環(huán)氧基磁性納米硅球的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米材料和蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種固定化金屬離子親和磁性納米顆粒的制備及其富集卵黃高磷蛋白磷酸肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]卵黃高磷蛋白磷酸肽(Phosvitin PhosphopeptidesjI^lPPPs)是從卵黃高磷蛋白酶解物中提取的一種多種短肽的混合物，可促進(jìn)鈣、鐵、鋅等金屬離子的吸收。而其中，鈣是人體中含量最多的微量元素，具有重要的生理功能，被稱為人體的“環(huán)境衛(wèi)士”。然而鈣的缺乏和吸收效率低已成為當(dāng)今的全球性問題，因此補(bǔ)鈣已成為當(dāng)務(wù)之急。迄今為止，大量的研究結(jié)果表明:相比于已商品化的補(bǔ)I丐產(chǎn)品一酪蛋白磷酸肽(Case in Phosphopept i des，簡(jiǎn)稱CPPs)，PPPs在抑制鈣形成不溶性的化合物方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。因此可見，開發(fā)PPPs作為補(bǔ)鈣產(chǎn)品具有重要的實(shí)際研究?jī)r(jià)值。
[0003]目前，可用于PPPs富集的方法主要有乙醇鈣沉淀法，離子交換法和膜分離法。其中，乙醇鈣沉淀法具有乙醇消耗量大，且溶劑殘留；離子交換法操作復(fù)雜，且需要大量的酸液堿液再生，對(duì)環(huán)境會(huì)造成較大程度的污染；而膜分離法工序繁瑣，對(duì)設(shè)備條件要求較高。因此，尋找一種高效、安全、成本低，工藝簡(jiǎn)單的PPPs富集方法具有重要的研究?jī)r(jià)值。
[0004]針對(duì)上述方法存在的技術(shù)關(guān)鍵問題，本發(fā)明引進(jìn)磁性納米分離技術(shù)。磁性納米分離技術(shù)是以磁性納米載體為依托的高新分離技術(shù)，當(dāng)顆粒的粒徑小于30 nm時(shí)，則具有超順磁性，稱為超順磁性納米顆粒；超順磁性納米顆粒具有較強(qiáng)的磁響應(yīng)性，在外加磁場(chǎng)的作用下，磁性顆?？梢钥焖俑患?、定位，當(dāng)外加磁場(chǎng)消失后，顆粒的磁性也隨即快速消失，目前已在生物醫(yī)藥、生物技術(shù)、化學(xué)、環(huán)境治理等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，成為當(dāng)今最富有發(fā)展前景的新型分離技術(shù)之一。目前，磁性載體材料是近年來發(fā)展起來的用于生物活性成分分離純化的新型載體材料，與非磁性載體材料相比，以磁性材料作為分離介質(zhì)可以使待分離的生物活性成分容易從反應(yīng)體系中分離、回收，并可在外加磁場(chǎng)的作用下實(shí)現(xiàn)高效分離，解決了傳統(tǒng)機(jī)械攪拌對(duì)生物活性成分活性降低的局限。
[0005]固定化金屬離子親和色譜(Immobilizedmetal affinity chromatography,IMAC)主要是通過所固定的金屬離子與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的配位作用進(jìn)行吸附與分離，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，目前已經(jīng)成為最為普及的磷酸化肽富集方法。本發(fā)明就是利用Fe3+對(duì)磷酸肽所具有的特定吸附作用，將磁性納米分離技術(shù)與IMAC相結(jié)合制備得到了固定化金屬離子親和磁性納米材料，并將其應(yīng)用于蛋黃中PPPs的富集。目前固定化金屬離子親和磁性納米材料在PPPs的富集工藝中未見報(bào)道。本發(fā)明采用Fe3+對(duì)環(huán)氧基化磁性納米娃球進(jìn)行表面功能化修飾，賦予其特異性分離目標(biāo)組分的功能，且制備所得的磁性納米載體可實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用，大大降低了工業(yè)化生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種雙表面活性劑修飾的磁性納米顆粒的制備方法，制備所得的顆粒形貌規(guī)整、粒徑均一、磁響應(yīng)性強(qiáng)，具有良好的生物相容性。采用所制備的環(huán)氧基磁性納米顆粒富集PPPs，操作簡(jiǎn)便、成本低廉，生產(chǎn)周期短，解決了傳統(tǒng)PPPs富集困難、步驟繁瑣等問題。
[0007]本發(fā)明的方法具體按照下述步驟進(jìn)行:
1、環(huán)氧基磁性納米娃球的制備方法，按照下述步驟進(jìn)行:
(I)雙表面活性劑修飾Fe3O4磁性納米顆粒的制備:將一定摩爾比例的Fe 2+、Fe3+鹽和PEG 6000溶解在體積比1:1?10:1的純水一無水乙醇的混合溶液中，控制體系溫度為40?70°C，除氧30 min，整個(gè)反應(yīng)在機(jī)械攪拌下進(jìn)行；之后緩慢滴加堿液到反應(yīng)體系中，使體系pH值達(dá)到10?11，攪拌反應(yīng)30 min后加入另外一種表面活性劑(與Fe3+的摩爾比為1:1 )，隨即將反應(yīng)溫度迅速升高到70?90°C，繼續(xù)反應(yīng)I?6 h，終止反應(yīng)，并在外加磁場(chǎng)的作用下快速分離出磁性顆粒，用去離子水清洗數(shù)次以去除未反應(yīng)完全的化學(xué)物質(zhì)，直至最后溶液的pH在7左右。收集黑色顆粒，并進(jìn)行冷凍干燥，備用。
[0008](2)磁性納米娃球的制備:準(zhǔn)確稱取一定量的步驟(I)所得的磁性納米顆粒，用去離子水和無水乙醇稀釋后，再加入一定量的NH3.Η20，形成混合溶液(其中去離子水、無水乙醇、NH3.H2O的體積比為2:10:1)，且磁性納米顆粒的濃度達(dá)到5mg/mL ;在攪拌過程中逐滴加入正硅酸乙酯(TEOS) (TE0S與NH3.H2O的體積比為1:2)，于40 °C下攪拌12 h ;攪拌結(jié)束后，用磁鐵收集復(fù)合微球，去離子水反復(fù)清洗，冷凍干燥，即制得經(jīng)3102包覆的磁性納米娃球。
[0009](3)環(huán)氧基修飾磁性納米硅球的制備及活化:取一定量的步驟(2)所得的磁性納米硅球，用體積比為1:1的去離子水和無水乙醇的混合溶液進(jìn)行稀釋，且磁性納米硅球最終濃度達(dá)到I mg/mL，并用醋酸調(diào)節(jié)pH到4~5 ;之后向溶液中逐滴加入一定量的環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑A-187 (其中A-187與無水乙醇的體積比為1: 10)，放入搖床中(設(shè)定溫度為37 °C，轉(zhuǎn)速為150 rpm)震蕩吸附，反應(yīng)24 h ;之后將反應(yīng)后的磁性顆粒反復(fù)用水沖洗幾次后用磁鐵收集，待用。
[0010](4)固定化金屬離子親和磁性納米娃球(簡(jiǎn)寫為IMAN)制備:配制濃度為10 mg/mL的FeCl3.6H20溶液，加入準(zhǔn)確稱重的經(jīng)環(huán)氧基修飾的磁性納米硅球，并使其濃度達(dá)到5mg/mL，在室溫下振蕩吸附2h，使Fe3+與磁性納米顆粒表面基團(tuán)分子充分反應(yīng)完全，即可得IMAN0
[0011]其中步驟(I)所述的可溶性的Fe2+化合物是四水氯化亞鐵或七水硫酸亞鐵；可溶性的Fe3+化合物是六水氯化鐵；其中Fe2+與Fe3+的摩爾比為1:2?2:1，總鐵離子濃度為0.03 ?0.5M。
[0012]其中步驟(I)所述的所用堿液為氨水或氫氧化鈉或兩者的混合物。
[0013]其中步驟(I)所述的表面活性劑為十二烷基苯磺酸鈉和十六烷基三甲基溴化銨中的任何一種，其中步驟(I)所述的表面活性劑與Fe3+的摩爾比為1:1。
[0014]其中步驟(2)所述的去離子水、無水乙醇、NH3.H2O的體積比為2:10:1，正硅酸乙酯TEOS與NH3.H2O的體積比為1:2。
[0015]、環(huán)氧基磁性納米硅球用于富集卵黃高磷蛋白磷酸肽的方法，按照下述步驟進(jìn)行:
(I) PPPs的吸附原液制備 A、新鮮雞蛋進(jìn)行蛋清和蛋黃的分離，將蛋黃置于濾紙上除去附著的蛋清，用針挑破膜，收集蛋黃內(nèi)容物，之后進(jìn)行噴霧干燥，得蛋黃粉；蛋黃粉經(jīng)95%乙醇脫脂處理(脫脂率95.2%)，之后于60°C烘干，并保存于干燥環(huán)境中。
[0016]B、脫磷、酶解:稱取脫脂蛋黃粉于0.1M的NaOH溶液中，于37°C下反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后迅速用0.1M鹽酸將pH調(diào)節(jié)至8.00用去離子水稀釋3?5倍，之后用3000K超濾膜進(jìn)行超濾處理，并將超濾后的濾液轉(zhuǎn)移到酶解反應(yīng)器里，加入胰蛋白酶(底物:酶量=10:1)，pH 8.0，50°C下酶解4h，并用0.1M NaOH調(diào)節(jié)pH，使酶解液的pH維持在8.0。水解結(jié)束后于80°C下滅酶lOmin，待冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至4.5，酶解液于9000r/min 4°C下離心lOmin，取上清液，此上清液作為PPPs的吸附原液，測(cè)N、P含量，計(jì)算N/P。
[0017](2) PPPs的富集
將IMAN加入到含有PPPs的吸附原液中，在一定溫度下攪拌反應(yīng)一定時(shí)間，使溶液中的PPPs特定地吸附在IMAN表面，在外加磁場(chǎng)的作用下將吸附有PPPs的磁性納米顆粒從反應(yīng)溶液中分離出來，用去離子水清洗三次去除雜質(zhì)，再用洗脫液進(jìn)行洗脫，收集PPPs的洗脫液，測(cè)隊(duì)？含量，計(jì)算~卩。
[0018]其中所述步驟(2)中富集過程中選用的溫度為15?45°C。
[0019]其中所述步驟(2