1腿2?04，口117.0~ 7.4 ;流動相B為20. 0~50.0 mmol/L KH2P04, pH 7. 0~7.4 ;或者所述的流動相A分別為 2. 5~3. Omol/L (NH4) 2S04, 20 . 0~50.0 mmol/L KH2P04, 2. 5~3. 5mol/L Urea，pH 7. 0~ 7.4 ;流動相B為20. 0~50.0 mmol/L KH2P04, 2. 5~3. Omol/L Urea，pH 7. 0~7.4〇 (5) 所述的流動相A和流動相B或稱為平衡緩沖液和洗脫緩沖液，不同是均添加2. 5~ 3.0mol/LUrea。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種制備和應(yīng)用具有特殊功能的高效疏水相互作用色譜(HPHIC)填料的方法。將細胞膜上的兩性功能分子膽固醇作為固定相配基，與硅膠基質(zhì)表面化學修飾獲得了仿生的HPHIC填料。該填料裝填的HPHIC柱采用鹽-水為洗脫體系，可應(yīng)用于天然蛋白質(zhì)分離，變性溶菌酶、重組人酪氨酸激酶配體(rhFL)包涵體和重組人干細胞因子(rhSCF)的復性與同時純化。
【IPC分類】B01J20-281, B01J39-16, B01J20-22, C07K1-20, B01J39-08, C12N9-36, C07K14-475, B01J20-30, C07K14-705
【公開號】CN104841375
【申請?zhí)枴緾N201510232604
【發(fā)明人】王驪麗, 屈倩, 袁潔, 楊毅聰
【申請人】西北大學
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月8日