一種用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇富集凈化的固相萃取柱的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及農(nóng)產(chǎn)品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇富集凈化的固相萃取柱。
【背景技術(shù)】
[0002]脫氧雪腐鐮刀菌稀醇(Deoxynivalenol，DON)，又稱嘔吐毒素，屬于單端孢霉稀族類化合物，是雪腐鐮刀菌稀醇的一種脫氧衍生物，主要由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)在霉變的農(nóng)作物中產(chǎn)生。DON具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性、免疫毒性和胚胎毒性，對血液系統(tǒng)、中樞系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及鈣磷代謝也有嚴(yán)重的影響，并具有一定的致畸作用。此外，研宄表明，DON可能是一種潛在的弱的致癌劑。多種食用農(nóng)產(chǎn)品及其加工品如小麥、大麥、玉米等在其保存、運(yùn)輸過程中非常容易遭受DON的污染，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，2011年我國最新的國家標(biāo)準(zhǔn)GB2761-2011規(guī)定玉米及其制品(玉米澄、玉米片、玉米面)、小麥、大麥、麥片、小麥粉中DON的限量為lOOOyg/kg。由于農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜多樣，容易造成基質(zhì)干擾，所以前處理的富集凈化對于農(nóng)產(chǎn)品中DON的檢測分析至關(guān)重要；另外，DON屬于產(chǎn)毒真菌的次級代謝產(chǎn)物，極難通過人工合成途徑獲得，獲得大量DON標(biāo)準(zhǔn)品最簡單有效得方法就是將產(chǎn)毒菌接種在大米培養(yǎng)基，獲得高含量的DON大米基質(zhì)，然后分離純化。由于基質(zhì)中含有的大量色素、鞣質(zhì)等雜質(zhì)，利用簡單吸附凈化的方法很難去除，如果直接將基質(zhì)提取液進(jìn)中壓制備色譜分離純化，將大大縮短制備柱的使用壽命，所以對DON富集凈化十分必要。本實(shí)用新型固相萃取凈化柱不僅能除去提取液中的色素、油脂、鞣質(zhì)等對色譜柱有嚴(yán)重?fù)p害的雜質(zhì)，還能對樣品中微量的DON毒素實(shí)驗(yàn)富集，提高了檢測分析方法的靈敏度，為農(nóng)產(chǎn)品中DON的風(fēng)險(xiǎn)評估奠定基礎(chǔ)。
[0003]傳統(tǒng)的DON凈化方法通常是使用液液萃取或者層析柱來進(jìn)行凈化，但是，此方法操作復(fù)雜，耗時(shí)耗力，且產(chǎn)生了大量的廢棄物，對環(huán)境產(chǎn)生較大破壞。固相萃取SPE(SolidePhase Extract1n)是一種基于色譜分離的樣品前處理方法，利用吸附劑將液體樣品中的特定化合物吸附，與樣品的基質(zhì)和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫，達(dá)到分離或者富集目標(biāo)化合物的目的，從而大大提高工作效率，提高靈敏度和準(zhǔn)確度，達(dá)到既定量準(zhǔn)確又快速簡便的要求，但是由于商品化的固相萃取柱其價(jià)格昂貴，單支價(jià)格超過15元，不適合大量樣品的檢測及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備工作，極大地限制了其應(yīng)用的普遍性。目前，尚缺乏操作簡單、價(jià)格低廉的能夠用于DON富集、凈化的前處理固相柱。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本實(shí)用新型首先提供了一種用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇富集凈化的固相萃取柱中的裝填材料，該裝填材料由硅膠、中性氧化鋁和弗羅里硅土組成；
[0005]其中硅膠、中性氧化鋁和弗羅里硅土的重量比為0.5-2:0.1-1:0.1_1。
[0006]本實(shí)用新型還提供一種用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇富集凈化的固相萃取柱，其包括萃取容器、上述裝填材料以及篩板；
[0007]其中裝填材料在萃取容器內(nèi)，篩板在裝填材料上部；
[0008]萃取容器內(nèi)下部還有容器內(nèi)篩板。
[0009]所述的萃取容器可為下層帶篩板的聚丙烯固相萃取空管；
[0010]其中裝填材料中的硅膠、中性氧化鋁和弗羅里硅土可分三層疊放，也可以混合；分三層疊放時(shí)，三層沒有特定的順序要求，可以依次從上到下分別為硅膠層、中性氧化鋁層和弗羅里硅土層，也可以依次從下到上分別為硅膠層、中性氧化鋁層和弗羅里硅土層。
[0011]具體的說，本實(shí)用新型的一種用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇富集凈化的固相萃取柱，其包括萃取容器、硅膠層、中性氧化鋁層、弗羅里硅土層和篩板，如圖2。
[0012]本實(shí)用新型利用硅膠、中性氧化鋁、弗羅里硅土研制了一種簡便、高效、經(jīng)濟(jì)的裝填材料，利用該裝填材料制備的用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇富集凈化的固相萃取柱，可以用以除去鞣質(zhì)、色素等干擾物，提高了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)檢測分析方法的靈敏度，可滿足農(nóng)產(chǎn)品中DON的痕量檢測分析。本實(shí)用新型建立的固相萃取柱具有很高的回收率(90.5±1.8%、98.4±2.1 %、106.9±4.4% )和靈敏度(采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析后，靈敏度均低于10yg/kg)的同時(shí)，制作更加簡單、使用方便，單支固相萃取柱的成本不超過5元，且操作簡單，滿足了國內(nèi)外DON檢測及標(biāo)準(zhǔn)品制備前處理的要求。
【附圖說明】
[0013]圖1脫氧雪腐鐮刀菌烯醇富集凈化的固相萃取柱簡略圖
[0014]圖2 —種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇富集凈化的固相萃取柱
[0015]圖3a對照溶液組UPLC-PDA全掃描圖
[0016]圖3b過柱溶液組UPLC-PDA全掃描圖
[0017]其中，1、萃取容器；2、裝填材料；3、篩板；4、容器內(nèi)篩板；5、硅膠層；6、中性氧化鋁層；7、弗羅里硅土層
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1:
[0019]取市場隨機(jī)采集的玉米，粉碎后過篩，取三支20mL離心管，準(zhǔn)確稱取2±0.0lg，加入DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中DON含量分別為100 μ g/kg、200 μ g/kg、1000 μ g/kg，加入1mL的乙腈-水溶液(84:16, V/V)超聲I小時(shí)提取，離心，收集提取液。
[0020]固相萃取柱制備:準(zhǔn)確稱取硅膠lg(200_300目，購自中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司)，中性氧化鋁0.5g，(100-200目，購自中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司)，弗羅里硅土 0.5g，(100-200目，購自中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司)，依次裝入下層帶篩板的5mL聚丙烯固相萃取容器，使每層表面平坦，最后在弗羅里娃土上面加一個(gè)篩板(直徑:12.8mm厚度:2.5mm孔徑:20um)用以保證接觸面的平整。
[0021]所制備成的固相萃取柱，如圖2，包括萃取容器1，萃取容器I內(nèi)從上到下依次為篩板3、硅膠層5、中性氧化鋁層6和弗羅里硅土層7，萃取容器I內(nèi)下部還有一層容器內(nèi)篩板4。
[0022]過柱液制備:用5mL甲醇活化自制凈化柱，5mL加標(biāo)玉米樣本提取溶液過柱，1mL甲醇洗脫，收集洗脫液，45°C氮?dú)獯蹈?，ImL甲醇-水溶液(20:80，V/V)復(fù)溶，過0.22 μπτ濾膜后，檢測分析。
[0023]對照液制備:另取5mL加標(biāo)玉米樣本提取液(DON濃度為1000 μ g/kg)不過柱，洗脫液在45°C氮?dú)庀麓蹈?，ImL甲醇-水溶液(20:80，V/V)復(fù)溶，過0.22 μ m濾膜后，作為對照檢測分析。
[0024]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0025]1.凈化效果表觀比較:
[0026]過柱溶液顏色由深褐色變?yōu)榈S色，且使用后的固相萃取柱上面留有明顯的色素，而對照液仍為深褐色?？梢?，色素、鞣制等對昂貴的色譜柱及色質(zhì)譜儀器損害較大的雜質(zhì)明顯減少，表明該固相萃取柱能夠有效的去除鞣制、色譜等雜質(zhì)。
[0027]2.凈化效果超高效液相色譜-二極管陣列檢測器(UPLC-PDA)全掃描比較
[0028]色譜條件:WatersACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1mmX 100mm，1.7 μ m);流動相A為甲醇，B相為水；流速0.2mL/min ;洗脫程序?yàn)?0?5.5min，10% A?100% A ;5.5?6.5min，100% A ?100% A ;6.5 ?7.0min, 100% A ?10% A ;7 ?lOmin，10% A ?10% A ;紫外檢測器；波長220nm ;進(jìn)樣量5 μ L0
[0029]將未經(jīng)過固相萃取柱凈化，添加水平為1000 μ g/kg (對照液)和經(jīng)固相萃取柱凈化的提取液(過柱液)在200nm-400nm紫外全掃描，結(jié)果如圖3，過柱液(圖3b)中雜質(zhì)峰明顯少于對照液(圖3a)，尤其在對色譜柱及儀器損害較大的l_3min處，雜質(zhì)減少的尤為明顯O
[0030]實(shí)施例2:
[0031]取市場隨機(jī)采集的玉米，粉碎后過篩，取3支20mL離心管，準(zhǔn)確稱取2±0.0lg，其中一支加入DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，使提取液中DON濃度為100 μ g/kg,分別加入1mL乙腈-水溶液(84:16, V/V)超聲I小時(shí)提取，離心，收集提取液。
[0032]固相萃取柱如實(shí)施例1中所述。
[0033]陽性對照溶液制備:用5mL甲醇活化自制凈化柱，5mL加標(biāo)玉米樣本提取液過固相萃取柱，1mL甲醇洗脫，收集洗脫液，45°C氮?dú)獯蹈?，ImL甲醇-水溶液(20:80，V/V)復(fù)溶，過0.22 μ m濾膜后，檢測分析。
[0034]樣品溶液制備:另取5mL玉米樣本提取液過固相萃取柱，洗脫液在45 °C氮?dú)庀麓蹈?，ImL甲醇-水溶液(20:80，V/V)復(fù)溶，過0.22 μ m濾膜后，檢測分析。
[0035]陰性對照溶液制備:取5mL甲醇-水溶液(20:80，V/V)過固相萃取柱，洗脫液在45°C氮?dú)庀麓蹈?，ImL甲醇-水溶液(20:80，V/V)復(fù)溶，過0.22 μ m濾膜后，檢測分析。
[0036]凈化效果表觀比較:
[0037]陽性對照過柱溶液和樣品液的顏色由深褐色變?yōu)榈S色，且使用后的固相萃取柱上面留有明顯的色素，而陰性對照溶液仍為深褐色?？梢?，色素、鞣制等對昂貴的色譜柱及色質(zhì)譜儀器損害較大的雜質(zhì)明顯減少，表明該固相萃取柱能夠有效的去除鞣制、色譜等雜質(zhì)。
[0038]采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)測定三種樣品中DON濃度。
[0039]色譜條件:Agilent C18色譜柱(3.0mmX 100mm, 2.7 μ m);流動相A為5mM醋酸錢溶液，流動相B為甲醇；梯度洗脫程序:0?2min，10%B?90%B ;2?6min，90%B?90%B ;6.0 ?6.1min,90% B ?10% B ;6.I ?8.5min，10% B ?10% B ;流速 0.3mL/min ;進(jìn)樣量5yL ;柱溫40°C。
[0040]質(zhì)譜條件:采用電噴霧電離源(ESI)負(fù)離子模式掃描；掃描范圍:m/z100-400 ；，霧化氣壓力:0.175Mpa ;干燥氣流速:15.0L/min ;干燥器溫度:350°C ;毛細(xì)管電壓:3500V ；碰撞能量:15V ;離子源溫度:400°C。
[0041]通過檢測，得到陽性對照樣本中DON含量為110?130 μ g/kg ;樣品液中DON含量為20?30 μ g/kg ;陰性對照液中DON含量為O。
[0042]實(shí)施例3:
[0043]采用實(shí)施例2中液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)方法分別檢測計(jì)算實(shí)施例1三種添加水平下過固相萃取凈化柱后的回收率及方法靈敏度的測定。
[0044]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0045]通過檢測，得到實(shí)施例1中三組過柱后溶液的回收率分別為90.5± 1.8%、98.4±2.1%和106.9±4.4%，實(shí)施例1中過柱后溶液的靈敏度為10 μ g/kg，極大了提高了方法的靈敏度(未過柱溶液中DON的靈敏度低于100 μ g/kg)，滿足國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。
[0046]本實(shí)用新型的保護(hù)范圍并不限于實(shí)施例中所作的描述，不偏離本實(shí)用新型方案中心的修改都屬于本實(shí)用新型的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇富集凈化的固相萃取柱，其特征在于其包括萃取容器(1)、硅膠層(5)、中性氧化鋁層￠)、弗羅里硅土層(7)和篩板(3);其中硅膠層(5)、中性氧化鋁層￠)、弗羅里硅土層(7)在萃取容器(I)內(nèi)自上而下排列，篩板(3)在硅膠層(5)的上部。
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇富集凈化的固相萃取柱，其包括萃取容器、裝填材料以及篩板。本實(shí)用新型的固相萃取柱可以用以除去鞣質(zhì)、色素等干擾物，提高了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢測分析方法的靈敏度，可滿足農(nóng)產(chǎn)品中DON的痕量檢測分析。
【IPC分類】G01N1-40, B01D15-20, G01N1-34
【公開號】CN204337832
【申請?zhí)枴緾N201420556892
【發(fā)明人】韓錚, 郭文博, 趙志輝, 楊俊花, 陳慧英, 孫真真
【申請人】上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2014年9月25日