一種以硅膠為基質(zhì)的凝集素高效親和色譜材料的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及親和材料的制備技術(shù)，主要為凝集素親和材料的制備方法，涉及到間隔臂的合成，以及凝集素親和材料的制備。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)的糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中最重要的修飾之一，生物體中50%以上的蛋白質(zhì)是糖基化的，糖蛋白參與了細(xì)胞免疫，信號(hào)傳導(dǎo)，蛋白質(zhì)的翻譯調(diào)控、癌癥等生理過程，在生命體中起著重要的作用(Synthetic glycopeptides and glycoproteins astools for b1logy, Chem.Soc.Rev., 2005, 34, 58—68 ；Cancer glycan b1markers andtheir detect1n - past, present and future, Anal.Methods, 2014，6，3918-3936)。正因?yàn)榧膊≈写嬖谥惓５奶腔F(xiàn)象(Elucidat1n of N-Glycosites Within HumanPlasma Glycoproteins for Cancer B1marker Discovery, Mass Spectrometry ofGlycoproteins, 2013，951，307-322)，如巖藻糖增多而唾液酸下降(Fucose and sialicacid express1ns in human seminal fibronectin and a 1-acid glycoproteinassociated with leukocytospermia of infertile men,Disease Markers，2011，31，317-325)，半乳糖的升高均與疾病相關(guān)(Differential Glycomics of EpithelialMembrane Glycoproteins from Urinary Exovesicles Reveals Shifts towardComplex-Type N-Glycosylat1n in Classical Galactosemia, Journal of ProteomeResearc,2012, 11，906-916)，所以分析蛋白質(zhì)的糖基化可以為疾病的臨床診斷提供一種方法。
[0003]親和色譜是糖蛋白的分離分析中常用的一種方法。親和色譜法的突出特點(diǎn)是可對(duì)天然生物活性物質(zhì)進(jìn)行高特效性的分離和純化，具有高濃縮效應(yīng)，可從大量樣品基體中分離純化出所希望獲取的少量生物活性物質(zhì)。這種特效性的產(chǎn)生，是由于在親和固相基體上，鍵合連接了特異性的配位體。此配位體的特效官能團(tuán)可與被分離的生物分子生成具有鑲嵌結(jié)構(gòu)的絡(luò)合物，存在著特效、可逆的分子間相互作用，依據(jù)生物識(shí)別原理，再利用具有恰當(dāng)組成、可使鑲嵌絡(luò)合物解離的流動(dòng)相，經(jīng)過簡單的洗脫步驟，就可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的高純度、高產(chǎn)率的分離。常見的富集糖蛋白的親和色譜材料為特異性抗原抗體材料，凝集素親和材料，硼親和材料等。
[0004]凝集素(Lectin)是指一種從各種植物，無脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，因其能凝集紅細(xì)胞，故名凝集素，亦稱外源凝集素。除紅細(xì)胞外，還能凝集淋巴細(xì)胞、纖維細(xì)胞、精子等。常用的為植物凝集素。通常以其提取的植物命名，如伴刀豆素 A (Conconvalina, ConA)、麥胚素(Wheat germ agglutinin, WGA)、花生凝集素(Peanutagglutinin, PNA)和大豆凝集素(Soybean agglutinin, SBA)等，凝集素(Lectin)是其總稱。凝集素在動(dòng)，植物體內(nèi)廣泛存在。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的植物凝集素有1000多種。凝集素最大的特點(diǎn)是能識(shí)別糖蛋白、糖脂、特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞膜表面的糖基。一種凝集素具有只對(duì)某一種特異性糖基專一性結(jié)合的能力。人們逐漸將發(fā)現(xiàn)的凝集素發(fā)展成強(qiáng)有力的工具來純化、分離、分析糖蛋白，并將其用于分析組織、細(xì)胞和蛋白質(zhì)的糖結(jié)構(gòu)。
[0005]親和色譜材料的制備及使用中存在的問題。(I)親和色譜固定相有基體、間隔臂、配位體三部分構(gòu)成。由于用作基體的載體材料種類繁多；間隔臂具有親水或疏水性質(zhì)、長度可以調(diào)節(jié)；配位體與目標(biāo)分子作用機(jī)理模式多樣，因此親和色譜固定相的制備比其它色譜固定相的制備要復(fù)雜，不僅制備程序冗長，且每步鍵合反應(yīng)后需檢測(cè)鍵合效果，其總體制備成本也較高。(2)常見的親和材料為凝膠基質(zhì)，不耐高壓，限制了其在高效親和色譜中的應(yīng)用，而采用硅膠基質(zhì)的材料容易解決抗壓的問題，但是惰性的材料表面仍然存在非特異性作用，材料表面的電荷作用影響生物大分子和基質(zhì)間的相互作用。
[0006]為提高糖蛋白的分離純化效率，高效親和色譜方法集中液相色譜和親和色譜的優(yōu)勢(shì)，基于在硅膠基質(zhì)上的化學(xué)改性引入親和配基而得到的高效親和色譜材料，并將其應(yīng)用于糖蛋白的分離分析及制備中，為糖蛋白藥物的分離純化提供了一種參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)凝集素親和色譜材料制備路線冗長復(fù)雜，凝集素的活性不能夠很好的保持所存在的問題，本發(fā)明提供一種高效制備凝集素親和材料的方法，主要涉及親和材料間隔臂的合成，凝集素親和材料的合成過程。操作步驟如下:
[0008]硅膠預(yù)處理:硅膠加入體積濃度為I?36%的鹽酸或硝酸溶液中，加熱回流攪拌I?48小時(shí)，過濾，水洗至中性，在100?160°C干燥6?10小時(shí)，后在80°C干燥6?12小時(shí)至恒重；
[0009]間隔臂末端含有官能團(tuán)的硅烷化試劑的制備:惰氣保護(hù)下，室溫，氨基烷氧基(三甲氧基或者三乙氧基)硅烷試劑溶于含有雙官能團(tuán)試劑的極性非質(zhì)子性溶劑中，電磁攪拌4?6小時(shí)，得到一端含有烷氧基硅烷的官能團(tuán)，另一端含有環(huán)氧、羧基、醛基、異氰基、羥基等官能團(tuán)的硅烷試劑；
[0010]硅烷試劑改性硅膠固定相的制備:惰氣保護(hù)，將步驟a處理好的硅膠溶于有機(jī)溶劑中，加入步驟b得到的硅烷化試劑，加熱回流，反應(yīng)16?48小時(shí)；反應(yīng)體系冷卻至室溫，減壓過濾，依次用甲苯，四氫呋喃，甲醇，水，甲醇洗滌，固體產(chǎn)品在60?100°C下干燥12?24小時(shí)，得到末端含有環(huán)氧、羧基、醛基、異氰基、羥基等官能團(tuán)的硅膠固定相；
[0011]凝集素鍵合硅膠親和材料的制備:惰氣保護(hù)，將上述干燥的硅膠加入無水有機(jī)溶劑或者不含有一級(jí)氨基的緩沖鹽溶液中，用活化試劑活化官能團(tuán)，比如用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧基官能團(tuán)，反應(yīng)2?4小時(shí)后，減壓抽濾固定相，用不含有一級(jí)氨基的緩沖鹽溶液洗滌固定相，迅速重溶于不含有一級(jí)氨基的緩沖鹽溶液中；惰氣氣氛保護(hù)下，將凝集素溶解于有特異性結(jié)合的糖的不含有一級(jí)氨基的緩沖鹽溶液，并加入上述經(jīng)過官能團(tuán)活化的硅膠緩沖鹽溶液中，4?25°C攪拌4?24小時(shí)，然后加入含有一級(jí)氨基的試劑，對(duì)未反應(yīng)完全的活化基團(tuán)封尾2?4小時(shí)，離心；取上層清液，應(yīng)用BCA方法測(cè)凝集素的濃度，下層固定相用緩沖鹽溶液洗滌至上層清液中無蛋白質(zhì)的吸收，得到鍵合有凝集素的硅膠親和材料。
[0012]惰氣氣氛為氮?dú)?、氬氣、氦氣中的一種或二種以上；
[0013]無水有機(jī)溶劑為無水N，N- 二甲基酰胺(DMF)，二甲亞砜(DMSO)，
[0014]中的一種或兩種以上。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下特點(diǎn):
[0016]1.凝集素材料性能穩(wěn)定，易于保存。將合成的凝集素填料，放于含有NaN3的緩沖鹽溶液中，在4°C的冰箱中保存，可存放12個(gè)月；
[0017]2.操作簡單，所用溶劑均是中性的緩沖鹽溶液，對(duì)環(huán)境無污染；
[0018]3.親和材料中凝集素的鍵合量高，為90-100mg/g，鍵合率為90-97% ;
[0019]4.鍵合強(qiáng)度高，所制備的凝集素親和材料的耐受酸堿范圍為4-8 ;
[0020]5.在應(yīng)用的過程中凝集素