一種懸浮型活性固定化酶催化劑的制備方法
【技術領域】
[0001]—種懸浮型活性固定化酶催化劑的制備方法，屬于酶生物催化有機合成領域。
【背景技術】
[0002]酶催化具有高效性、多樣性、區(qū)域選擇性、化學選擇性以及反應條件溫和等特點，可縮短合成路線，使生產過程更加簡單，能耗小，對環(huán)境友好，業(yè)已成為當今精細化學品綠色合成催化劑應用領域的研究熱點。而目前食用香精脂肪酸酯類多以化學法合成為主，一般通過強酸類物質等催化酯化制備得到，還使用有機溶劑等物質，對環(huán)境污染大，同時存在產品副反應多、色澤深、能耗高、有毒成分殘留等問題，因而在當今食品安全及環(huán)境保護日趨嚴格的形勢下，生物酶法催化酯化技術被認為是取代化學法生產脂肪酸酯的綠色工藝，應用前景廣闊。同時，生物酶也存在價格高、易失活、游離酶在反應過程中易結塊、不易回收、重復使用率低等缺點。因此，研究采用各種技術手段將生物酶固定在某種載體上，以維持更高的酶活性，提高酶的穩(wěn)定性和重復使用率，是當前常用的技術思路。生物酶固定化的方法是指將酶通過吸附法或共價結合法負載到載體上。其中，吸附法存在著酶易脫落、酶活性低、重復使用率低、分離難等問題;共價結合法是指利用載體表面的活性基團與酶分子的功能活性基團形成共價鍵牢固連接而固定的一種方法，其需要尋找盡可能溫和的共價鍵合反應物，在反應時避免酶的失活，另外需要尋找適宜的易分離負載材料，盡可能提高負載率和催化活性，具有較大技術難度。本發(fā)明旨在通過選擇天然無毒、高負載率材料制備固定化酶催化劑，并同時實現(xiàn)合成反應后固定化酶催化劑的易分離，以提高酶的重復使用率。凹凸棒土為一種晶質水合鎂鋁硅酸鹽礦物，具有獨特的層鏈狀結構特征，晶體呈針狀、纖維狀或纖維集合狀，具有優(yōu)異的吸附、脫色、耐高溫等性能，其在我國蘊藏量豐富，價廉易得?；诎纪拱敉羶炔坑卸喾N孔道，外比表面積和內比表面積都非常大，具有優(yōu)異的吸附性等特性，本發(fā)明選用其作為酶固定載體，當某種酶寄附于凹凸棒土晶體內部的大孔穴表面上時，可以產生協(xié)同催化效應，使反應速度加快，而反應生成物又可以從坡縷石粘土內部擴散釋放出來，凹凸棒土晶體格架不被破壞；同時考慮到固定化酶存在的在合成后分離困難、不易回收等問題，本發(fā)明設計采用在反應液中可懸浮的顆粒材料，與凹凸棒土復合，制成懸浮型活性固定化酶催化劑，以解決催化劑在反應過程中及合成結束后的聚結、難分離問題，進一步提高酶催化效能和重復利用率。漂珠是粉煤灰中的一種能浮于水面的空心微珠，化學成分以S12和Al 203為主，具有壁薄中空、質量輕、吸附性能好、無毒價廉等特點。本發(fā)明將漂珠作為懸浮載體，負載凹凸棒土，制備懸浮型活性固定化酶催化劑，其具有高效催化、易分離回收再利用的特性，對開拓酶催化酯化技術應用領域，開發(fā)凹凸棒土、漂珠資源的高附加值產品市場具有現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明選取一定粒徑的漂珠及高比表面積多孔天然材料凹凸棒土，將經活化處理的凹凸棒土微粒以一定配比附接在漂珠表面，制成復合載體;再通過在復合載體表面引入的能夠與酶發(fā)生特異性共價反應的活性基團，可在溫和條件下實現(xiàn)與酶的鍵合固定，并發(fā)揮協(xié)同催化效應，提高酶的活性和反應轉化率，并提高其穩(wěn)定性。此制備技術可以應用于脂肪酸酯類酶催化合成，特別適于食用香精類如戊酸乙酯、己酸乙酯等的合成，其轉化率高，后處理簡單，易回收，重復利用率高，環(huán)保無污染，生產成本低，應有較好的應用前景。
[0004]本發(fā)明的技術方案:一種懸浮型活性固定化酶催化劑的制備方法，具體步驟為:
[0005]一、漂珠的活化處理
[0006]選取粒徑范圍為100-200μπι的漂珠，將Ig漂珠浸泡在10-20g 5_10%的稀硝酸中5_6h，50-60°C攪拌30min-lh，再超聲分散20-30min，靜置。濾出顆粒物，用去離子水洗滌，至洗液PH值為中性;將處理后的漂珠在200-300°C下加熱l_2h，冷卻，即制得活化漂珠，密閉干燥保存，備用(記為A)。
[0007]二、活性凹凸棒土的制備
[0008]1、凹凸棒土的活化處理
[0009]步驟:將1g凹凸棒土加至150-200g 5_10%的鹽酸或硫酸溶液中，于40_60°C攪拌30min-lh，超聲分散30min-lh，靜置;離心沉淀分離后用去離子水洗滌，至洗液pH值為中性；將處理后的凹凸棒土在200-300°C下加熱l_2h，冷卻，即制得活性凹凸棒土，密閉干燥保存，備用。
[0010]2、功能化凹凸棒土的制備
[0011]步驟:將上述所得活性凹凸棒土加至pH為2的鹽酸溶液中，于30-40°C攪拌20-30min，超聲分散30-45min;再將上述分散液加到過量的2_( 3，4-二羥基苯基)乙胺水溶液中，劇烈攪拌1-1.5h，使2-(3，4-二羥基苯基)乙胺與活化凹凸棒土表面充分螯合;將試液離心分離，所得固體粉粒用去離子水洗滌，至洗液PH值為中性;再在80-95°C下真空干燥24h，得到表面活性基團修飾的功能化凹凸棒土(記為B)。
[0012]三、復合載體的制備
[0013]步驟:將IgA加入到裝有固體含量為2-3%的10mL水性樹脂的燒杯中，室溫下攪拌10-20min，濾出顆粒物，平鋪在潔凈的搪瓷盤中，50_60°C下真空干燥2h;取5_8g B慢慢加至上述搪瓷盤中與A混合，不斷篩動、翻勻，直至顆粒物呈滾動狀;再在130-150°C下真空干燥lh，取出冷卻，篩分去除多余B，即得復合載體(記為C)，密閉干燥保存，備用。
[0014]四、懸浮型活性固定化酶催化劑的制備
[0015]步驟:將0.5gC加入到200mL Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH 7.0)中，超聲分散20-30min后，向上述溶液中加入10mL 50 %的戊二醛溶液，室溫下攪拌，活化3_5h后，分離，所得固體產物用去離子水洗滌;再將上述產物加到含0.5g脂肪酶的300mL Tris-HCl緩沖液(0.05moI/L，pH 7.0)中，在4°C下反應15-24h后，分離，洗滌，得到懸浮型活性固定化酶催化劑顆粒，冷凍干燥后儲存于_20°C下備用。
[0016]本發(fā)明的有益效果:通過應用本發(fā)明制備所得的懸浮型活性固定