專利名稱：用于擴增核酸的方法及設備的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及用于擴增核酸的方法及設備，更具體地涉及這樣的方法及設備，該方法及設備用于將痕量的核酸擴增到進行具體分析所需的水平。
背景技術(shù)：
為了公開諸如DNA及RNA等核酸的基因信息以用于序列分析及疾病診斷，要求將痕量的核酸擴增到所需的水平。本領域技術(shù)人員公知的常用核酸擴增技術(shù)有諸如連接酶鏈反應(ligase chain reaction)(LCR)、鏈置換擴增(strand-displacement amplification)(SDA)、基于核酸序列的擴增(nucleid acidsequence-based amplification)(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導的擴增(transcription-mediated amplification)(TMA)及環(huán)介導的等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification)(LAMP)等的等溫擴增(isothermalamplification)技術(shù)，以及諸如近期主要采用的聚合酶鏈反應(PCR)等非等溫擴增(non-isothermal amplification)技術(shù)。
在諸擴增技術(shù)中，PCR通過反復地循環(huán)進行以下三個步驟來實施變性，退火以及延長。在變性步驟中通過在90℃以上進行加熱將雙鏈的DNA分離成兩條單鏈。在退火步驟中，在常規(guī)的PCR儀器內(nèi)、在55℃到65℃的退火溫度，兩種引物分別與互補的相反鏈結(jié)合并持續(xù)30秒到數(shù)分鐘。在延長步驟中，DNA聚合酶在雜交后的引物的末端啟動延長以得到DNA雙鏈。延長步驟所需要的時間取決于模板DNA的濃度、擴增片段的大小、以及延長溫度。在使用常見的水生棲熱菌(Thermusaquaticus)(Taq)聚合酶的情況下，引物的延長在72℃進行30秒到數(shù)分鐘。
然而，對于根據(jù)上述PCR技術(shù)進行的核酸擴增而言，當核酸以痕量存在時，PCR的效率可能較低。因此，出現(xiàn)這樣的問題，即難以進行擴增或是經(jīng)常產(chǎn)生非特異性的PCR產(chǎn)物。
為了解決上述問題，Kemp等人提出了一種嵌套式PCR(Nested PCR)技術(shù)，該技術(shù)采用了外部引物對(outer primer pair)及內(nèi)部引物對(inner primerpair)來實施二步PCR(David J.Kemp等人，1989，Proc.Natl.Acad.SCI.Vol.86，pp.2423-2427)。亦即，在嵌套式PCR可通過使用外部引物對進行第一次PCR，并用內(nèi)部引物對進行第二次PCR來阻止非特異性PCR產(chǎn)物的生成。然而，如果在第二次PCR開始之前沒有去除外部引物對，那么必須考慮外部引物對和內(nèi)部引物對之間發(fā)生相互作用這一問題。另外，由于在第一次PCR和第二次PCR期間要開啟反應容器以將第二次PCR所用的PCR反應物導入該反應容器，在此期間就有可能發(fā)生交叉污染，因此在實施嵌套式PCR技術(shù)時必須特別小心地進行操作。
最近，出現(xiàn)了關于快速PCR(fast PCR)技術(shù)的報導，該快速PCR技術(shù)使用一種微型器件從單個分子開始進行，該微型器件的反應容器非常小(E.T.Lagally等人，2001，Anal.Chem.73，pp.565-570)。然而，在該PCR技術(shù)中，核酸可能會異常地吸附在由硅或玻璃制成的微型反應容器的表面上，因此對PCR擴增有不利影響。另外，由于PCR反應物的體積太小因此可能蒸發(fā)掉。
同時，在PCR過程中當PCR溫度低于核酸熔點時，可能會生成諸如引物二聚物等非特異性PCR產(chǎn)物。
為了解決此問題，已經(jīng)有人提出一種熱啟動的PCR(hot start PCR)技術(shù)和這樣一種技術(shù)，其中在第一次循環(huán)達到核酸熔點溫度之前不加入諸如DNA聚合酶等PCR擴增的共同組分。詳細地說，前一種方法為為將反應物溶液上的蠟珠(wax bead)通過加熱融化而形成其上含有共同PCR組分凝固層，使得當?shù)谝粋€循環(huán)達到核酸的熔點后，反應物溶液便和該共同PCR組分相混合；后一種方法為在第一次循環(huán)達到核酸熔點溫度以后才加入共同PCR組分；還有一種方法使用Taq DNA聚合酶抗體，其中當?shù)谝淮窝h(huán)達到核酸熔點時，Taq啟動抗體(start antibody)便從DNA聚合酶中釋出，使得Taq DNA聚合酶被激活。然而，所有以上方法都存在要在PCR過程中加入PCR反應物且可能發(fā)生交叉污染的問題。另外，在使用Taq啟動抗體時，通常需要10分鐘以上的活化時間。
在PCR技術(shù)中，經(jīng)過n個循環(huán)后PCR產(chǎn)物的量理論上會是靶核酸起始量的2n倍。在PCR的起始步驟中，PCR產(chǎn)物的量隨著循環(huán)數(shù)的增加而呈對數(shù)地增加。然而，由于引物的退火效率和DNA雙鏈的合成效率實際上都不是100％，所以當PCR產(chǎn)物的量達到預定水平后，觀察到平臺效應(plateaueffect)，即所述PCR產(chǎn)物的增加率降低且擴增最終將停止。因此，難以根據(jù)PCR產(chǎn)物的量來推定靶核酸的初始量。通常，為了確定靶核酸的初始量，使用了內(nèi)部標準樣品。
Kopp等人提出了在芯片上進行的連續(xù)流動PCR(continuous flow PCR)，其中，PCR溶液通過微通道在具有不同溫度區(qū)的反應容器內(nèi)流動，以便實施連續(xù)的PCR擴增(Martin U.Kopp等人，1998，Science，Vol.280，pp.1046-1048)。由于這種PCR技術(shù)不是建立在對整個反應容器的表面進行加熱的基礎上，因此反應速率取決于流動速率而不是加熱/冷卻速率。然而，為了進行定量分析，數(shù)種標準樣品需要獨立的通道，這使得芯片的尺寸增加。另外，為了進行重復實驗就需要多個的芯片。如果使用單個通道來進行不同樣品的擴增，就可能會出現(xiàn)諸如DNA吸附于通道表面而造成污染等問題。
Baker等人提出根據(jù)流體在玻璃芯片上的運動進行PCR擴增(Jill Baker等人，2003，Micro TAS，pp.1335-1338)。根據(jù)這種PCR技術(shù)，控制該玻璃芯片的溫度，使得玻璃芯片整個表面通過位于通道之間的加熱器來升溫并通過位于該玻璃芯片下的冷卻水來冷卻。Baker等人報告稱，當在充滿稀釋樣品的通道中進行PCR熱循環(huán)期間測量熒光信號時，會檢測到單個分子的熒光峰。然而，為了取得這個結(jié)果就需要諸如將背景信號從較弱的熒光信號中去除等的分析步驟。所以，熒光信號的分析方法是含糊不清的，該方法不可能確定熒光峰是否來自單個分子。
Nakano等人提出過使用油包水乳化液作為反應器的單分子PCR技術(shù)(Single molecule PCR)(Michihiko Nakano等，2003，J.Biotechnology，102，pp.117-124)。詳細地說，首先是將含有PCR混合物的水溶液、油及表面活性劑放入PCR管內(nèi)并用磁性攪拌棒混合以得到油包水乳化液。在小的水溶液液滴內(nèi)實施PCR擴增的初始數(shù)個循環(huán)。當通過離心對水溶液和油進行相分離(phase separate)從而合并小的水溶液液滴時，繼續(xù)進行隨后的PCR擴增循環(huán)。這樣就實現(xiàn)了Nakano等人提出的單分子PCR。通常，當模板DNA的濃度非常低時，濃度相對較高的引物之間的雜交比所述引物和模板DNA之間的雜交更為容易，因此產(chǎn)生非特異性PCR產(chǎn)物。因此，單分子PCR技術(shù)使用油包水乳化液作為反應器使得首次PCR擴增發(fā)生在含有高濃度模板DNA的水溶液液滴中。當含有模板DNA的水溶液液滴內(nèi)的反應物之一即引物在初始的數(shù)個PCR循環(huán)中消耗盡時，通過離心合并含有模板DNA的水溶液液滴與不含模板DNA的另一種水溶液液滴使得通過存在于不含模板DNA的另一種水溶液液滴中的引物進行第二次PCR擴增。然而，該項技術(shù)在實際應用中具有一些困難。例如，制備用于感染性疾病診斷的油包水乳化液時都要用磁性攪拌棒，不方便且增加污染的發(fā)生率。另外，所述水溶液液滴大小不一，從而導致難以重復。此外，在模板DNA的濃度很低時，需要進行數(shù)次重復實驗。還有一個缺點為，PCR溶液的體積很大(約50微升)并且不可能進行定量PCR。
盡管傳統(tǒng)的PCR技術(shù)可以在PCR終點通過電泳來顯示DNA擴增的定性結(jié)果，但這種方法存在很多問題，諸如DNA定量檢測的不準確性等。為此，開發(fā)了實時PCR技術(shù)以利用光學檢測系統(tǒng)通過檢測熒光強度來定量檢測擴增的DNA，其中所述熒光強度和擴增后的DNA濃度成正比。
然而，在使用常用的實時PCR技術(shù)對擴增后的DNA進行定量檢測時，要用陰性對照、陽性對照、以及至少三種不同濃度的標準樣品來重復進行三次以上的實驗，這就要求使用多個的反應物。微型PCR芯片(micro PCRchip)是不可能提供那么多個的反應物的。為了得到如此多個的反應物，就需要一種尺寸較大的芯片。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供用于擴增核酸的方法，其中將含有PCR反應物的水溶液及一種流體通過不同的進口通道注入反應容器內(nèi)，以在該反應容器內(nèi)形成被所述流體包圍的水溶液液滴，并在所述水溶液液滴內(nèi)實施核酸擴增，其中所述水溶液液滴和流體是相分離的。
本發(fā)明還提供用于擴增核酸的設備，該設備用于實施所述核酸擴增方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了用于核酸擴增的方法，該方法包括使含有核酸擴增反應物的反應物水溶液及流體通過不同的進口通道導入反應容器內(nèi)，并通過使所述反應物水溶液和流體在反應容器內(nèi)接觸而生成多個由該流體包圍的反應物水溶液液滴，并在所述反應物水溶液液滴內(nèi)進行核酸擴增，所述流體是經(jīng)過相分離術(shù)與反應物水溶液分離的并且不參與擴增反應。
所述流體可以是硅油、礦物油、全氟化油、烴油或蔬菜油中的至少一種。
核酸的擴增可以通過聚合酶鏈反應(PCR)來實施。核酸的擴增也可通過連接酶鏈反應(LCR)、鏈置換擴增(SDA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導的擴增(TMA)及環(huán)介導的等溫擴增(LAMP)來實施。
核酸的擴增可以通過PCR來實施，其中基底(substrate)的整個表面反復地被加熱并冷卻到預定的溫度。
核酸的擴增可以通過連續(xù)流動PCR來實施，其中的基底被加熱成具有至少兩個溫度不同的區(qū)域，而所述反應物水溶液液滴則交替并反復地通過所述溫度不同的區(qū)域。在這樣的情況中，用多個可獨立控制的加熱器來對基底進行加熱以得到至少兩個溫度不同的區(qū)域。
對于實時PCR，將反應物水溶液及流體導入反應容器內(nèi)的操作還包括將對照水溶液和一種標準樣品水溶液通過各自的進口通道導入反應容器內(nèi)，所述對照水溶液為用于定量化驗分析的陰性對照和陽性對照水溶液中的至少一種，所述各自的進口通道不同于用于導入所述反應物水溶液及所述流體的進口通道；且生成反應物水溶液液滴的操作還包括通過將陰性對照和陽性對照中至少一種的水溶液以及標準樣品水溶液和所述流體在反應容器內(nèi)接觸，從而生成多個對照水溶液液滴及多個標準樣品水溶液液滴。
對于多元PCR(multiplex PCR)，在將反應物水溶液及流體導入反應容器內(nèi)的操作中，至少兩種包括至少兩種引物的反應物水溶液可以通過分別的進口通道被導入反應容器中。
對于熱啟動PCR(hot start PCR)，在將反應物水溶液及流體加入反應容器內(nèi)的操作中，核酸水溶液、含有聚合酶及dNTP的共同組分、以及引物組可以被導入各自的進口通道中，并在被導入到反應容器之前進行混合以形成反應物水溶液。
對于單分子PCR(single molecule PCR)，所述反應容器可以包括兩個第一反應通道(secondary reaction channel)及與這兩個第一反應通道的每一個的終端相連的單個第二反應通道(primary reaction channel)，且將反應物水溶液及流體導入反應容器內(nèi)的操作、生成反應物水溶液液滴的操作以及核酸擴增的操作可以在這兩個第一反應通道內(nèi)的每一個中進行。在該種情況下，在進行核酸擴增后，該方法還包括在第二反應通道的起始端處將反應物水溶液液滴進行合并，以在第二反應通道內(nèi)生成多個經(jīng)過合并的反應物水溶液液滴，并在該合并的反應物水溶液液滴中進行核酸擴增。
反應容器可以包括至少一個反應室(realtion chamber)。在這種情況下，在所述反應物水溶液液滴內(nèi)進行核酸擴增后，該方法還包括在所述反應室內(nèi)進行反應物水溶液液滴的合并以及在合并后的反應物水溶液液滴內(nèi)進行核酸擴增。反應物水溶液液滴的合并可以通過離心來實施。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種用于核酸擴增的設備，該設備包括基底、在該基底內(nèi)側(cè)形成的反應容器、在該基底內(nèi)側(cè)形成的至少一個第一進口通道、在該基底內(nèi)側(cè)形成的第二進口通道以及加熱裝置，所述第一進口通道和該反應容器的一端相連使得可將含有核酸擴增反應物的反應物水溶液導入該反應容器內(nèi)；所述第二進口通道和該反應容器的所述端相連使得可將與反應物水溶液經(jīng)過相分離術(shù)分離并且不參與核酸擴增反應的流體導入該反應容器內(nèi)，所述加熱裝置安裝在該基底上以便與基底熱接觸以對該基底進行加熱，使所述反應物水溶液和所述流體相接觸，并在該反應容器內(nèi)生成多個被該流體包圍的反應物水溶液液滴，并在所述反應物水溶液液滴中進行核酸擴增。
所述基底可以具有疏水性的表面。所述基底可以由聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)、硅、二氧化硅、塑料或玻璃制成?；卓梢园ㄏ禄缀蜕匣浊宜龇磻萜?、第一進口通道及第二進口通道可在該上基底及下基底之間形成。
對于連續(xù)流動PCR(continuous-flow PCR)，所述反應容器可以是蛇形的反應通道，所述第一進口通道和第二進口通道可以和該反應通道的起始端相連，而用來放出所述流體和擴增產(chǎn)物的出口則和該反應通道的終端相連。
所述加熱裝置可以安裝在基底的下表面，并包括至少兩個加熱器，所述加熱器用來對基底進行加熱以使該基底具有至少兩個不同溫度區(qū)。
所述加熱裝置可以包括多個能夠獨立控制的加熱器，這些獨立控制的加熱器安裝在基底的下表面，使得該基底具有至少兩種溫度的區(qū)域。
所述反應通道可以交替而反復地通過所述溫度不同的區(qū)域。
所述第二進口通道可以從反應通道的起始端以直線延伸出來，而且第一進口通道可以和第二進口通道垂直。
對于實時的PCR，該設備還可以包括在基底內(nèi)側(cè)形成的第三進口通道及第四通道，所述第三進口通道和所述反應通道的終端相連，并允許將用于定量分析的陰性對照水溶液和陽性對照水溶液中的至少一種導入該反應通道中；所述第四進口通道和所述反應通道的終端相連，并允許將用于定量分析的標準樣品水溶液導入該反應通道中。
第四進口通道可以和至少兩個標準樣品進口通道及蒸餾水進口通道相連。該標準樣品進口通道用于加入標準樣品，該蒸餾水進口通道用于加入蒸餾水以將標準樣品稀釋到預定濃度。第四進口通道可以是一個蛇形的通道。
對于多元PCR，該設備可以包括至少兩個第一進口通道，該第一進口通道可以對應地和至少兩個引物進口通道相連，該引物進口通道用于將至少兩種不同的引物導入第一進口通道內(nèi)。在這種情況下，每個第一進口通道都可以是蛇形的。
對于熱啟動PCR，其第一進口通道可以和引物進口通道及共同組分進口通道相連，該引物進口通道用于將引物導入第一進口通道中，該共同組分進口通道用于將包括聚合酶及dNTP的共同組分導入第一進口通道中。在這種情況下，反應容器起始端一側(cè)的一部分可以是蛇形的。
對于單分子PCR，其反應容器可以包括兩個蛇形的第一反應通道及單個蛇形的第二反應通道，該第二反應通道和兩個第一反應通道中的每一個的終端都相連，而第一進口通道及第二進口通道可以和這兩個第一反應通道的起始端相連。在這種情況下，其加熱裝置可以包括多個能夠獨立控制的加熱器，這些加熱器安裝在基底的下表面以使這兩個第一反應通道的每一個及單個的第二反應通道都具有兩個溫度不同的區(qū)域。
反應容器可以是一個反應室，該反應室的一端可以和第一進口通道及第二進口通道相連，而該反應室的另一端可以和一個出口通道相連，該出口通道用于放出所述流體及擴增產(chǎn)物。在這種情況下，該設備可以包括多個反應室、多個第一通道、多個第二通道及多個出口通道。該加熱裝置也可以包括單個加熱器，該加熱器安裝在基底的下表面并將基底的整個表面加熱到預定的溫度。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的數(shù)個實施方案進行詳細描述。通過這些描述，本發(fā)明的上述的及其它的特點及優(yōu)點將變得更為明顯。
圖1A為根據(jù)本發(fā)明第一個實施方案的核酸擴增設備的原理性平面圖(schematie plan view)；圖1B為圖1A所示的核酸擴增設備的分解透視圖；圖2為根據(jù)本發(fā)明第二個實施方案的核酸擴增設備的原理性平面圖；圖3為使用根據(jù)本發(fā)明第二個實施方案的核酸擴增設備來實施PCR時，每個水溶液液滴所發(fā)射出的熒光信號的電荷耦合器件(charged coupleddecice)(CCD)圖像；圖4為熒光信號強度-循環(huán)數(shù)的圖；圖5為根據(jù)本發(fā)明第三個實施方案的核酸擴增設備的原理性平面圖；圖6為根據(jù)本發(fā)明第四個實施方案的核酸擴增設備的原理性平面圖；圖7為根據(jù)本發(fā)明第五個實施方案的核酸擴增設備的原理性平面圖；圖8為根據(jù)本發(fā)明第六個實施方案的核酸擴增設備的原理性平面圖；圖9A及圖9B分別為在根據(jù)本發(fā)明第七個實施方案的核酸擴增設備中，PCR的第一個步驟及PCR的第二個步驟的原理性平面圖；圖10A及圖10B為核酸擴增設備的原理性截面圖，這兩個圖用來圖示二維模擬的條件；圖11為當根據(jù)圖10A的模擬條件進行二維模擬時，從95℃到60℃進行冷卻時，溫度相對于時間的變化圖；圖12為根據(jù)表2所列條件作二維模擬實驗時，水溫相對時間的變化圖；圖13為圖12所示的溫度變化值以總溫度變化值進行標準化后相對于時間的變化圖；圖14為當根據(jù)表2所列的條件作二維模擬時，水溫的標準偏差相對于時間的變化圖；圖15顯示了圖14所示水溫的標準偏差相對于總溫度變化值的比值；圖16為進行三維模擬的擴增設備的原理性視圖；圖17為根據(jù)圖16所示條件進行三維模擬實驗時，所述擴增設備的加熱器區(qū)域的溫度圖譜；圖18所示為通道內(nèi)沿該通道縱軸方向的溫度變化曲線；圖19為當根據(jù)圖16所示條件進行三維模擬實驗時，水溫相對于時間的變化曲線；圖20為圖19所示的溫度變化值以總溫度變化值進行標準化后相對于時間的變化圖；圖21顯示圖19所示的水溫標準偏差與總溫度變化值的比值；發(fā)明的詳細描述下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的核酸擴增方法及設備的示例性實施方案作詳細描述，所有附圖中相同的部件以相同的標號表示。
<第一個實施方案連續(xù)流動PCR>
圖1為根據(jù)本發(fā)明第一個實施方案的核酸擴增設備的原理性平面圖，而圖1B為圖1A所示的核酸擴增設備的分解透視圖。
由圖1A及圖1B可見，本發(fā)明第一個實施方案的核酸擴增設備包括基底110，在該基底110內(nèi)形成反應通道130，至少兩個進口通道141及151，以及用來將基底110加熱到預定溫度的加熱裝置120。
基底110可以用PDMS(聚二甲基硅氧烷)、硅、二氧化硅、塑料或玻璃制成?；?10優(yōu)選具有疏水性表面。當基底110以不具有疏水表面性質(zhì)的材料制成時優(yōu)選要將基底110的表面修飾成疏水性的?；?10可以包括下基底111及上基底112，它們互相結(jié)合在一起以在基底110內(nèi)側(cè)形成反應通道130?；?10的上述構(gòu)造也可以用于下面將要描述的所有實施方案中。
反應通道130在基底110內(nèi)側(cè)形成并用作為進行核酸擴增的反應通道。具體地說，反應通道130可以蛇形地延伸以使其能夠如下面所述交替地通過基底110的保持在不同溫度的兩個區(qū)域。
在兩個進口通道141、151中，第一進口通道141接受含有核酸擴增反應物的水溶液(此后簡稱為“反應物水溶液”)，第二進口通道151接受流體，所述流體是經(jīng)過相分離術(shù)與反應物水溶液分離的并且不參與擴增反應。
這兩個進口通道141、151都和反應通道130的起始端相連。具體地說，第二進口通道151可以從反應通道130的起始端以直線延伸，第一進口通道141可以連接在反應通道130和第二進口通道151之間的連接部分從而和第二進口通道151垂直。亦即，反應通道130、第一進口通道141及第二進口通道151三者可以連成“T”字形。
反應通道130、第一進口通道141及第二進口通道151都形成在下基底111及上基底112之間。亦即，通道130、141、151可以如圖1B所示那樣在距離下基底111上表面預定深度處形成?？蛇x的是，通道130、141、151也可以形成在上基底112中。三個通道130、141、151中可以至少有一個通道可形成在下基底111中，而其它的通道可以形成在上基底112中。優(yōu)選的是，通道130、141、151如圖1B所示那樣具有正方形的截面以便于成形。然而，通道130、141、151也可以具有多邊形或圓形的截面形狀。
第一及第二進口通道141、151分別和進口142及152相連，以允許從外界導入反應物水溶液及流體。反應通道130的終端和出口162相連，以釋放出擴增所生成的反應產(chǎn)物及所述流體。進口141及142以及出口162可以垂直地穿透上基底112，如圖1B所示，但也不限于如此方式。
加熱裝置120安裝在基底110的下表面以將基底110加熱到預定溫度。加熱裝置120可以包括兩個控制為不同溫度的加熱器121及122。加熱器121及122和下基底111的下表面熱接觸，并用來將基底110加熱到兩個不同的溫度。所以，基底110具有兩個溫度不同的區(qū)域，例如65℃區(qū)域及95℃區(qū)域。加熱裝置120也可以包括三個以上不同溫度的加熱器。
下面對使用根據(jù)本發(fā)明第一個實施方案所述核酸擴增設備進行核酸擴增的方法進行描述。
首先，如上所述，將含有核酸擴增反應物的水溶液和流體分別從第一進口通道141及第二進口通道151導入反應通道130內(nèi)，所述流體是經(jīng)過相分離術(shù)與反應物水溶液分離的并且不參與擴增反應。所述反應物可以包括靶DNA、引物、dNTP、聚合酶以及緩沖劑。該水溶液通過將這些反應物溶解在蒸餾水中制成。所述流體可以是硅油、礦物油、全氟化油、烴油或蔬菜油。
如上所述，當反應物水溶液和諸如油131的流體分別通過進口通道141、151以恒定的流速進入反應通道130時，反應物水溶液便被油131包圍而形成水溶液液滴132。此時，由于基底110表面具有疏水性質(zhì)，該反應物水溶液被油131所包圍而不會吸附在反應通道130的表面，從而產(chǎn)生水溶液液滴132。
在反應物水溶液通過第一進口通道141的流率受到控制的情況下，可以間歇地在反應通道130內(nèi)補充水溶液液滴132以使其保持恒定的體積。
這里，可以用Lamagilov等人提出的方法(Rustem F.Lamagilov et al.，Angew.Chem.Int.ED.2003，42，No.7，768-771)來生成被油131所包圍的水溶液液滴132。
每一個如上所述那樣生成的水溶液液滴132都是核酸擴增反應器。亦即，在水溶液液滴132中發(fā)生核酸擴增反應。具體地說，當水溶液液滴132在反應通道130內(nèi)流動時便交替地通過由加熱器121、122所加熱的基底110的兩個溫度不同的區(qū)域。在此過程中，水溶液液滴132中的核酸擴增反應物經(jīng)受了反復的加熱和冷卻。所以，在水溶液液滴132內(nèi)便反復地實施了PCR三個步驟的循環(huán)，亦即變性、退火及延長。作為上述的連續(xù)流動PCR的結(jié)果，水溶液液滴132中的擴增產(chǎn)物的濃度逐漸增加。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明，由于反應物水溶液以恒定的流速通過具有恒定截面積的第一進口通道141，在反應通道130內(nèi)生成的水溶液液滴132大小一致。更進一步說，很容易生成數(shù)十到數(shù)百個具有納升(nl)級體積的水溶液液滴132從而以相對較小的設備進行反復的實驗，因此可以在很短的時間內(nèi)(例如，約10分鐘內(nèi))完成約40個PCR循環(huán)。另外，由于水溶液液滴132被油131所包圍，可以防止由于核酸擴增反應物吸附在反應通道130內(nèi)表面上而造成的污染，同時，即使反應物的體積非常小也不會蒸發(fā)掉。
在本發(fā)明的第一個實施方案中，核酸擴增設備包括兩個加熱器121及122來加熱基底110以形成兩個溫度不同的區(qū)域來實施連續(xù)流動PCR。然而，根據(jù)本發(fā)明第一個實施方案的核酸擴增設備也可以包括僅一個加熱器。在這樣的情況下，可以實施這樣的PCR技術(shù)，其中基底110的整個表面被加熱或冷卻到相同的溫度。也可以可選地實施諸如LCR、SDA、NASBA、TMA、和LAMP等常見的等溫擴增技術(shù)而不是PCR技術(shù)。因此，本發(fā)明的用途不限于PCR技術(shù)而是能夠用于各種不同的核酸擴增技術(shù)。
<第二個實施方案實時PCR>
圖2為根據(jù)本發(fā)明第二個實施方案的核酸擴增設備的原理性平面圖。圖3和4分別為利用根據(jù)本發(fā)明第二個實施方案的核酸擴增設備來實施PCR時每個水溶液液滴所發(fā)射出的熒光信號的電荷耦合器件(CCD)圖像，以及熒光信號強度隨著循環(huán)次數(shù)的變化情況。
在圖2中，本發(fā)明第二個實施方案的核酸擴增設備包括基底110，在該基底110內(nèi)側(cè)形成的反應通道130，多個個進口通道241、243、245a、245b、247、249及151，及用來將該基底110加熱到預定溫度的加熱裝置120。
基底110、反應通道130及加熱裝置120的構(gòu)造和第一個實施方案的情況相同，因此這里不再詳細描述。
根據(jù)本發(fā)明第二個實施方案的核酸擴增設備的構(gòu)造適于實施實時PCR。其中進口通道241、243、245a、245b、247、249及151都形成在基底110內(nèi)側(cè)。具體地說，有兩個進口通道241、151分別和反應通道130的起始端相連，該第一進口通道241用于導入含有核酸擴增反應物的水溶液，其中第二進口通道151用于導入諸如油的流體。另外第三進口通道243及第四進口通道249也和反應通道130的所述起始端相連，該第三進口通道243用于導入陰性對照(NTC)水溶液，該第四進口通道249用于導入標準樣品水溶液。第二進口通道151可以從反應通道130的起始端呈直線地延伸出來。第一、第三、第四進口通道241、243及249可以相互以一定的間隔分開并垂直地連接于反應通道130。第一進口通道241和第三進口通道243可以分別和進口242及244相連，其中進口242及244和外界相通。
也可以通過第三進口通道243來加入陽性對照而不是陰性對照。也可以形成另外的進口通道來導入陽性對照。
第四進口通道249可以和兩個標準樣品進口通道245a、245b及蒸餾水進口通道247相連，兩個進口通道245a、245b用于導入兩種標準樣品，蒸餾水進口通道247用于導入蒸餾水以將標準樣品稀釋到預定濃度。兩個標準樣品進口通道245a、245b和蒸餾水進口通道247分別和進口146a、246b及248相連，這些進口和外界相通。根據(jù)這樣的構(gòu)造，標準樣品在第四進口通道249中被蒸餾水稀釋成預定濃度的標準樣品水溶液。通過調(diào)節(jié)標準樣品及蒸餾水的流率，很容易形成不同濃度的標準樣品水溶液。此時，優(yōu)選使第四進口通道249形成具有蛇形，以使得標準樣品能夠和蒸餾水充分混合。
在上述本發(fā)明第二個實施方案的核酸擴增設備中，當分別從第一、第三、第四進口通道241、243及249導入反應物水溶液、NTC水溶液、以及標準樣品水溶液并從第二進口通道151導入油131時，在反應通道130中生成如第一實施方案所述的被油131包圍的反應物水溶液液滴232、NTC水溶液液滴233及標準樣品水溶液液滴234。此時，當以預定的時間間隔交替地導入所述各種水溶液時，在反應通道130中交替地生成反應物水溶液液滴232、NTC水溶液液滴233及標準樣品水溶液液滴234，如圖2所示。這樣，當如此生成的各種水溶液液滴232、233、234在反應通道130內(nèi)流動過程中交替地通過兩個加熱器121、122加熱形成的基底110的兩個溫度不同的區(qū)域時，便在水溶液液滴232、233、234中實施了連續(xù)流動PCR。
當每種水溶液中都含有熒光染料時，可通過用一種光學檢測系統(tǒng)對各個水溶液液滴232、233、234所發(fā)射出的熒光信號進行檢測，來對其中的核酸進行定量分析。當反應物水溶液液滴232中最初產(chǎn)生的液滴到達反應通道130的終端時，便可以通過CCD攝像機得到熒光信號的CCD圖像，如圖3所示。由圖3可見，在反應通道的預定距離內(nèi)流動的各個水溶液液滴都發(fā)射出熒光信號。所以有可能用一種比常規(guī)的PCR技術(shù)更簡單并更準確的方法來對熒光信號進行定量分析，其中在所述常規(guī)PCR技術(shù)中熒光信號來自反應通道的整個表面。基于如此獲得CCD圖像可以獲得如圖4所示的實時PCR曲線。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的第二個實施方案，通過在單個PCR設備進行one-pot圖像(one-pot image analysis)分析可以獲得實時PCR曲線，這使得可以對核酸進行定量分析。更進一步說，由于反應物水溶液、NTC水溶液及標準樣品水溶液被導入單個反應通道130后在同一時間進行實驗，因此可用體積較小的PCR設備并且進行實時PCR實驗所需的時間也可以明顯減少。另外，由于標準樣品及蒸餾水的流率都可以調(diào)節(jié)，因此易于形成不同濃度的標準樣品水溶液，從而有可能進行更精確的定量分析。
<第三個實施方案多元PCR>
圖5為本發(fā)明第三個實施方案的核酸擴增設備的原理性平面圖。
在圖5中，本發(fā)明第三個實施方案的核酸擴增設備中基底110、反應通道130、以及加熱裝置120的構(gòu)建和第一個實施方案的相同，因此不再詳細描述。
本發(fā)明第三個實施方案的核酸擴增設備的構(gòu)造適于實施多元PCR，以便在單個設備中同時對多個基因進行分析。為此，基底110具有多個(例如三個)第一進口通道341、多個引物進口通道343及單個第二進口通道151，其中所述多個第一進口通道341用于導入不同的反應物水溶液，多個引物進口通道343用于將三種不同的引物A、B、C導入第一進口通道341中，該第二進口通道151用于導入油。第二進口通道151可以從反應通道130的起始端以直線延伸。多個第一進口通道341可以相互以預定的間隔垂直地連接在反應通道130上。多個引物進口通道343則分別連接于對應的第一進口通道341。第一進口通道341和引物進口通道343可以分別和進口342及344相連，該進口342及344和外界相通。
在上述本發(fā)明第三個實施方案的核酸擴增設備中，當三個不同的引物A、B及C分別通過三個引物通道343進入第一進口通道341時，位于該第一進口通道341中的反應物水溶液便含有不同的引物。該第一進口通道341優(yōu)選形成具有蛇形，以使反應物水溶液和引物充分混合。
下一步為，當反應物水溶液通過第一進口通道341進入反應通道130時，油131通過第二進口通道151進入反應通道130，于是反應通道130中產(chǎn)生了被油131包圍并含有不同引物A、B及C的水溶液液滴332a、332b及332c。此時，當含有不同引物A、B及C的反應物水溶液通過第一進口通道341按一定的時間間隔交替地被導入時，在反應通道130中可交替地產(chǎn)生水溶液液滴332a、332b及332c，如圖5所示。
如上所述根據(jù)本發(fā)明的第三個實施方案，可實施這樣的多元PCR，其中可以同時在單個微型設備中進行多個基因的分析。另外，由于含有不同引物的水溶液液滴332a、332b及332c被油131所包圍，因此可以防止反應物水溶液的交叉污染。
<第四個實施方案熱啟動PCR>
圖6為本發(fā)明第四個實施方案的核酸擴增設備的原理性平面圖。
圖6中本發(fā)明第四個實施方案的核酸擴增設備中的基底110、反應通道130、以及加熱裝置120的構(gòu)造和第一個實施方案的相同，因此不再詳述。
本發(fā)明第四個實施方案的核酸擴增設備的構(gòu)造適于實施熱啟動PCR。為此形成的基底110具有第一進口通道441、引物進口通道443、共同組分進口通道以及第二進口通道151。該第一進口通道441用于導入反應物水溶液，引物進口通道443用于將引物導入第一進口通道441中，共同組分進口通道用于將諸如聚合酶、dNTP及緩沖劑等共同反應組分導入第一進口通道441中，第二進口通道151用于導入油。第二進口通道151可以從反應通道130的起始端以直線延伸出來。第一進口通道441可以垂直地連接于反應通道130。引物進口通道443及共同組分進口通道445則連接于第一進口通道441的中央部分。第一進口通道441、引物進口通道443和共同組分進口通道445可以分別和進口442、444及446相連，其中進口442、444及446和外界相通。
在上述本發(fā)明第四個實施方案的核酸擴增設備中，當將引物及共同反應組分分別進入引物進口通道443及共同組分進口通道445并將靶DNA水溶液導入第一進口通道441時，所述靶DNA水溶液、引物及共同反應組分在第一進口通道441的中央部分混合并形成用于核酸擴增反應的反應物水溶液。這樣形成的反應物水溶液通過第一進口通道441進入到反應通道130中。于是，在反應通道130中便產(chǎn)生多個被油131所包圍的反應物水溶液液滴432。當反應物水溶液液滴432在反應通道130中流動并交替地通過由兩個加熱器121、122加熱形成的基底110的兩個溫度不同的區(qū)域時，連續(xù)流動PCR便在反應物水溶液液滴432中得到實施。
這種情況下，優(yōu)選使反應通道130的部分起始段形成蛇形，使得在水溶液液滴432達到第一次循環(huán)的熔點之前，水溶液液滴432中的反應物在預定溫度充分地進行加熱。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的第四個實施方案，由于靶DNA水溶液、引物及共同組分在第一次PCR循環(huán)即將開始前進行混合以形成用于核酸擴增的反應物水溶液，因此可實現(xiàn)熱啟動PCR。因此，可以防止在PCR開始之前在低溫條件下形成諸如引物二聚物等的非特異產(chǎn)物。
<第五個實施方案溫度可程式化的連續(xù)流動PCR>
圖7為本發(fā)明第五個實施方案的核酸擴增設備的原理性平面圖。
在圖7中，本發(fā)明第五個實施方案的核酸擴增設備中的基底110，反應通道130，以及進口通道441、443、445及151的構(gòu)造和本發(fā)明第四個實施方案的相同，因此不再詳細描述。
本發(fā)明第五個實施方案的核酸擴增設備包括加熱裝置520，該加熱裝置520包括多個可獨立控制的加熱器5211到521n。具體地說，加熱器5211到521n平行地置于基底110的下表面并和其下表面熱接觸。加熱器5211到521n的用于將基底的相應部分加熱到預定溫度。
根據(jù)上述構(gòu)造，加熱器5211到521n的每一個的加熱溫度條件可以根據(jù)需要而加以改變，這使得基底110具有差異性控溫(differential programmedtemperature)的區(qū)域。例如，當加熱器5211到521n分成分別調(diào)節(jié)到三種不同溫度的三個組時，基底110可以具有三個不同的溫度區(qū)域T1、T2及T3。因此，該實施例具有這樣的優(yōu)點，即可以在單個設備中在不同的溫度條件下進行核酸擴增實驗。
上述加熱裝置520也可用于第一到第四個實施方案的核酸擴增設備。
<第六個實施方案單分子PCR>
圖8為本發(fā)明第六個實施方案的核酸擴增設備的原理性平面圖。
圖8中，本發(fā)明第六個實施方案的核酸擴增設備的構(gòu)造適于實施單分子PCR。為此，形成的基底110有兩個用于進行首次PCR的第一反應通道631及632、用于進行第二次PCR的單個第二反應通道633、第一進口通道641、以及兩個第二進口通道651和653。其中第一進口通道641用于將反應物水溶液導入兩個第一反應通道631、632，第二進口通道651、653用于將油分別導入第一反應通道631、632中。
兩個第二進口通道651、653分別和兩個第一反應通道631、632的起始端相連。第一進口通道641通常和兩個第一反應通道631、632的起始端相連。第一進口通道641和兩個第二進口通道651、652可以分別和進口642、652及654相連，所述進口和外界相通。
通常也可將單個第二進口通道和兩個第一反應通道631、632相連。兩個第一進口通道可相應地和兩個第一反應通道631、632相連。
兩個第一反應通道631、632的終端和第二反應通道633的起始端相連。第二反應通道633的終端和出口634相連，該出口634和外界相通。
在待加熱的基底110的下表面安有加熱裝置。該加熱裝置如圖8所示和基底110的下表面熱接觸，并可以包括多個可獨立控制的加熱器。這些加熱器和基底110下表面的相應部分熱接觸，這使得基底110具有多個溫度不同的區(qū)域。例如，如圖8所示，該加熱裝置可以由五個加熱器621到625組成，使得第一反應通道631、632及第二反應通道633都具有兩個不同的溫度區(qū)域。
在上述本發(fā)明第六個實施方案的核酸擴增設備中，在兩個第一反應通道631、632內(nèi)形成由油661所包圍的水溶液液滴662a、662b。當反應物水溶液包含的核酸濃度非常低時，在第一反應通道631、632中可能生成含痕量或不含核酸的第一水溶液液滴662a，以及包含相對較高濃度的核酸的第二水溶液液滴662b。當?shù)谝患暗诙芤阂旱?62a和662b在第一反應通道631、632中流動時，首次PCR便在該第一及第二水溶液液滴662a、662b中進行。在此過程中，在含有相對較高濃度的核酸的第二水溶液液滴662b中的大多數(shù)引物會被消耗掉，而第一水溶液液滴662a中的大多數(shù)引物仍將保持未反應狀態(tài)。
在首次PCR完成后，將第一及第二水溶液液滴662a及662b在第二反應通道633內(nèi)進行合并。此時，第一水溶液液滴662a及第二水溶液液滴662b可在同一種水溶液液滴之間進行合并，或在不同的水溶液液滴之間進行合并而形成第三水溶液液滴662c。在后一種情況下，由于第二水溶液液滴662b中的核酸和第一水溶液液滴662a中的引物相遇，所述核酸和引物在第三水溶液液滴622c中共存。所以，當?shù)谌芤阂旱卧诘诙磻ǖ?33中流動時便會發(fā)生第二次PCR。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的這個實施方案，在單個設備中實施了兩個階段的PCR，所以，PCR的靈敏度能夠顯著增加。更進一步說，由于能夠在單個設備中連續(xù)地產(chǎn)生數(shù)十個到數(shù)百個水溶液液滴622a、622b，因此甚至可僅通過one-pot實驗充分擴增痕量的核酸。另外，由于作為反應器的水溶液液滴622a、622b及622c的體積非常小，對痕量核酸進行擴增的靈敏度明顯增加。
如下文將描述的，上述利用二步PCR的單分子PCR除可用于在通道形的核酸擴增設備以外，也可以應用于室形(chamber shape)核酸擴增設備。
<第實施方案7單分子PCR>
圖9a及圖9b為在本發(fā)明第七個實施方案的核酸擴增設備中，PCR的PCR的第一步及PCR的第二步的原理性平面圖。
圖9a中，本發(fā)明第七個實施方案的核酸擴增設備包括基底110、反應室730、進口通道741及751、出口通道761及加熱裝置。該反應室730在基底110內(nèi)側(cè)形成，該加熱裝置用于將基底110加熱到預定溫度。
基底110的構(gòu)造和第一個實施方案中的相同。
反應室730形成在基底110內(nèi)側(cè)并用作進行核酸擴增的反應容器。反應室730可以是多邊形或圓形的，并且可以在單個基底110上形成數(shù)個這樣的反應室730。
反應室730的一端和第一進口通道741及第二進口通道751相連，該第一進口通道741用于導入反應物水溶液，該第二進口通道751用于導入例如油731的流體。反應室730的另一端和出口通道761相連以從反應室730放出擴增產(chǎn)物及油731。第一及第二進口通道741、751分別和進口742、752相連，這兩個進口742、752和外界相通。出口通道761和出口762相連，其中出口762和外界相通。
加熱裝置置于基底110的下表面，并且包括加熱器721，該加熱器721的用于為將基底110加熱到預定的溫度。
下面根據(jù)本發(fā)明第七個實施方案對利用上述核酸擴增設備的核酸擴增方法進行描述。
首先，如上所述，反應物水溶液和流體如油731分別通過第一進口通道741及第二進口通道751進入反應室730，并在反應室730內(nèi)生成多個由油731所包圍的水溶液液滴732a和732b。此時，調(diào)節(jié)反應物水溶液通過第一進口通道741的流率，使得在反應室730內(nèi)生成的水溶液液滴732a和732b大小一致。在此過程中，當反應物水溶液中的核酸濃度非常低時，可在反應室730中生成含痕量或不含核酸的第一水溶液液滴732a和包含相對較高濃度的核酸的第二水溶液液滴732b。
下一步為，當基底110被加熱器721周期性地加熱和冷卻時，PCR的第一步在水溶液液滴732a、732b內(nèi)進行。在此過程中，核酸濃度相對較高的第二水溶液液滴732b中的大多數(shù)引物會被消耗掉，而第一水溶液液滴732a中的大多數(shù)引物仍將保持未反應狀態(tài)。
在圖9B中，在PCR的第一步完成后，第一水溶液液滴732a及第二水溶液液滴732b由于離心作用而合并，從而生成較大體積的第三水溶液液滴732c。結(jié)果是第二水溶液液滴732b中的核酸和第一水溶液液滴732a中的引物相遇。所以，核酸和引物共存在第三水溶液液滴732c中。
這種狀態(tài)時，當基底110被加熱器321周期性地加熱及冷卻時，PCR的第二步在第三水溶液液滴732c中進行。
本發(fā)明第七個實施方案的核酸擴增設備已經(jīng)根據(jù)PCR技術(shù)進行了說明。然而，符合本發(fā)明第七個實施方案的核酸擴增設備也可以應用到諸如LCR、SDA、NASBA、TMA及LAMP等常用等溫擴增技術(shù)中。
<實施例>
根據(jù)本發(fā)明第一到第六個實施方案，對于連續(xù)流動PCR，由于在反應通道內(nèi)流動的反應物水溶液及油的熱傳導性能不同，因此需要預設定所述反應物水溶液及油的流速。另外，還需預設定諸如基底的厚度、加熱器與反應通道的間距等的設計參數(shù)。
下面將提供設計核酸擴增設備所需的參數(shù)，所述參數(shù)是基于基底和在反應通道內(nèi)流動的反應物水溶液及油的熱特性、通過模擬實驗確定的。
數(shù)種材料的熱特性列于下表1中。
表1

注LCP為液晶聚合物，PDMS為聚(二甲基硅氧烷)。
如表1所示，PDMS和全氟萘烷(C10F18)的熱特性最差。
為此，下面所述的模擬實驗是在利用由PDMS制成的基底并用全氟萘烷作為油時的最差條件下進行的。
<實施例1二維模擬>
圖10A及10B為核酸擴增設備的原理性截面圖，這兩個圖用來圖示二維模擬的條件。
首先，圖10A中的基底由PDMS制成。加熱器位于基底的下表面。形成的基底具有寬度Wc及高度Hc都為100微米的反應通道。反應通道到加熱器之間的基底的厚度Gp設為10微米。反應通道內(nèi)的水的高度Hw設為90微米。
在上述條件下進行了第一次二維模擬實驗。
然后，改變反應通道截面的寬高比(Wc/Hc)及Hw/Hc比，進行第二次二維模擬實驗。
下一步，除了反應通道到加熱器之間的基底的厚度Gp設為100微米以外，按照與圖10所示相同的方式參照圖10B進行第三次二維模擬實驗。
由于水的表面張力，反應通道內(nèi)水的橫截面形狀基本近似為圓形。然而，為了更容易地進行模擬，認為圖10A及10B的反應通道內(nèi)的水的橫截面形狀為正方形。
所示二維模擬條件總結(jié)在表2中。
表2

圖11到圖15顯擬的實驗結(jié)果。
圖11所示為根據(jù)圖10A所示的模擬條件，二維模擬中從95℃冷卻到60℃時的溫度-時間變化圖。
如圖11所示，核酸擴增設備的所有區(qū)域，亦即整個基底，以及反應通道所含的油及水都在0.5秒鐘內(nèi)達到目標溫度。
圖12所示為根據(jù)表2所列條件進行二維模擬實驗的水溫-時間變化曲線。圖12中的每一條溫度曲線都代表反應通道的含水部分的截面中6個點的平均溫度隨時間的變化。
如圖12所示，當反應通道和加熱器之間的基底厚度為10微米時，不管反應通道截面的寬高比是多少，經(jīng)冷卻和加熱水溫都在0.5秒鐘內(nèi)達到目標值。
圖12還顯示，加熱過程和冷卻過程中的溫度變化值是不同的。圖13顯示了溫度變化值由總溫度變化值進行標準化后相對于時間的變化圖。
由圖13可見，加熱過程的溫度-時間變化和冷卻過程的相似。
以上的模擬實驗的結(jié)果說明，本發(fā)明的核酸擴增方法及設備對溫度變化的反應速度很快，從而保證快速進行PCR。
在本發(fā)明中，當被油包圍的水滴的溫度發(fā)生變化時，溫度的均勻性是一個重要的因素。上述模擬實驗證明，本發(fā)明的核酸擴增設備和方法提供了溫度均勻性。
圖14所示為當以表2所列的條件進行二維模擬時，水溫的標準偏差相對于時間的變化圖。圖14中的每一條標準偏差曲線都代表所述反應通道的含水截面的6個點的溫度的平均標準偏差隨時間的變化。
如圖14所示，當反應通道和加熱器之間的基底厚度(Gp)為10微米時，不管反應通道的高寬比是多少，標準偏差達到1℃以下所需時間為0.3秒或更少。當反應通道和加熱器之間的基底厚度(Gp)為100微米時，標準偏差在0.4秒內(nèi)達到1℃以下。
圖15顯示圖14的標準偏差和總溫度變化值的比值。
如圖15所示，溫度的均勻性達到總溫度變化值的2％以下所需的時間不超過0.5秒鐘。這意味著當溫度發(fā)生50℃的變化時，在0.5秒內(nèi)溫度差異足以達到1℃以下。
<實施例2三維模擬>
基于上述二維模擬實驗進行本實驗性實例，以評估與實際結(jié)構(gòu)近似的三維結(jié)構(gòu)的熱性能。
圖16為用于進行三維模擬的擴增設備的原理性視圖。
圖16中，在以PDMS制成的基底的下表面有兩個加熱器。該基底具有反應通道，該反應通道內(nèi)有被油包圍的水滴。
在這樣的構(gòu)造中，三維模擬的條件和圖10A所示的相同。亦即，反應通道寬度Wc及高度Hc都設為100微米，反應通道和加熱器之間的基底的厚度Gp設為10微米。所述水滴的高度、寬度和長度都設為90微米。第一加熱器的長度為3,000微米，第二加熱器的長度為1,000微米。
三維模擬實驗的初始條件如下圖16右側(cè)所示的第一加熱器的溫度為60℃，位于第一加熱區(qū)域內(nèi)的油和水滴的初始溫度為95℃。圖16左側(cè)的第二加熱器的溫度為95℃，位于第二加熱區(qū)域內(nèi)的油和水滴的初始溫度為60℃。亦即，在上述第一加熱區(qū)域中所述油和水從95℃冷卻到60℃，而在上上述第二加熱區(qū)域中所述油和水從60℃加熱到95℃。
圖17到圖21所示為該三維模擬實驗的結(jié)果。
圖17為按圖16所示的條件進行三維模擬實驗時，核酸擴增設備的每個區(qū)域的溫度-時間變化圖譜。
如圖17所示，該核酸擴增設備所有區(qū)域在0.5秒內(nèi)達到目標溫度。
圖19為按圖16所示的條件進行三維模擬實驗時，水溫對時間的變化曲線。圖19中每條溫度曲線代表反應通道中的18個含水位點的平均溫度對時間的變化。圖20為圖19的溫度變化值由總溫度變化值進行標準化后相對于時間的變化圖。
圖19和圖20中顯示了二維模擬和三維模擬的結(jié)果并進行比較。圖19及20中，代表三維模擬的加熱曲線，且代表三維模擬的冷卻曲線。
由圖19及20可見，三維模擬的結(jié)果和二維模擬的結(jié)果相似。
為了快速進行PCR，油和水滴必須迅速達到位于反應通道下表面的加熱器的溫度。為此，當兩個溫度不同的區(qū)域相鄰時，對反應通道內(nèi)的空間溫度分布情況作了評估。
圖18所示為反應通道內(nèi)的溫度沿該反應通道縱軸方向的分布情況。圖18中，左側(cè)的“1毫米”長度為95℃的區(qū)域，右側(cè)的“3毫米”長度為60℃的區(qū)域。
如圖18所示，一個溫度區(qū)域受到距離0.5毫米以內(nèi)的另一個溫度區(qū)域的影響。這就意味著如果兩個不同溫度區(qū)域之間的距離為約1毫米，則完全可以不考慮二者之間的相互影響。
和前述二維模擬一樣，為了評估三維模擬中被油包圍的水滴的溫度均勻性，計算所述水滴中18個點的溫度標準偏差。
圖21圖示了三維模擬中水溫的標準偏差與總溫度變化值之比。圖21中同時顯示二維模擬和三維模擬的結(jié)果以進行比較。圖21中表示三維模擬曲線。
如圖21所示，使溫度差異達到總溫度變化值的2％以下所需的時間為0.5秒鐘以下。這意味著當溫度發(fā)生50℃的變化時，溫度差異在0.5秒以內(nèi)足以達到1℃以下。
在以上模擬實驗結(jié)果的基礎上，通過表3總結(jié)了溫度及溫度均勻性方面的反應特點。
表3

如表3所示，在溫度及溫度均勻性方面的反應特性都是重要的熱特性因素，它們都在1秒鐘以內(nèi)達到所需水平。具體地說，當以PDMS制成的基底在加熱器及反應通道之間的厚度為10微米時，則在0.5秒鐘內(nèi)實現(xiàn)目標溫度的均勻分布。
從上述說明可明顯看出，根據(jù)本發(fā)明，反應物水溶液以恒定的流動速度通過具有恒定截面積的進口通道。由此可在反應通道或反應室內(nèi)容易地生成數(shù)十到數(shù)百個水溶液液滴，所述液滴體積較小且均勻一致，從而保證在體積相對較小的設備內(nèi)快速、反復地進行PCR實驗。另外，由于所述水溶液液滴被油所包圍，因此可以防止出現(xiàn)由于擴增反應物吸附在反應通道內(nèi)側(cè)而造成的污染問題，而且即使反應物的體積非常小也不會有蒸發(fā)掉的危險。
根據(jù)本發(fā)明，反應物水溶液、NTC水溶液、以及標準樣品水溶液被一起導入單個反應通道內(nèi)然后同時進行實驗。所以，本發(fā)明的PCR設備的優(yōu)點包括和常規(guī)的PCR設備相比其體積可以小型化，而且進行實時PCR所需的時間也可以明顯減少。此外，由于在反應通道預定范圍內(nèi)流動的每一個水溶液液滴都發(fā)射出熒光信號，因此，和常規(guī)PCR技術(shù)中的由反應通道整個表面發(fā)射出的熒光信號相比，這樣的熒光信號可以更容易并且更準確地被定量分析。另外，可以通過單個設備中的one-pot圖像分析來獲得實時PCR曲線，從而可以對核酸進行定量分析。
根據(jù)本發(fā)明，對進口通道所作的結(jié)構(gòu)改變使得該設備能夠?qū)嵤釂覲CR以及多元PCR，從而可以通過單個小設備來同時對多個基因進行分析。
本發(fā)明的核酸擴增設備可以包括由多個可獨立控制的加熱器組成的加熱裝置。因此，基底可以具有差異性控溫的區(qū)域，這使得可以在單個設備中在不同溫度進行核酸擴增實驗。
另外，根據(jù)本發(fā)明，可以在單個設備上實施兩個步驟的單分子PCR，因此增強了PCR的靈敏度。
盡管已經(jīng)通過對數(shù)個實施方案而對本發(fā)明作了具體的顯示和描述，然而本領域的技術(shù)人員應理解，能夠在不背離權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神及范圍的情況下對這些實施例的形式和細節(jié)作出各種改變。
權(quán)利要求
1.一種用于進行核酸擴增的方法，包括下列步驟通過不同的進口通道將含有核酸擴增反應物的反應物水溶液和一種流體導入反應容器內(nèi)，所述流體是經(jīng)過相分離術(shù)與反應物水溶液分離的并且不參與擴增反應；通過使所述反應物水溶液和流體在反應容器內(nèi)接觸，產(chǎn)生多個被該流體包圍的反應物水溶液液滴；以及在所述反應物水溶液液滴內(nèi)進行核酸擴增。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述流體選自下組中的至少一種硅油、礦物油、全氟化油、烴油或蔬菜油。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的核酸擴增是用一種選自下組的方法來實施的聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、鏈置換擴增(SDA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導的擴增(TMA)或環(huán)介導的等溫擴增(LAMP)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的核酸擴增通過PCR進行。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述的核酸擴增通過PCR進行，所述PCR中基底的整個表面被反復地加熱并冷卻到預定溫度。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述的核酸擴增通過連續(xù)流動PCR進行，所述PCR中的基底被加熱成具有至少兩個溫度不同的區(qū)域，而且反應物水溶液液滴交替地并反復地通過所述溫度不同的區(qū)域。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述基底用多個可獨立控制的加熱器加熱成具有至少兩個溫度不同的區(qū)域。
8.權(quán)利要求4的方法，其中將反應物水溶液及流體導入反應容器內(nèi)的操作還包括向該反應容器中導入對照水溶液和標準樣品水溶液，所述對照水溶液為用于定量分析的陰性對照水溶液和陽性對照水溶液中的至少一種，所述對照水溶液和標準樣品水溶液通過分別的進口通道導入，所述進口通道不同于用于導入所述反應物水溶液及流體的進口通道，和產(chǎn)生所述反應物水溶液液滴的操作還包括，通過將對照水溶液以及標準樣品水溶液與反應容器內(nèi)的流體接觸，從而產(chǎn)生多個對照水溶液液滴和多個標準樣品水溶液液滴，所述對照水溶液為陰性對照和陽性對照水溶液中的至少一種。
9.權(quán)利要求8的方法，其中在將所述反應物水溶液及流體導入反應容器內(nèi)的操作中，將標準樣品水溶液調(diào)節(jié)到至少兩種濃度并隨后導入該反應容器內(nèi)。
10.權(quán)利要求4的方法，其中在將所述反應物水溶液及流體導入反應容器內(nèi)的操作中，將含有至少兩種引物的至少兩種反應物水溶液通過其各自的進口通道導入反應容器中。
11.權(quán)利要求4的方法，其中在將所述反應物水溶液及流體導入反應容器內(nèi)的操作中，將核酸水溶液、含有聚合酶及dNTP的共同組分、以及引物導入其各自的進口通道中，并在導入該反應容器之前進行混合以形成反應物水溶液。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述反應容器包括兩個第一反應通道以及單個第二反應通道，該第二反應通道和兩個第一反應通道中的每一個的終端相連，且在兩個第一反應通道的每一個中實施以下操作將所述反應物水溶液及流體導入反應容器、產(chǎn)生反應物水溶液液滴和進行核酸擴增；且其中在進行核酸擴增以后，該方法還包括在第二反應通道的起始端合并反應物水溶液液滴以在第二反應通道內(nèi)生成多個合并的反應物水溶液液滴；以及在合并的反應物水溶液液滴中進行核酸擴增。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述反應容器包括至少一個反應室，以及其中在所述反應物水溶液液滴中進行核酸擴增以后，該方法還包括在該反應室中合并反應物水溶液液滴；以及在合并的反應物水溶液液滴中進行核酸擴增。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述反應物水溶液液滴的合并通過離心來實施。
15.一種用于擴增核酸的設備，該設備包括基底；在該基底內(nèi)側(cè)形成的反應容器；至少一個在該基底內(nèi)側(cè)形成的第一進口通道，其與所述反應容器的一端相連，并允許將含有核酸擴增反應物的反應物水溶液導入該反應容器；在該基底內(nèi)側(cè)形成的第二進口通道，其與所述反應容器的上述末端相連，并允許將流體導入該反應容器內(nèi)，所述流體是經(jīng)過相分離術(shù)與反應物水溶液分離的并且不參與擴增反應；以及加熱裝置，該加熱裝置安裝在所述基底上并用于對該基底進行加熱，使所述反應物水溶液和流體接觸，從而在反應容器內(nèi)生成被該流體包圍的多個反應物水溶液液滴，并在所述反應物水溶液液滴內(nèi)實施核酸擴增。
16.權(quán)利要求15的設備，其中所述流體選自下組中的至少一種硅油、礦物油、全氟化油、烴油或蔬菜油。
17.權(quán)利要求15的設備，其中所述基底具有疏水性表面。
18.權(quán)利要求17的設備，其中所述所述基底由以下材料之一制成聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)、硅、二氧化硅、塑料或玻璃。
19.權(quán)利要求15的設備，其中所述基底包括上基底及下基底，而且所述反應容器、第一進口通道、第二進口通道在所述下基底及上基底之間形成。
20.權(quán)利要求15的設備，其中所述核酸在反應物水溶液液滴內(nèi)通過選自下組之一的方式進行擴增PCR、LCR、SDA、NASBA、TMA或LAMP。
21.權(quán)利要求20的設備，其中所述核酸在反應物水溶液液滴中通過PCR擴增。
22.權(quán)利要求21的設備，其中所述反應容器是蛇形反應通道，所述第一進口通道及第二進口通道連接于反應通道的起始端，且用于放出流體和核酸擴增產(chǎn)物的出口連接于該反應通道的終端。
23.權(quán)利要求22的設備，其中的加熱裝置安裝在所述基底的下表面并包括至少兩個加熱器，所述加熱器用于對所述基底進行加熱以使該基底具有至少兩個溫度不同的區(qū)域。
24.權(quán)利要求22的設備，其中所述加熱裝置包括多個可獨立控制的加熱器，所述加熱器平行地安裝在基底的下表面以對該基底進行加熱，從而使得該基底具有至少兩個溫度不同的區(qū)域。
25.權(quán)利要求23的設備，其中所述反應通道交替而反復地通過所述不同溫度區(qū)域。
26.權(quán)利要求22的設備，其中所述第二進口通道從所述反應通道的起始端以直線延伸，而且所述第一進口通道與該第二進口通道相垂直。
27.權(quán)利要求22的設備，該設備還包括在該基底內(nèi)側(cè)形成的第三進口通道，其與所述反應通道的所述起始端相連，并允許將對照水溶液導入該反應通道中，所述對照水溶液為用于定量分析的陰性對照水溶液和陽性對照水溶液中的至少一種；以及在該基底內(nèi)側(cè)形成的第四進口通道，其與所述反應通道的上述起始端相連，并允許將用于定量分析的標準樣品水溶液導入該反應通道中。
28.權(quán)利要求27的設備，其中所述第四進口通道與至少兩個用于導入標準樣品的標準樣品進口通道相連，并與用于將標準樣品稀釋到預定濃度的蒸餾水進口通道相連。
29.權(quán)利要求28的設備，其中所述第四進口通道具有蛇形。
30.權(quán)利要求22的設備，其中所述設備包括至少兩個第一進口通道，且所述第一進口通道與至少兩個引物進口通道對應地相連以允許將至少兩種不同的引物導入第一進口通道中。
31.權(quán)利要求30的設備，其中所述每個第一進口通道具有蛇形。
32.權(quán)利要求22的設備，其中所述第一進口通道與引物進口通道相連用于將引物導入該第一進口通道中，并且和共同組分進口通道相連用于將包括聚合酶及dNTP的共同組分導入該第一進口通道中。
33.權(quán)利要求32的設備，其中所述反應通道的起始端一側(cè)的一部分具有蛇形。
34.權(quán)利要求15的設備，其中所述反應容器包括兩個蛇形的第一反應通道及與這兩個第一反應通道的每一個的終端相連的單個蛇形第二反應通道，且所述第一進口通道及第二進口通道都與這兩個第一反應通道的起始端相連。
35.權(quán)利要求34的設備，其中所述加熱裝置包括多個可獨立控制的加熱器，所述加熱器安裝在該基底的下表面以便為所述兩個第一反應通道中的每一個及單個第二反應通道提供兩個溫度不同的區(qū)域。
36.權(quán)利要求15的設備，其中所述反應容器是反應室，該反應室的一端與所述第一進口通道及第二進口通道相連，而該反應室的另一端與出口通道相連以便放出所述流體及核酸擴增產(chǎn)物。
37.權(quán)利要求36的設備，其中所述設備包括多個反應室、多個第一進口通道、多個第二進口通道及多個出口通道。
38.權(quán)利要求36的設備，其中所述加熱裝置包括單個加熱器，該加熱器安裝在所述基底的下表面并將該基底的整個表面加熱到預定溫度。
全文摘要
本發(fā)明提供用于核酸擴增的方法及設備。該方法包括使含有核酸擴增反應物的反應物水溶液及與反應物水溶液相分離并不參與擴增反應的流體通過不同的進口通道導入反應容器內(nèi)，并在反應容器內(nèi)接觸，形成多個被該流體包圍的反應物水溶液液滴，并在所述液滴內(nèi)進行核酸擴增。所述設備包括以下組分基底；在該基底內(nèi)側(cè)形成的反應容器；至少一個在該基底內(nèi)側(cè)形成的第一進口通道，其與反應容器的終端相連并允許將含有核酸擴增反應物的反應物水溶液導入反應容器內(nèi)；在該基底內(nèi)側(cè)形成的第二通道，其與反應容器的終端相連并允許將流體導入所述容器內(nèi)，所述流體與反應物水溶液相分離且不參加擴增反應；以及在該基底上的加熱器，其與所述基底熱接觸并對基底進行加熱。
文檔編號C12M1/00GK1680574SQ20051005276
公開日2005年10月12日 申請日期2005年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月12日
發(fā)明者趙允卿, 金俊鎬, 南宮桷, 林根培, 閔畯泓 申請人:三星電子株式會社