檢測(cè)全血中肌酸激酶同工酶的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)和微流控芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)CK-MB高靈敏定量檢測(cè)的方法，特別公開了一種檢測(cè)全血中肌酸激酶同工酶的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，可實(shí)現(xiàn)全血樣本中CK-MB的準(zhǔn)確、高靈敏定量檢測(cè)，屬于微流控芯片化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)前我國(guó)心血管疾病的防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻，心血管疾病發(fā)病率呈不斷上升態(tài)勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，心血管病死亡率占人口死亡的40%，因此做好早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防、早救治，提高心血管病防治水平是關(guān)鍵。心血管疾病常用檢測(cè)指標(biāo)為心肌酶譜系列。心肌酶是指心肌細(xì)胞內(nèi)的酶類物質(zhì)，具有催化心肌細(xì)胞代謝和調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞電活動(dòng)的作用。心肌酶譜包括乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)等。如心肌細(xì)胞受損，這些酶會(huì)釋放到血液。因此心肌酶譜升高程度可間接衡量心肌細(xì)胞的損害程度。其中CK和CK-MB是靈敏度較高的指標(biāo)，能在發(fā)病早期心肌尚未大面積壞死時(shí)，在患者血液中檢測(cè)出來，第一時(shí)間為臨床提供可靠資料。
[0003]CK是由兩種不同亞基(M和B)組成的二聚體，正常人體組織主要含3種同工酶，SPCK-MM、CK-BB、CK-MB<XK-MM主要存在于肌肉細(xì)胞中，CK-BB主要存在于腦細(xì)胞中，CK_MB主要存在于心肌細(xì)胞中。
[0004]CK-MB是目前常用的心肌損傷標(biāo)志物，曾一度被視為診斷心肌梗死的“金標(biāo)準(zhǔn)”。CK-MB在急性心肌梗死發(fā)病后4?8小時(shí)內(nèi)增高，24小時(shí)達(dá)峰值，兩三天恢復(fù)正常。CK-MB因其具有重要的生理功能和臨床應(yīng)用價(jià)值已引起人們廣泛的重視和深入的研究。
[0005]傳統(tǒng)上多用酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法及膠體金免疫層析法等測(cè)定血清中的CK-MB。但酶聯(lián)免疫吸附法操作復(fù)雜，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng);化學(xué)發(fā)光法對(duì)技術(shù)要求高，不易在臨床實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行常規(guī)開展。膠體金免疫層析法雖然具有標(biāo)本用量少，簡(jiǎn)便快速，便宜的優(yōu)勢(shì)，然而當(dāng)遇到某些樣本中抗原或抗體含量極低時(shí)，膠體金的顏色將很淺，很難用肉眼來判斷結(jié)果，容易出現(xiàn)誤判，靈敏度較低。
[0006]中國(guó)專利200610114997.9公布了一種血清中肌酸激酶同工酶的化學(xué)發(fā)光測(cè)定方法，其主要利用肌酸激酶催化磷酸肌酸與二磷酸腺苷反應(yīng)生成三磷酸腺苷和肌酸，再用甘油激酶催化三磷酸腺苷和甘油生成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油被磷酸甘油氧化酶氧化并產(chǎn)生過氧化氫，再經(jīng)過氧化物酶作用，過氧化氫使魯米諾氧化而發(fā)光。中國(guó)專利200520041211.6披露了一種心血管疾病診斷和預(yù)測(cè)多指標(biāo)蛋白芯片檢測(cè)試劑盒，該試劑盒采用化學(xué)發(fā)光法(如辣根過氧化氫酶和魯米諾)檢測(cè)，并能同時(shí)檢測(cè)C反應(yīng)蛋白、肌紅蛋白、心肌肌鈣蛋白1、肌酸激酶同工酶等八種抗體。雖然化學(xué)發(fā)光法靈敏度較高，但重復(fù)性和穩(wěn)定性均較差，且配套儀器昂貴，不能單人份快速即時(shí)檢測(cè)，限制了他們的廣泛應(yīng)用。
[0007]因此開發(fā)快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測(cè)方法，具有巨大發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。與熒光和吸收光相比，化學(xué)發(fā)光沒有外來激發(fā)光源背景信號(hào)干擾，交叉干擾小，靈敏度高、線性范圍寬。微流控芯片技術(shù)把樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，可完成全過程分析。
[0008]針對(duì)現(xiàn)有CK-MB檢測(cè)方法的不足和缺陷，微流控磁微粒化學(xué)發(fā)光方法利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光和微流控技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)CK-MB準(zhǔn)確、高靈敏定量檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為針對(duì)現(xiàn)有快速診斷方法靈敏度低、重復(fù)性差、受干擾明顯，以及現(xiàn)有化學(xué)發(fā)光配套儀器昂貴、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的問題，提供一種檢測(cè)全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片，通過集成化芯片(把除測(cè)試樣本外所有組分均集成到芯片內(nèi))并配套小型便攜設(shè)備，從而實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)樣本中CK-MB的快速、準(zhǔn)確、高靈敏定量檢測(cè)。
[0010]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0011]—種檢測(cè)全血中肌酸激酶同工酶的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，所述微流控芯片包括頂板(I)結(jié)構(gòu)和底板(2)結(jié)構(gòu)，其中頂板(I)上的氣栗(3)、加樣口(4)、樣本填充區(qū)(12)、標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池(5)和樣本混合區(qū)(13)依次連接;底板上的過濾區(qū)(6)、磁顆粒包被區(qū)(7)、清洗區(qū)(14)、檢測(cè)區(qū)(8)、液體釋放通道(16)依次連接;底板的檢測(cè)區(qū)(8)分別與清洗液存儲(chǔ)池(9)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)通過液體釋放通道(16)連接；
[0012]所述標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池(5)存儲(chǔ)預(yù)封裝酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗CK-MB抗體，磁顆粒包被區(qū)
(7)包被預(yù)封裝磁顆粒標(biāo)記抗CK-MB抗體，清洗液存儲(chǔ)池(9)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(I O)存儲(chǔ)預(yù)封裝清洗液和發(fā)光基底液;所述微流控芯片測(cè)試流程中，用磁鐵操控磁顆粒移動(dòng)或聚集；所述標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池、清洗液存儲(chǔ)池和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池為液體密封池，可通過外力擠壓而局部破裂，釋放液體;所述過濾區(qū)包含濾血膜，所述頂板(I)與底板(2)用膠帶(19和20)密封。
[0013]具體地，本發(fā)明所述的微流控芯片，其發(fā)光基底液保質(zhì)期少于I年時(shí)應(yīng)分開，用發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A(23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B(24)替代發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)，所述發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A( 23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B (24)通過預(yù)混合通道(25)連接。
[0014]具體地，所述磁顆粒標(biāo)記抗CK-MB抗體使用的磁顆粒為包含三氧化二鐵和四氧化三鐵化合物的超順磁性顆粒，磁顆粒尺寸為0.1??ομπι，與磁珠匹配的磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為500?30000高斯。
[0015]優(yōu)選地，所述磁顆粒標(biāo)記抗CK-MB抗體使用的磁顆粒包含三氧化二鐵和四氧化三鐵化合物，磁顆粒尺寸為I?3μπι，與磁珠匹配的磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為1000?8000高斯。
[0016]具體地，所述酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗體溶液、磁顆粒標(biāo)記抗體溶液和清洗液均包含緩沖液、蛋白質(zhì)、表面活性劑和防腐劑，且磁顆粒標(biāo)記抗體溶液還包含糖類。
[0017]具體地，所述酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗體溶液包含牛血清白蛋白、吐溫-20和Proclin300的pH7.4 Tris-HCl緩沖液;所述磁顆粒標(biāo)記抗體溶液包含牛血清白蛋白、葡萄糖、吐溫_20和Proclin300的pH7.4 Tris-HCl緩沖液;所述清洗液包含牛血清白蛋白、曲拉通X-100和Proclin300 的 pH7.4Tris_HCl 緩沖液。
[0018]具體地，所述酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗體溶液包含牛血清白蛋白、吐溫-20和Proclin300的pH7.4磷酸鹽緩沖液;所述磁顆粒標(biāo)記抗體溶液包含牛血清白蛋白、酪蛋白、蔗糖、吐溫-20、曲拉通X-100和Proc I in300的pH7.4磷酸鹽緩沖液;所述清洗液包含牛血清白蛋白、吐溫20、曲拉通乂-100和?抓(:1111300的?!17.4磷酸鹽緩沖液。
[0019]具體地，本發(fā)明所述微流控芯片的配套儀器為小型便攜設(shè)備，包含擠壓氣栗和存儲(chǔ)池，磁鐵移動(dòng)，發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)等功能。
[0020]本發(fā)明所述微流控芯片制備方法如下:
[0021 ]步驟I)酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗CK-MB抗體，磁顆粒標(biāo)記抗CK-MB抗體，這兩種抗體可相同或不同；
[0022]步驟2)將酶或發(fā)光劑標(biāo)抗體溶液放入頂板的標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池中，密封，將磁顆粒標(biāo)記抗體溶液放入底板的磁顆粒包被區(qū)中，干燥，將清洗液和發(fā)光基底液分別注入清洗液存儲(chǔ)池和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池中，密封，用膠帶(19和20)密封頂板和底板，并組裝成微流控芯片。
[0023]本發(fā)明提供的一種檢測(cè)全血中肌酸激酶同工酶的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片是一種以化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)、在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)CK-MB快速、準(zhǔn)確、高靈敏檢測(cè)的微流控芯片。
[0024]這種芯片是將抗CK-MB抗體修飾酶，抗CK-MB抗體修飾在磁顆粒上，利用抗原抗體作用，如雙抗體夾心法原理結(jié)合磁顆粒富集、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)全血樣本中是否含有CK-MB，并準(zhǔn)確分析其含量。
[0025]本發(fā)明中所述酶，包含但不限于過氧化氫酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)。發(fā)光基底液為酶對(duì)應(yīng)的發(fā)光底物(如魯米諾或金剛烷)和發(fā)光增強(qiáng)液(如苯衍生物等增強(qiáng)劑)，其中發(fā)光底物和發(fā)光增強(qiáng)液可合并，如圖1所示混合均勻后注入一個(gè)發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10);但當(dāng)混合液保質(zhì)期少于I年時(shí)應(yīng)分開，如圖3所示分別注入發(fā)光基底