專利名稱：利用基因雙導與雜交相結(jié)合的水稻新品種選育方法
(一)技術(shù)領(lǐng)域植物育種及生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
水稻(Oryzae sativa L.)是我國最大的糧食作物，常年播種面積約為3100公頃，總收獲量在2億噸左右，約占我國糧食總產(chǎn)量的40％。水稻生產(chǎn)在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位。但在水稻的生產(chǎn)中，由于稻瘟病、紋枯病、白葉枯病和各種線蟲、病毒病以及螟蟲、飛虱、葉蟬等病蟲草的為害和不良氣候與環(huán)境、雜草的影響，嚴重制約了水稻的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)產(chǎn)。常規(guī)育種手段由于抗性親本缺乏，難以獲得理想的優(yōu)良品種。
以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為代表的分子育種技術(shù)已成為當前水稻品種改良的重要手段。但轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身以及轉(zhuǎn)基因材料在生產(chǎn)上的應用尚存在許多問題(1)基因槍法、農(nóng)桿菌介導法等主要的轉(zhuǎn)化方法以及轉(zhuǎn)基因過程中的組織培養(yǎng)過程，都有很強的基因型依賴性，在1個品種(基因型)上建立的轉(zhuǎn)化體系，對于另一個品種不一定完全適用；(2)轉(zhuǎn)基因過程往往涉及到甲基化、重排、基因沉默、位置效應等復雜的遺傳機理，獲得高水平、穩(wěn)定表達外源目的基因的轉(zhuǎn)基因個體，其選擇效率一般較低，約3％左右，這就要求轉(zhuǎn)基因育種必須規(guī)?；@對于一般的科研單位來說難度較大；(3)目前用以轉(zhuǎn)化的受體親本往往為組培的模式品種或生產(chǎn)上應用的成型品種，等到轉(zhuǎn)導成功，往往滯后于生產(chǎn)應用；(4)轉(zhuǎn)基因過程涉及豐富的組培變異，很多情況下難以保持受體親本原有的優(yōu)良特性，而難以直接應用。因此，對耗費巨大財力、人力獲得的高效、穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)基因材料，通過雜交、回交等工作，作為種質(zhì)利用，就顯得更為迫切和更有價值。
將不同的抗性基因聚合，可以培育獲得具有多種抗性的轉(zhuǎn)基因植物。聚合外源基因的方法多種多樣，共轉(zhuǎn)化是其中一種常用的方法。將含多個外源基因的多個質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入一個材料，篩選共轉(zhuǎn)化的植株。這種方法的成功與否決定于這些質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化頻率與整合位置，目前還沒有統(tǒng)一的定論。雙價或多價外源基因表達載體的構(gòu)建也是一種行之有效的方法。根據(jù)外源基因的作用特點，將功能互補的基因構(gòu)建在一個載體上，共同轉(zhuǎn)入植物。但是，載體包含的基因越多，載體就越大。就目前的轉(zhuǎn)化技術(shù)而言，載體越大，轉(zhuǎn)化越困難。有性雜交是一種行之有效的方法。將不同功能的外源基因先轉(zhuǎn)入不同的個體，再將這些植株采用常規(guī)手段進行雜交，借助分子標記輔助選擇，可獲得多性狀改良的轉(zhuǎn)基因品種。特別是在基因轉(zhuǎn)化中，采用不同的基因轉(zhuǎn)化方法，還可避免或減少同源序列的存在，降低多基因聚合時因同源序列引起的基因沉默。該方法有著廣闊的應用前景。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一套利用生物技術(shù)(轉(zhuǎn)基因技術(shù)、分子標記輔助選擇技術(shù)等)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合(雜交等)，選育水稻新品種的技術(shù)——利用基因雙導與雜交相結(jié)合的水稻新品種選育方法。
本發(fā)明通過以下相關(guān)配套技術(shù)措施實現(xiàn)(1)利用基因槍法和農(nóng)桿菌侵染法進行水稻基因轉(zhuǎn)化，獲得具有目標性狀的水稻種質(zhì)材料。
利用PIG基因槍轉(zhuǎn)化水稻幼胚操作為①取開花后12-15天的水稻種子，先用70％的乙醇消毒3min，再用2％的次氯酸鈉消毒45min，無菌水沖洗干凈后，取水稻幼胚，置于N6B5培養(yǎng)基上，25～26℃，培養(yǎng)2天，用做基因轉(zhuǎn)化的受體；②水稻幼胚在轟擊前置于含0.5mol/L蔗糖的N6B5培養(yǎng)基上高滲處理4小時③PIG基因槍轟擊幼胚進行轉(zhuǎn)化，轟擊時基因槍的操作參數(shù)為樣品室真空度29-30in.Hg，氦氣壓力60PSI，轟擊高度17cm，轟擊持續(xù)時間50ms；和10～16小時；④水稻幼胚在轟擊后繼續(xù)置于含0.5mol/L蔗糖的N6B5培養(yǎng)基上高滲處理10～6小時；⑤高滲處理后的的水稻幼胚，轉(zhuǎn)入N6B5培養(yǎng)基中，25～26℃恢復培養(yǎng)5天；⑥將恢復培養(yǎng)的幼胚轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基(N6B5培養(yǎng)基，附加相應抗生素或除草劑)，篩選抗性愈傷組織；⑦將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入MS5K(MS培養(yǎng)基+KT激動素5mg/L+NAA 0.1mg/L)再生培養(yǎng)基上，25～26℃光照培養(yǎng)(12h光照，12h黑暗)，誘導芽的分化；⑧將分化好的綠芽轉(zhuǎn)入MS生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基不加任何激素)中，25～26℃培養(yǎng)2～3周，待苗高7～10cm時進行移栽；⑨對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行生物學(如抗性鑒定)和分子生物學分析(如PCR檢測、核酸雜交等)，篩選目的基因性狀優(yōu)良的單株。
利用農(nóng)桿菌EHA105侵染法的轉(zhuǎn)化水稻幼胚的操作為①取開花后12～15天的水稻種子，先用70％的乙醇消毒3min，再用2％的次氯酸鈉消毒45min，無菌水沖洗干凈后，取水稻幼胚，置于N6B5培養(yǎng)基上，25～26℃，培養(yǎng)2天，用于基因轉(zhuǎn)化的受體；②含有雙元表達載體(內(nèi)含目的基因)的農(nóng)桿菌，接種于含有抗生素的YEP培養(yǎng)基中，28℃和250rpm條件下?lián)u動培養(yǎng)至生長對數(shù)期(菌液吸光度OD550為1.8-2.0)；③將培養(yǎng)好的菌液在5000rpm條件下離心10min，然后菌體重新懸浮于共培養(yǎng)緩沖介質(zhì)N6B5AS培養(yǎng)液(N6B5培養(yǎng)基不加瓊脂粉，附加乙酰丁香酮200μmol/L)中，稀釋后的菌液濃度約2×108cfu/ml；④將經(jīng)過預培養(yǎng)的水稻幼胚置于菌液中，25-26℃條件下緩慢搖動1.5h；⑤取出幼胚轉(zhuǎn)入N6B5GAS(N6B5培養(yǎng)基+葡萄糖10g/L+乙酰丁香酮200μmol/L)共培養(yǎng)基中，25～26℃共培養(yǎng)3天；⑥是將共培養(yǎng)后的水稻幼胚，用附加500mg/L羧芐青霉素的無菌水洗3次，再用附加500mg/L羧芐青霉素的N6B5培養(yǎng)液洗1次，用無菌濾紙吸干水分；⑦將水稻幼胚，轉(zhuǎn)入N6B5Cb(N6B5培養(yǎng)基+羧芐青霉素500mg/L)培養(yǎng)基中，25～26℃恢復培養(yǎng)5天；⑧將恢復培養(yǎng)的幼胚轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基(N6B5Cb培養(yǎng)基，附加相應抗生素或除草劑)，篩選抗性愈傷組織；⑨將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入MS5K(MS培養(yǎng)基+KT 5mg/L+NAA 0.1mg/L)再生培養(yǎng)基上，25～26℃光照培養(yǎng)(12h光照，12h黑暗)，誘導芽的分化；⑩將分化好的綠芽轉(zhuǎn)入MS生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基不加任何激素)中，25～26℃培養(yǎng)2～3周，待苗高7～10cm時進行移栽；⑩對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行生物學(如抗性鑒定)和分子生物學分析(如PCR檢測、核酸雜交等)，篩選目的基因性狀優(yōu)良的單株。
(2)兩種基因轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化獲得的水稻種質(zhì)材料，與綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的品種雜交，選育具有目的基因特征性狀、綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻新品系。
8月下旬，選取正處于盛花期的稻穗，以農(nóng)藝性狀優(yōu)良的生產(chǎn)品種和轉(zhuǎn)基因水稻為親本，45℃～46℃溫水去雄，進行復交。將獲得的雜交后代材料正季在本地種植，冬季在海南島種植，加速育種進程。整個品系的選育過程主要依據(jù)以下步驟進行①獲得F1代雜交種種植后，根據(jù)植株農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，淘汰劣質(zhì)雜種。②F2群體大田種植2000株以上，根據(jù)兩類性狀的表現(xiàn)進行單株選擇a、具有轉(zhuǎn)基因所賦予的特征性狀；b、株高、穗型、生育期、豐產(chǎn)性等主要農(nóng)藝性狀符合育種目標。③在F3-F5低世代，將選擇的單株按株系種植(每個株系保證20棵以上植株)，首先選擇特征性狀(如抗性)表現(xiàn)好的株系，然后在這些株系中選擇農(nóng)藝性狀好的單株。④F6代種植1000株以上的群體，檢測與目標基因緊密連鎖的選擇標記基因表達情況，作為判斷目標基因是否存在的初步依據(jù)；并根據(jù)選擇標記基因的分離情況，判斷其為純合體或雜合體；同時進行特征性狀(如抗性)鑒定。⑤7代以后，對初步確定的純合株系進行3個方面的工作a、利用PCR擴增或核酸雜交等分子檢測技術(shù)，進一步驗證目標基因是否存在；b、進行特征性狀鑒定(如抗性等)；c、對產(chǎn)量、品質(zhì)等育種目標性狀進行評價。最終獲得具有轉(zhuǎn)基因特征性狀(如抗性)、綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻新品系(種)。
利用PIG基因槍和農(nóng)桿菌介導法已將抗蟲的cry1Ab基因(連同抗除草劑的bar基因)和抗水稻白葉枯病菌的Xa21(連同報道基因gusA基因)分別轉(zhuǎn)入水稻中，獲得了大量的抗蟲、抗病水稻種質(zhì)材料。利用這些抗性種質(zhì)材料，采用雜交等常規(guī)育種技術(shù)，并結(jié)合分子標記輔助育種技術(shù)，已選育獲得了一批抗螟蟲、白葉枯病雙抗水稻新株系、品系。
將現(xiàn)代生物技術(shù)(轉(zhuǎn)基因技術(shù))與常規(guī)育種技術(shù)(雜交等)相結(jié)合，可達到利用有限的轉(zhuǎn)基因育種材料，獲得最大限度地育種效果；其不但提高了育種關(guān)鍵性狀的可預見性，又能不斷創(chuàng)造新的性狀來滿足市場對品種需求的變化，有效地解決了因栽培品種的淘汰更換而給生物技術(shù)育種所帶來的困難。采用兩種不同基因?qū)敕椒ǎ梢员苊饣驕p少同源性序列存在，降低多基因聚合時同源序列引起的基因沉默。分子標記輔助選擇技術(shù)的應用，還可大大縮短育種周期，有利于加快育種進程，提高育種工作效率。


圖1利用基因雙導與雜交相結(jié)合的水稻新品系選育方法流程1中，1是取開花后12-15天的水稻種子，先用70％的乙醇消毒3min，再用2％的次氯酸鈉消毒45min，無菌水沖洗干凈后，取水稻幼胚，置于N6B5培養(yǎng)基上，25～26℃，培養(yǎng)2天，用于基因轉(zhuǎn)化的受體；2是利用基因槍對幼胚進行導入基因(轟擊)前，將預培養(yǎng)的幼胚轉(zhuǎn)入含0.5mol/L蔗糖的N6B5高滲培養(yǎng)基上處理4小時；3是利用PIG基因槍轟擊水稻幼胚，進行基因轉(zhuǎn)化；4是將轟擊后水稻幼胚在含0.5mol/L蔗糖的N6B5高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)處理10～16小時；5是將水稻幼胚，轉(zhuǎn)入N6B5培養(yǎng)基中，25～26℃恢復培養(yǎng)5天；6是將恢復培養(yǎng)的幼胚轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基(N6B5培養(yǎng)基附加相應選擇試劑)，篩選抗性愈傷組織；7是用制備好的農(nóng)桿菌菌液侵染預培養(yǎng)的水稻幼胚；8是將侵染后水稻幼胚轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基，完成基因轉(zhuǎn)化；9是將共培養(yǎng)后的水稻幼胚，用附加500mg/L羧芐青霉素的無菌水洗3次，再用附加500mg/L羧芐青霉素的N6B5培養(yǎng)液洗1次，用無菌濾紙吸干水分；10是將水稻幼胚，轉(zhuǎn)入N6B5Cb培養(yǎng)基(N6B5培養(yǎng)基+羧芐青霉素500mg/L)中，25～26℃恢復培養(yǎng)5天；11是將恢復培養(yǎng)的幼胚轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基(N6B5Cb培養(yǎng)基附加相應選擇試劑)，篩選抗性愈傷組織；12是將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入MS5K(MS培養(yǎng)基加5mg/L的激動素，0.1mg/L NAA)再生培養(yǎng)基上，25-26℃光照培養(yǎng)(12h光照，12h黑暗)，誘導芽的分化；13是將分化好的綠芽轉(zhuǎn)入MS生根培養(yǎng)基中，25-26℃培養(yǎng)2～3周，待苗高7～10cm時進行移栽；14是對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行生物學(如抗性)、分子生物學分析(PCR檢測、Southern雜交等)，獲得目的基因性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因植株；15是選擇含低拷貝外源基因的轉(zhuǎn)基因植株多代自交，獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系；16是利用兩種導入方法獲得的目的性狀優(yōu)良、遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系與生產(chǎn)品種雜交，選育具有多目的基因性狀、綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻新品系(種)。
(五)具體實施方法實施例抗水稻螟蟲、白葉枯水稻新品系的選育利用基因槍法和農(nóng)桿菌侵染法分別轉(zhuǎn)化獲得的抗螟蟲和抗白葉枯病的水稻種質(zhì)材料，在此基礎上，將獲得的抗性種質(zhì)材料與綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的品種雜交，選育獲得了綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良、高抗水稻螟蟲和白葉枯的水稻新品系。整個品系的選育過程如下取開花后12-15天的水稻品種中國91種子，先用70％的乙醇消毒3min，再用2％的次氯酸鈉消毒45min，無菌水沖洗干凈后，取中國91的幼胚，置于N6B5培養(yǎng)基上，25～26℃，培養(yǎng)2天(1)；將預培養(yǎng)的中國91幼胚轉(zhuǎn)入含0.5mol/L蔗糖的N6B5高滲培養(yǎng)基上處理4小時(2)；利用PIG基因槍轟擊中國91幼胚，轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒為pBTW(內(nèi)含抗蟲cry1Ab基因和抗除草劑的bar基因)，轟擊時基因槍的操作參數(shù)為樣品室真空度29-30in.Hg，氦氣壓力60PSI，轟擊高度17cm，轟擊持續(xù)時間50ms；(3)；將轟擊后中國91幼胚在含0.5mol/L蔗糖的N6B5高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)處理10～16小時(4)；將水稻幼胚，轉(zhuǎn)入N6B5培養(yǎng)基中，25～26℃恢復培養(yǎng)5天(5)；將經(jīng)過恢復培養(yǎng)的中國91的幼胚轉(zhuǎn)入含有除草劑的選擇培養(yǎng)基(N6B5培養(yǎng)基+PPT 14mg/L)，篩選抗性愈傷組織，共獲得了6個抗性愈傷組織系(6)；將篩選獲得抗性愈傷組織系轉(zhuǎn)入MS5K(MS培養(yǎng)基加5mg/L的激動素，0.1mg/L NAA)再生培養(yǎng)基上，25-26℃光照培養(yǎng)(12h光照，12h黑暗)，誘導芽的分化(12)；將分化好的綠芽轉(zhuǎn)入MS生根培養(yǎng)基中，25-26℃培養(yǎng)2～3周，待苗高7～10cm時進行移栽，共獲得了100余株轉(zhuǎn)基因植株(13)；對獲得的部分轉(zhuǎn)基因植株進行除草劑抗性鑒定、二化螟抗性鑒定和PCR檢測、Southern雜交分析、Northern雜交分析，結(jié)果表明，cry1Ab基因和bar基因已整合到水稻的染色體基因組中，并在部分轉(zhuǎn)基因植株中進行了有效地表達，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出良好的抗蟲效果(14)；選擇含低拷貝外源基因的轉(zhuǎn)基因植株連續(xù)自交4代，獲得一遺傳穩(wěn)定、抗蟲性強的轉(zhuǎn)基因株系，命名為T91(15)。
取開花后12-15天的水稻品種圣稻301的種子，先用70％的乙醇消毒3min，再用2％的次氯酸鈉消毒45min，無菌水沖洗干凈后，取豫粳6號幼胚，置于N6B5培養(yǎng)基上，25～26℃，培養(yǎng)2天(1)；將含有雙元表達載體pCXK1301(內(nèi)含抗白葉枯病菌的Xa21基因和報道基因gusA)的農(nóng)桿菌EHA105，接種于含有100mg/L卡那霉素的YEP培養(yǎng)基中，28℃和250rpm條件下?lián)u動培養(yǎng)至生長對數(shù)期(菌液吸光度OD550為1.8-2.0)，將培養(yǎng)好的菌液在5000rpm條件下離心10min，然后菌體重新懸浮于共培養(yǎng)緩沖介質(zhì)N6B5AS培養(yǎng)液(N6B5培養(yǎng)基不加瓊脂粉，附加乙酰丁香酮200μmol/L)中，稀釋后的菌液濃度約2×108cfu/ml，將經(jīng)過預培養(yǎng)的豫粳6號幼胚置于菌液中，25-26℃條件下緩慢搖動1.5h(7)；取出幼胚轉(zhuǎn)入N6B5GAS(N6B5培養(yǎng)基+葡萄糖10g/L+乙酰丁香酮200μmol/L)共培養(yǎng)基中，25-26℃共培養(yǎng)3天(8)；將共培養(yǎng)后的豫粳6號幼胚，用附加500mg/L羧芐青霉素的無菌水洗3次，再用附加500mg/L羧芐青霉素的N6B5培養(yǎng)液洗1次，用無菌濾紙吸干水分(9)；將水稻幼胚，轉(zhuǎn)入N6B5Cb(N6B5培養(yǎng)基+羧芐青霉素500mg/L)培養(yǎng)基中，25～26℃恢復培養(yǎng)5天(10)；將恢復培養(yǎng)的幼胚轉(zhuǎn)入含潮霉素選擇培養(yǎng)基(N6B5Cb培養(yǎng)基+潮霉素30mg/L)，篩選抗性愈傷組織，共獲得52個抗性愈傷組織系(11)；將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入MS5K(MS培養(yǎng)基+KT 5mg/L+NAA 0.1mg/L)再生培養(yǎng)基上，25～26℃光照培養(yǎng)(12h光照，12h黑暗)，誘導芽的分化(12)；將分化好的綠芽轉(zhuǎn)入MS生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基不加任何激素)中，25～26℃培養(yǎng)2～3周，待苗高7～10cm時進行移栽，共獲得214株轉(zhuǎn)基因植株(13)；對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行GUS活性的組織化學染色，PCR檢測、Southern雜交分析和Norhtern雜交分析，結(jié)果表明Xa21基因和gusA基因已整合于水稻的染色體基因組中，并在部分植株中進行了有效表達，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出良好的抗白葉枯的特性(14)；選擇含低拷貝外源基因的轉(zhuǎn)基因植株連續(xù)自交3代，獲得多個遺傳穩(wěn)定、抗病性強的轉(zhuǎn)基因株系，命名為SX系列(15)。
以T91與綜合性狀優(yōu)良的生產(chǎn)品種豫粳6號為親本，進行復交，同年冬季在海南島種植F1，并根據(jù)田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，淘汰劣質(zhì)雜種。F2代種植群體1000余株。每個組合隨機選取50株左右的單株，苗期進行除草劑Basta抗性鑒定，并提取部分除草劑抗性植株總DNA，進行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)所有的具有除草劑抗性的植株P(guān)CR均為陽性，表明在雜交過程中，cry1Ab基因與bar基因仍表現(xiàn)為緊密連鎖遺傳。在整個大田生長期不噴施殺蟲劑的情況下，在每個組合的F2群體中，選擇沒有受稻縱卷葉螟、二化螟等鱗翅目害蟲為害的且株高、生育期、豐產(chǎn)性等基本農(nóng)藝性狀符合育種目標的單株，經(jīng)抗除草劑抗性鑒定后，陽性的植株收獲種子。此后對收獲的單株種植成50株左右的群體的系行，用上述同樣的方法，進行標記選擇和表型篩選。從F7代中獲得1個抗蟲性強，農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系，定名為YB(16)。
選擇YB和SX系列中農(nóng)藝性狀優(yōu)異、米質(zhì)好的單株進行復交(有性雜交)。應用與YB選育相同的方法，經(jīng)分子標記輔助選擇(除草劑抗性鑒定、GUS活性組織化學染色檢測、PCR檢測、核酸雜交等)、田間抗病蟲性鑒定、農(nóng)藝性狀篩選，經(jīng)過6～7代加代繁殖，選育出了抗病蟲性強、農(nóng)藝性狀良好、遺傳穩(wěn)定的純合株系230個，多抗水稻新品系6個(SK-1、SK-2、SK-3、SK-4、SK-5、SK-6)。選育出的多抗水稻新品系，高抗水稻螟蟲、白葉枯病和除草劑，畝產(chǎn)在700公斤以上，生育期155天，主要品質(zhì)指標達到國標二級以上(16)。
權(quán)利要求
1.一種利用基因雙導與雜交相結(jié)合的水稻新品種選育方法，其特征在于使用PIG基因槍導入基因時，基因槍的操作參數(shù)為樣品室真空度29-30in.Hg，氦氣壓力60PSI，轟擊高度17cm，轟擊持續(xù)時間50ms，水稻幼胚在轟擊前后分別在含0.5mol/L蔗糖的N6B5培養(yǎng)基上高滲處理4小時和10～16小時；利用農(nóng)桿菌菌株EHA105侵染水稻幼胚導入基因時，菌液濃度2×107～8cfu/ml，共培養(yǎng)緩沖介質(zhì)為N6B5AS培養(yǎng)液(N6B5培養(yǎng)基不加瓊脂粉，另附加乙酰丁香酮200μmol/L)，共培養(yǎng)基為N6B5GAS(N6B5培養(yǎng)基+葡萄糖10g/L+乙酰丁香酮200μmol/L)，共培養(yǎng)溫度25℃～26℃。
2.權(quán)利要求1所述一種利用基因雙導與雜交相結(jié)合的水稻新品種選育方，特征在于基因槍法和農(nóng)桿菌侵染法導入基因時，基因轉(zhuǎn)化的受體為水稻開花后12～15天，再在N6B5培養(yǎng)基上預培養(yǎng)2～3天的水稻幼胚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用基因雙導與雜交相結(jié)合的水稻新品種選育方法，其特征在于使用的N6B5培養(yǎng)基的組成成份為每升培養(yǎng)基中含硝酸鉀(KNO3)2830mg、硫酸胺((NH4)2SO4)463mg、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)185mg、磷酸氫二鉀(KH2PO4)400mg、氯化鈣(CaCl2·2H2O)166mg、硫酸錳(MnSO4·4H2O)10mg、硼酸(H3BO3)3.0mg、硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)2.0mg、碘化鉀(KI)0.75mg、鉬酸鈉(NaMoO4·2H2O)0.25mg、硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.025mg、氯化鈷(CoCl2·6H2O)0.025mg、硫酸鐵(FeSO4·7H2O)27.8mg、乙二胺四乙酸二鈉(C10H14N2O8Na2·2H2O)37.4mg、鹽酸硫胺素(C12H17ClN4OS·HCl)1mg、鹽酸吡哆鋅(C8H11O3N·HCl)1mg、煙酸(C6H5O2N)1mg、脯氨酸(C5H9NO2)500mg、甘氨酸(C2H5NO2)2mg，肌醇(C6H12O6)100mg、2，4-D 2mg、酶解酪蛋白50mg、瓊脂粉10g、蔗糖(C12H22O11)30g、pH5.8。
全文摘要
在利用基因槍法和農(nóng)桿菌侵染法，分別轉(zhuǎn)化獲得具有目標性狀(如抗病、抗蟲)轉(zhuǎn)基因水稻種質(zhì)材料的基礎上，與雜交等常規(guī)水稻育種技術(shù)相結(jié)合，并結(jié)合分子標記輔助選擇，選育具有多目標性狀水稻新品種。該技術(shù)集合了生物技術(shù)和常規(guī)育種兩者的優(yōu)點，可達到利用有限的轉(zhuǎn)基因育種材料，獲得最大限度地育種效果；不但提高了育種關(guān)鍵性狀的可預見性，又能不斷創(chuàng)造新的性狀來滿足市場對品種需求的變化，有效地解決了因栽培品種的淘汰更換而給生物技術(shù)育種所帶來的困難。采用兩種不同基因?qū)敕椒?，還可以避免或減少同源性序列存在，降低多基因聚合時同源序列引起的基因沉默。
文檔編號C12N15/82GK1769467SQ20051004482
公開日2006年5月10日 申請日期2005年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月28日
發(fā)明者溫孚江, 朱常香, 姚方印, 宋云枝, 姜明松 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學