一種納米復合材料結合質譜鑒定磷酸化肽段的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于先進納米材料與納米技術領域，具體涉及一種納米復合材料結合質譜 鑒定磷酸化肽段的方法，特別是涉及一種石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化鈦微球以及介 孔二氧化硅的納米復合材料結合MALDI-TOF MS用于磷酸化肽富集與檢測的方法。 技術背景
[0002] 蛋白質或多肽的磷酸化是生命過程中最為普遍的翻譯后修飾之一。它與細胞分 裂、增殖、分化、迀移和細胞間信號傳遞等許多重要的復雜生物過程息息相關。內源性的磷 酸化肽段指的是生物樣品中天然含有的那些經(jīng)過磷酸化修飾的肽段。一些研究表明，內源 性的磷酸化肽段的表達水平與很多疾病關系密切，尤其是癌癥等人類重大疾病。所以對內 源性磷酸化肽的研究對疾病的早期診斷有著重要的意義。質譜分析是目前多肽組學所采用 的主要分析手段。但內源性磷酸化肽的豐度往往非常低，并且內源性磷酸化肽段的質譜響 應會受到非磷酸化肽和蛋白質的壓制，樣品中的鹽分和表面活性劑同樣也會對其質譜行為 產(chǎn)生干擾，使得內源性磷酸化肽的電離效率非常低，質譜檢測相對較為困難。因此在使用質 譜方法分析復雜生物樣品中的內源性磷酸化肽段之前，對樣品中的內源性磷酸化肽段進行 選擇性富集是十分必要的。
[0003] 隨著近年來研究的不斷深入，許多方法都被用來選擇性分離富集磷酸化蛋白和多 肽，比如免疫沉淀法、固相萃取法、超濾法、強陽離子交換色譜法、固定金屬離子親和層析法 (MAC)、金屬氧化物親和層析法(MOAC)等等。其中MOAC方法應用最為廣泛，效果也較好。通 過金屬氧化物中金屬中心與磷酸化多肽上的磷酸基團間發(fā)生配位相互作用，從而起到富集 磷酸化多肽的效果。傳統(tǒng)的MOAC方法操作簡便、快速、成本低廉，并且相比于IMAC方法，選擇 性好、非磷酸化肽段干擾少。因此，許多MOAC材料被制備出來，廣泛應用于磷酸化肽段的富 集中。但是傳統(tǒng)MOAC方法由于在富集前需要先對生物樣品進行酶解，將所有蛋白質酶切為 肽段后再進行富集和質譜分析。這個步驟不但會影響內源性磷酸化肽和非內源性磷酸化肽 段的磷酸化水平，更會極大的增加數(shù)據(jù)分析的難度，使后續(xù)的數(shù)據(jù)處理步驟變得繁瑣而困 難。
[0004] 介孔材料由于有著狹窄而有序的孔道、非常高的比表面積、連續(xù)可調的孔徑等優(yōu) 點而被人們廣泛關注，近年來發(fā)展迅速。由于介孔材料具有狹窄且十分有序的孔道，可以使 體積較小的肽段鉆入孔道，而將體積較大的蛋白質阻擋在材料外部，來實現(xiàn)對肽段的富集。 這可以避免酶切步驟，從而大大降低了因為樣品前處理步驟所引入的對樣品復雜程度的影 響。本發(fā)明首次合成了結合傳統(tǒng)MOAC材料和介孔材料優(yōu)點的納米復合材料，并應用于內源 性磷酸化肽段的分離富集。由于介孔二氧化硅良好的體積排阻效應和石墨烯高的表面積以 及二氧化鈦與磷酸基團間的親和作用，使得該納米復合材料可以對復雜生物樣品中的內源 性磷酸化肽段進行選擇性富集，大大提高了磷酸化肽段的質譜信號。對磷酸化肽段的檢測 限可達5 amol/yL，對非磷酸化肽段的選擇性達1:1000(質量比），與磷酸化蛋白和非磷酸化 蛋白的體積排阻效應達1:500:500 (質量比）。
[0005] 本發(fā)明所涉及的具有介孔結構的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化鈦微球以及 介孔二氧化硅的納米復合材料，合成方法簡單快速，二氧化鈦微球對磷酸化肽具有高靈敏 度和高選擇性，石墨烯提高了有效表面，介孔二氧化硅層賦予了材料較好的體積排阻效應。 此納米復合材料可用于選擇性地富集生物樣品中的低豐度的磷酸化肽和內源性磷酸化肽， 并用于MALDI-TOF MS檢測。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明目的在于提供一種納米復合材料結合質譜鑒定磷酸化肽段的方法。
[0007] 本發(fā)明提出的一種納米復合材料結合質譜鑒定磷酸化肽段的方法，具體步驟為： 將納米復合材料配置成為10mg/mL的分散液，溶劑為超純水，將該分散液與磷酸化肽段溶液 加入到由體積比為50%乙腈和0.1%三氟乙酸緩沖液組成的混合液中混合，在酶解儀中孵育 30分鐘;通過離心分離納米復合材料，用體積比50%乙腈和0.1%三氟乙酸緩沖液組成的混合 液洗滌，隨后用0.4M氨水洗脫;取IyL洗脫液直接在MALDI-TOF MS進樣靶板上點靶，干燥后 再點加 IyL濃度為20mg/mL的2,5_二羥基苯甲酸溶液于該液滴上，形成基質結晶，進行質譜 分析； 其中，所述的納米復合材料為石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化鈦微球以及介孔二氧 化娃的納米復合材料。
[0008] 本發(fā)明中，納米復合材料的具體制備步驟如下： (1) 用濃硝酸對石墨烯進行酸化，在60°C條件下反應7小時得到酸化石墨烯，隨后用去 離子水充分洗滌酸化石墨烯，到洗液呈中性為止，在40_60°C下真空干燥； (2) 配置三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液，溶劑為體積比為1:2的去離子水和乙醇，將 步驟（1)所得的酸性石墨烯分散于緩沖液中，超聲數(shù)分鐘，加入多巴胺鹽酸鹽，在室溫下機 械攪拌反應6-20小時，制得聚多巴胺包覆的石墨烯;離心分離產(chǎn)物，用去離子水和無水乙醇 充分洗滌，在40-60°C下真空干燥； (3) 在異丙醇中分散步驟(2)所得產(chǎn)物，超聲20分鐘，充分分散;加入二乙胺和異丙醇 鈦，攪拌均勻，反應溫度為180-220°C，反應時間為17-24小時，反應結束后，離心分離產(chǎn)物， 用蒸餾水和無水乙醇充分洗滌所得產(chǎn)物，在40-60°C下真空干燥，得到二氧化鈦修飾的聚多 巴胺包覆的石墨烯； (4) 將步驟(3)所得產(chǎn)物在400°C下煅燒2小時，隨后將煅燒產(chǎn)物分散在十六烷基三甲基 溴化銨(CTAB )去離子水溶液中，超聲數(shù)分鐘后，加入氫氧化鈉去離子水溶液和去離子水，超 聲數(shù)分鐘，于60°C水浴條件下，加入正硅酸乙酯(TEOS)與乙醇混合液，在60°C水浴條件下機 械攪拌反應12小時； (5) 步驟(4)所得產(chǎn)物離心分離后用蒸餾水和無水乙醇充分洗滌，隨后用丙酮回流24小 時兩次； (6) 步驟(5)所得產(chǎn)物離心分離后，用蒸餾水和無水乙醇充分洗滌，在40-60°C下真空干 燥。
[0009] 本發(fā)明中，步驟（1)中石墨稀和濃硝酸的比為（l_3)g: (30-70)ml，更進一步，步驟 (1)中石墨烯和濃硝酸的比為2g: 50ml。
[0010]本發(fā)明中，步驟(2)中三羥甲基氨基甲烷緩沖液的pH值為8.5。
[0011] 本發(fā)明中，步驟(2)中石墨烯和多巴胺鹽酸鹽的質量比為1:4。
[0012] 本發(fā)明中，步驟(3)中聚多巴胺包覆的石墨烯和異丙醇的比為(40-60)mg: (35-55) ml，二乙胺和異丙醇鈦的體積比為(0.02-0.04) :(1.5-2)，更進一步，步驟(3)中聚多巴胺包 覆的石墨稀和異丙醇的比為50mg:40ml，二乙胺和異丙醇鈦的體積比為0.03:1.8。
[0013] 本發(fā)明中，步驟(3)中反應溫度為200°C，反應時間為24小時。
[0014]本發(fā)明中，步驟(4)中二氧化鈦修飾的聚多巴胺包覆的石墨烯與十六烷基三甲基 溴化銨的質量比為1:10,乙醇與正硅酸乙酯的體積比為4:1。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于:所提供的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化鈦微球以及 介孔二氧化硅的納米復合材料合成方法簡單，比表面積較大，具有良好的體積排阻效應，可 祛除大體積蛋白并使小分子肽段進入孔道，孔道底部的二氧化鈦可同磷