一種蛋白質抗原決定基分子印跡材料及其制備和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于高分子材料制備技術及其在蛋白質識別中的應用，具體的說是一種新型的蛋白質抗原決定基分子印跡材料及其制備和應用。
【背景技術】
[0002]分子印跡技術是采用人工合成方法制備對目標分子進行特異性識別材料的技術。有關的最早報道是Klaus Mosbach等1993年在《Nature》上發(fā)表的有關利用非共價鍵合成茶堿分子印跡聚合物的報道，此后分子印跡材料作為一種人工合成高選擇性材料迅速進入全球眾多科學家的視野。目前，針對有機小分子和金屬離子的印跡工作已取得了巨大的進展，實驗方法和評價標準漸趨成熟，并已開始應用于臨床分析、催化合成等領域(Chen LX, Chemical Society Reviews, 40，2011，2922-2942)。在這些方面，分子印跡材料和天然分子識別系統(tǒng)相比，不僅具有高效選擇性，并且對各種物理和化學影響因素具有很高的耐受力，而且還可以重復使用，彌補了天然識別體系在使用過程中的諸多不足。與此同時，當小分子印跡的研究逐漸成熟的時候，分子印跡的研究開始轉向生物大分子(尤其是蛋白質)印跡。這向其最初創(chuàng)立時的夢想，“人工合成抗體”，又邁進了一步。目前文獻報道的蛋白質印跡聚合物制備方法主要包括3D分子印跡法(包埋法)、2D分子印跡法(表面印跡法)、金屬螯合印跡方法、Langmuir單層膜印跡法、表面微接觸印跡方法等(Yang KGet.al., Analytical and B1analytical Chemistry, 403，2012，2173-83.)。這些印跡方法中常常以完整蛋白質為模板分子，但是由于完整蛋白質模板分子難以獲得、價格昂貴，因此限制了蛋白質印跡材料的使用(SelIergren, B.Nature Chemisty, 2，2010，7)。
[0003]抗原決定基印跡是以目標蛋白上一段特異性多肽為模板分子進行印跡，由于模板肽段與目標蛋白間極強的特異性，形成的印跡位點對模板肽段及目標蛋白均具有特異性識別能力(Shea, KJ.Angwandte Chemie, 45, 2006, 2392-2396)。這種方法解決了蛋白質分子印跡中蛋白質難獲得、價格昂貴的問題；同時，多肽模板構象穩(wěn)定，增加了印跡位點識別的特異性。由于利用自由肽段為模板時模板利用率極低，因此需對模板進行固載；而此前報道的模板固定化方法具有模板難去除的不足，這限制了抗原決定基印跡方法的應用。
[0004]因此，我們以末端修飾了組氨酸標簽的抗原決定基肽段為模板，通過組氨酸標簽與金屬離子間的螯合作用對模板進行固定，聚合完成后，利用EDTA-Na的競爭性螯合作用對模板進行洗脫，制備得到可對目標蛋白進行選擇性識別的抗原決定基分子印跡材料。

【發(fā)明內容】

[0005]采用末端修飾了組氨酸標簽的目標蛋白抗原決定基肽段為模板分子，利用金屬螯合作用將模板分子固載于表面固定了金屬離子Ni2+的基質材料表面，通過功能單體的聚合形成分子印跡層，去除模板形成抗原決定基印跡材料；并且將該分子印跡材料用于標準目標蛋白的識別中。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為:
[0006](I)在基質材料表面通過化學修飾引入亞氨基二乙酸(IDA)基團，利用IDA基團與Ni2+的螯合作用，將Ni2+固載在基質材料表面。
[0007](2)利用固相合成多肽法制備末端修飾組氨酸標簽的模板分子。
[0008](3)在室溫條件下，在上述基質材料中按質量比1:1000-100:1000(模板:基質材料)加入模板肽段溶液，室溫下孵育(2分鐘-5小時)，使模板固載于基質材料表面，其中基質材料的質量濃度為0.2mg/ml-500mg/mlo
[0009](4)隨后以一定的質量比在上述固載了模板的基質材料中加入功能單體，預組裝一定時間(2分鐘-5小時)后，加入引發(fā)劑，攪拌情況下聚合；其中自由基類單體如甲基丙烯酸(MAA)、N, N’-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)、甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)等對應引發(fā)劑偶氮二異丁(AIBN)、過硫酸銨、過氧化二苯甲酰等；多巴胺、苯胺、硅烷等單體對應酸性或堿性物質作為引發(fā)劑。
[0010](5)聚合完成后，反復用20mM-lM的EDTA-Na水溶液清洗聚合物材料，使其中的模板分子洗脫出來，直至洗脫液中檢測不出模板分子，進而得到抗原決定基分子印跡材料(MIP)。
[0011](6)在基質材料上不固載模板分子，通過上述相同的步驟制備得到非印跡微球(NIP)。
[0012](7)將該分子印跡材料用于目標蛋白的選擇性識別中。
[0013]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0014](I)本發(fā)明利用末端修飾了組氨酸標簽的抗原決定基肽段為模板，通過金屬螯合作用將模板肽段固定于表面修飾了 Ni2+的基質材料表面(Zhang LH, et.al., Chemical Communi cat 1n, 47，2011，3969-3971)。這種方法簡單，高效，同時保證了所有肽段的固載效率一致，不同肽段同時固載時無歧視，是一種通用的模板固載方法。
[0015](2)本發(fā)明采用人工合成肽段為模板，而不是蛋白質分子，解決了蛋白質分子印跡中蛋白質難獲得、價格昂貴的問題；同時，多肽模板構象穩(wěn)定，增加了印跡位點識別的特異性。
[0016](3)本發(fā)明可采用多種不同的功能單體進行聚合形成印跡位點。多種功能單體的利用可極大程度的提供多種豐富的相互作用，保證形成的印跡位點對目標肽段及目標蛋白的特異性識別。
[0017](4)本發(fā)明采用EDTA-Na溶液對模板進行洗脫，此方法不涉及強酸、強堿、強氧化還原條件的使用，條件溫和，不會破壞印跡位點，可進一步提高印跡位點的識別的特異性。
[0018](5)本發(fā)明基質材料制備過程、模板固載過程、聚合過程及模板去除過程均具有通用性，極大程度的保證了此方法在不同目標蛋白質抗原決定基印跡材料制備中的通用性及普適性。
【附圖說明】
[0019]圖1.人血清白蛋白抗原決定基印跡材料(MIP)及非印跡材料(NIP)的透射電鏡圖；
[0020]圖2 (a).人血清白蛋白抗原決定基印跡材料(MIP)及非印跡材料(NIP)對人血清白蛋白抗原決定基的吸附容量圖；
[0021]圖2 (b).人血清白蛋白抗原決定基印跡材料(MIP)及非印跡材料(NIP)對人血清白蛋白的吸附容量圖；
[0022]圖3.人血清白蛋白抗原決定基印跡材料(MIP)及非印跡材料(NIP)對人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、細胞色素c (Cyc)的選擇性識別，縱坐標為印跡因子；
[0023]圖4.MIP2、NIP2對人血清白蛋白抗原決定基的吸附容量圖；
[0024]圖5.MIP3、NIP3對人血清白蛋白抗原決定基的吸附容量圖；
[0025]圖6.MIP4、NIP4對人血清白蛋白的吸附容量圖；
[0026]圖7.MIP5、NIP5對人血清白蛋白的吸附容量圖。
[0027]實施例1
[0028](I)人血清白蛋白抗原決定基印跡微球材料的制備
[0029]采用溶劑熱法制備包被有娃層的磁性納米粒子作為基質材料。取基質材料50mg,加入Iml0.5mg/ml人血清白蛋白模板肽段(AASQAALGLHHHHHH)(吉爾生化上海有限公司)溶液，于25°C下孵育使模板固定于基質表面(模板與基質材料的質量比為10:1000)。沖洗未固定的模板肽段后，重懸基質于25ml水中，加入15mg多巴胺(單體與基質材料質量比為0.3:1), 30°C機械攪拌下預組裝30min,加入0.5mllM tris-HCl緩沖液(pH8.0),機械攪拌下自聚合5h，磁鐵輔