專利名稱：誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的阿魏酸及其鈉鹽的試劑和藥物用途的制作方法
背景技術(shù)：
阿魏酸及其鈉鹽阿魏酸，化學(xué)名3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenoicacid，分子式C10H10O4，相對(duì)分子量194.18，結(jié)構(gòu)式如

圖1。阿魏酸苯環(huán)上的羥基是功能基，可清除自由基，抑制氧化反應(yīng)和自由基反應(yīng)。
阿魏酸的理化性質(zhì)順式為黃色油狀物，反式為斜方針狀結(jié)晶(水)，熔點(diǎn)174℃。溶于熱水、乙醇及醋酸乙酯，易溶于乙醚，微溶于石油醚及苯。阿魏酸的鈉鹽較穩(wěn)定。
阿魏酸的制備1)從植物，如阿魏、川芎、石松、木賊、稻根等的細(xì)胞壁中提取；2)從阿魏酸與一些小分子物質(zhì)的結(jié)合物中獲得，如從γ-谷維素的鹼性水解產(chǎn)物分離；3)通過組織培養(yǎng)獲得，如對(duì)糖甜菜、玉米進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，即能獲得水溶性的阿魏酸葡萄糖，阿魏酸蔗糖酯等；4)阿魏酸的化學(xué)合成多以香蘭醛和丙二酸為原料，以無水吡啶為溶劑，哌啶作催化劑，通過縮合反應(yīng)獲得。
作為一種中藥活血化瘀的有效成分，中國(guó)學(xué)者已對(duì)阿魏酸的藥理作用進(jìn)行了廣泛深入的研究，歸納起來如下。
1)抗氧化 阿魏酸不僅能猝滅自由基，而且能調(diào)節(jié)人體生理機(jī)理，抑制產(chǎn)生自由基產(chǎn)生的酶，促進(jìn)請(qǐng)除自由基酶的產(chǎn)生，增強(qiáng)其活性。
2)對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用 阿魏酸能增加冠脈流量，保護(hù)缺血心肌。由于對(duì)α-受體有阻斷作用，因而能抑制主動(dòng)脈平滑肌收縮，對(duì)抗甲氯胺、腎上腺素的升壓作用。
3)抗血小板聚集作用 大鼠口服阿魏酸鈉600mg/kg后2h，以膠原誘導(dǎo)的血小板聚集性及血小板TXA樣物質(zhì)活性均受顯著抑制，抑制率為46％及47％。
4)降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用 抑制肝臟合成膽固醇，與生物膜磷脂結(jié)合保護(hù)膜脂質(zhì)，清除、拮抗自由基對(duì)組織的損傷。
5)抗病毒、抗菌作用 阿魏酸對(duì)感冒病毒、呼吸道合胞體病毒(RSV)和艾滋病病毒都有顯著抑制作用；阿魏酸抑制細(xì)菌的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，對(duì)多種細(xì)菌，如志賀氏痢疾桿菌、肺炎桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等有較強(qiáng)的抑制作用。
6)抗突變和防癌作用 偶氮甲烷(AOM)人工誘發(fā)F334鼠產(chǎn)生結(jié)腸癌，加喂500mg/kg阿魏酸的鼠病灶數(shù)下降27％。阿魏酸及其衍生物還能抑制結(jié)腸癌、直腸癌和舌癌。阿魏酸的抗癌活性可能與它的抗氧化、清除自由基以及激活谷胱苷肽轉(zhuǎn)硫酶、醌還原酶的活性有關(guān)。
7)抗過敏、抗早孕、抗痙攣?zhàn)饔谩?br> 8)增強(qiáng)腎血流量、顯示具有腎髓質(zhì)擴(kuò)血管性前列腺素樣作用。
9)活化淋巴細(xì)胞、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。
毒理學(xué) 大鼠灌胃給藥600mg/kg，每天一次，連續(xù)給藥3個(gè)月，血液學(xué)和血液化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果均屬正常，主要臟器病理學(xué)組織學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)藥物引起的病理變化。藥代動(dòng)力學(xué) 靜脈給藥，血漿蛋白結(jié)合率為20.6％，大鼠分布半衰期(t1/2α)為3分鐘，消除半衰期(t1/2β)為(11.46±3.2)分鐘，分布迅速，可通過血-腦脊液屏障，主要經(jīng)腎臟排泄，體內(nèi)不易蓄積。
阿魏酸在臨床上已經(jīng)用于治療腦血栓形成、冠心病、脈管炎，偏頭痛、預(yù)防缺血性腦血管病、急性腎功能衰竭等。在食品工業(yè)中，阿魏酸也已作為防腐保鮮劑、食品交聯(lián)劑、運(yùn)動(dòng)食品添加劑被廣泛使用。胚胎干細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化人類胚胎干細(xì)胞分離成功以前，對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行的大量研究表明，小鼠胚胎干細(xì)胞在體外不僅可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，而且可以富集得到較純凈的神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞可以進(jìn)一步成熟分化為多巴胺能神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、五羥色胺神經(jīng)元、GABA神經(jīng)元，以及少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，將體外分化得到的多巴胺能神經(jīng)元植入Parkinson’s病模型大鼠可以減輕其癥狀；來自小鼠胚胎干細(xì)胞的少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞可以使髓鞘脫失的大鼠脊髓髓鞘再生；從小鼠胚胎干細(xì)胞分化來的神經(jīng)干細(xì)胞植入跌落損傷脊髓9天的大鼠脊髓，植入的細(xì)胞進(jìn)一步分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞；與對(duì)照組相比，治療組的小鼠可以有限地使用其后肢。如果人類胚胎干細(xì)胞與小鼠胚胎干細(xì)胞一樣，在體外可以分化為多巴胺能神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞等，并能發(fā)揮相應(yīng)的功能，這將為神經(jīng)系統(tǒng)的再生、修復(fù)，以及多種疾病的治療提供寶貴的細(xì)胞來源。80年代人們開始嘗試胚胎腦組織細(xì)胞移植，用細(xì)胞移植的方法治療神經(jīng)退行性疾病(如Parkinson’s病，老年性癡呆等，能使大多數(shù)病人的癥狀得到改善。這些結(jié)果證實(shí)了移植的神經(jīng)干細(xì)胞的存活能力，以及移植治療的可行性。
神經(jīng)干細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化在成年動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的大多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，其存在貫穿于機(jī)體生命的全程，當(dāng)其死亡則不可代替。然而，有證據(jù)表明，在成年動(dòng)物的腦室區(qū)，嗅覺系統(tǒng)和海馬有一小部分神經(jīng)元繼續(xù)新生。在成年動(dòng)物的海馬，新生的神經(jīng)元起源于齒狀回的顆粒細(xì)胞層下區(qū)的干細(xì)胞。這些干細(xì)胞的子代出生后一月內(nèi)分化為顆粒細(xì)胞層的神經(jīng)元，嚙齒類終生具有這種神經(jīng)細(xì)胞再生能力。
體外的研究結(jié)果表明，從成年小鼠腦室后和前腦分離出來的神經(jīng)干細(xì)胞，當(dāng)其受到上皮生長(zhǎng)因子(EGF)或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)刺激時(shí)，在體外有神經(jīng)發(fā)生能力。堿性成纖維細(xì)胞因子對(duì)不同腦區(qū)分離出來的腦細(xì)胞都是一種強(qiáng)絲裂原。堿性成纖維細(xì)胞因子可讓分離培養(yǎng)的腦海馬細(xì)胞多次傳代長(zhǎng)達(dá)1年，并誘使其中一些細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元表型。定向誘導(dǎo)人類干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞是目前的研究熱點(diǎn)。
神經(jīng)干細(xì)胞的定向移動(dòng)神經(jīng)干細(xì)胞的移動(dòng)對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和大多數(shù)脊椎動(dòng)物(包括哺乳類)成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)的持續(xù)神經(jīng)發(fā)生都是一個(gè)必須的過程。無論是小鼠還是人，神經(jīng)干細(xì)胞都有遠(yuǎn)距離精確定向移動(dòng)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷部位的能力。這可能是機(jī)體局限和修復(fù)損傷的適應(yīng)性反應(yīng)。神經(jīng)干細(xì)胞移動(dòng)的信號(hào)必然來自損傷部位。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及作為誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的阿魏酸及其鈉鹽的試劑和藥物用途。
下面列舉實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果，作為阿魏酸及其鈉鹽可用于誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的試劑和藥物的證據(jù)。
1.阿魏酸鈉體外定向誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞材料和方法1)藥物阿魏酸鈉2)小鼠胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取妊娠6天(E6)ICR小鼠，斷髓犧牲，放入75％酒精中浸泡消毒1min。超凈工作臺(tái)上打開腹腔，取出子宮，置于盛有D-Hank液的培養(yǎng)皿中。一一取出胚胎，放入盛有D-Hanks液的青霉素瓶中。再用D-Hanks液沖洗3次，眼科剪剪成小碎塊(1mm3左右)。加入0.25％胰蛋白酶(剛剛覆蓋組織即可)，37℃水平搖床消化15min。15分鐘后用含10％小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。吸取消化液，通過250目不銹鋼篩網(wǎng)過濾到青霉素瓶中。然后將濾液移入離心管，1000r/min，5min離心。棄上清，臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。用DMEM/F12調(diào)節(jié)為2～5×105個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種，加入含10％血清的DMEM/F12培養(yǎng)基6～7ml，移入50ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。24h后，改用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，3-4天換液一次。
3)小鼠胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞中，加入阿魏酸鈉，使其終濃度為10μM，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化、照相記錄，并進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定。
4)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定以免疫組化方法檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)絲蛋白(NF-M)、巢蛋白(nestin)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)。
結(jié)果1).光鏡下觀察加入阿魏酸鈉誘導(dǎo)6h后，部分細(xì)胞形態(tài)開始改變，胞質(zhì)向核收縮，呈典型的核周體形態(tài)，胞體周圍伸出較長(zhǎng)的突起(軸突)，突起末端出現(xiàn)一級(jí)和二級(jí)分支，類似神經(jīng)元，隨著時(shí)間的推移，轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元形態(tài)的干細(xì)胞逐漸增加，部分細(xì)胞拉成網(wǎng)狀(圖2)。超過24h后，小部分細(xì)胞脫落，呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)。空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)未見任何變化。
2).免疫組化鑒定免疫組化染色顯示，實(shí)驗(yàn)組中神經(jīng)元樣細(xì)胞的胞體及部分突起NSE、NF-M、nestin染色為陽性，呈棕黃色，GFAP染色呈陰性。當(dāng)阿魏酸鈉誘導(dǎo)濃度為10μM時(shí)，陽性細(xì)胞率為36.82％。
2.阿魏酸鈉體外定向誘導(dǎo)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞材料1)藥物阿魏酸鈉2)骨髓成人健康骨髓3)試劑Ficoll-paque淋巴細(xì)胞分離液，胎牛血清(GIBCO公司)，L-DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)，堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF，R&D公司)，小鼠抗人巢蛋白(nestin)單抗(Maxim公司)、小鼠抗人神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)單抗、小鼠抗人神經(jīng)絲蛋白(NF-M)單抗和神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)單抗(美國(guó)Zymed)，Envision二步法試劑盒(DAKO公司)。
方法1).骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增無菌條件下采集正常人骨髓10～20ml，肝素抗凝，與等體積PBS混勻，輕輕滴加到密度1.077g/ml等量Ficoll-paque分離液上。2500r/min離心25min，收集單個(gè)核細(xì)胞層，用PBS洗滌兩次，1500r/min離心10min。細(xì)胞重懸于含10％胎牛血清(FCS)的L-DMEM培養(yǎng)液，以2.0×106/ml密度接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶，置37℃、5％CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48h后更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁細(xì)胞，3～4天換液1次。貼壁細(xì)胞接近80％～90％融合后，用0.25％胰蛋白酶-1mmol EDTA消化0.5～1min，1000r/min離心10min，棄上清，加入L-DMEM培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。
2)定向誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化bFGF預(yù)誘導(dǎo)-阿魏酸鈉誘導(dǎo)組(實(shí)驗(yàn)組)傳代培養(yǎng)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞按0.5×106/ml接種于事先放置有消毒蓋玻片的6孔板內(nèi)制備細(xì)胞爬片。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60％～70％融合時(shí)，棄培養(yǎng)液，加入含bFGF(10μg/L)的L-DMEM培養(yǎng)液(含20％的FCS)預(yù)誘導(dǎo)24h后，更換培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，再分別加入不同濃度阿魏酸鈉對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，并在阿魏酸鈉10μM條件下，觀察同一濃度阿魏酸鈉不同時(shí)間對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響。分組空白對(duì)照組，不加任何誘導(dǎo)劑；硫代甘油對(duì)照組，用含1mmol/L的硫代甘油的L-DMEM預(yù)誘導(dǎo)，再加入含5mmol/L的硫代甘油的L-DMEM誘導(dǎo)；bFGF對(duì)照組，單用bFGF預(yù)誘導(dǎo)；阿魏酸鈉對(duì)照組，不用bFGF預(yù)誘導(dǎo)，直接加入10μM阿魏酸鈉的無血清L-DMEM；bFGF-阿魏酸鈉組(實(shí)驗(yàn)組)，如上。每組包括12個(gè)細(xì)胞爬片。免疫組化鑒定。
3)免疫組化鑒定為確定骨髓間質(zhì)干細(xì)胞是否分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，采用神經(jīng)元標(biāo)志物NSE、NF-M、nestin、GFAP進(jìn)行鑒定。誘導(dǎo)細(xì)胞用40g/L多聚甲醛固定15min，洗滌后加入過氧化物酶阻斷劑，非免疫性動(dòng)物羊血清封閉，分別加入nestin(1∶50稀釋)、NSE(1∶50稀釋)、NF-M(1∶100稀釋)和GFAP(1∶50稀釋)單抗4℃孵育過夜，PBS洗滌后加入Envision孵育30min，TBS洗滌，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。各組細(xì)胞免疫組化染色后光鏡下隨機(jī)讀取10個(gè)非重疊視野(×100)，計(jì)算nestin、NSE、NF-M和GFAP陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例。
結(jié)果1)光鏡下觀察骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)變化骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在含bFGF的DMEM預(yù)誘導(dǎo)液中處理24h，細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。加入阿魏酸鈉誘導(dǎo)液3h后，部分骨髓間質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)開始改變，胞質(zhì)向核收縮，呈典型的核周體形態(tài)，胞體周圍伸出較長(zhǎng)的突起(軸突)，突起末端出現(xiàn)一級(jí)和二級(jí)分支，類似神經(jīng)元，隨著時(shí)間的推移，轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元形態(tài)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞逐漸增加，部分細(xì)胞拉成網(wǎng)狀?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞形態(tài)未見任何變化；硫代甘油對(duì)照組誘導(dǎo)5h后，多數(shù)細(xì)胞呈較典型的神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)，但部分細(xì)胞脫落。單用bFGF對(duì)照組中僅有少量神經(jīng)元樣細(xì)胞出現(xiàn)。單用阿魏酸鈉對(duì)照組在加入阿魏酸鈉誘導(dǎo)液6h后部分骨髓間質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)開始改變，胞質(zhì)向核收縮，呈典型的核周體形態(tài)，胞體周圍伸出較長(zhǎng)的突起(軸突)，突起末端出現(xiàn)一級(jí)和二級(jí)分支，類似神經(jīng)元，。
2)免疫組化鑒定免疫組化染色顯示，實(shí)驗(yàn)組中神經(jīng)元樣細(xì)胞的胞體及部分突起NSE、NF-M、nestin染色為陽性，呈棕黃色，GFAP染色呈陰性。
3)不同濃度阿魏酸鈉對(duì)NSE、NF-M、nestin、GFAP陽性率的影響NSE染色陽性細(xì)胞呈棕黃色，實(shí)驗(yàn)組在不同濃度阿魏酸鈉(1～20μM)作用下，NSE陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例隨著濃度的增加而增加，當(dāng)阿魏酸鈉濃度為10μM時(shí)，NSE陽性細(xì)胞率＞50％?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞形態(tài)未見任何變化；硫代甘油對(duì)照組有大量神經(jīng)元樣細(xì)胞(NSE和NF-M陽性細(xì)胞率＞50％)；單用bFGF對(duì)照組有部分神經(jīng)元樣細(xì)胞(NSE和NF-M陽性細(xì)胞率＜13％)；單用阿魏酸鈉對(duì)照組有較大量神經(jīng)元樣細(xì)胞(NSE和NF2M陽性細(xì)胞率＞30％)。
4)阿魏酸鈉作用時(shí)間與NSE陽性細(xì)胞率關(guān)系實(shí)驗(yàn)組和硫代甘油對(duì)照組隨著時(shí)間的推移，NSE陽性細(xì)胞率增加，且胞漿棕黃顏色加深，10μM阿魏酸鈉作用12h NSE陽性細(xì)胞率最高，之后NSE陽性細(xì)胞數(shù)目基本不變。
3.阿魏酸鈉對(duì)小鼠妊娠末期谷氨酸單鈉(MSG)灌胃導(dǎo)致的發(fā)育中胎腦損傷的修復(fù)作用材料和方法取8周齡ICR小鼠40只，2雌1雄隨機(jī)配對(duì)同箱飼養(yǎng)。交配成功后分籠飼養(yǎng)。待母鼠妊娠晚期，胎鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)基本發(fā)育分化完全，即妊娠17-21日，一次性灌胃給予母鼠MSG(3.0g/kg體重)，對(duì)照組一次性灌胃同體積生理鹽水。所產(chǎn)仔鼠進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組從生后10日起腹腔注射阿魏酸鈉溶液(60mg/kg體重)，每天1次，共計(jì)30日，對(duì)照組腹腔注射同體積生理鹽水。末次注射后24h從每組隨機(jī)取4只小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉(0.06mg/kg體重)麻醉，用10％福爾馬林溶液作心臟灌流犧牲小鼠。斷頭取腦，置相同濃度福爾馬林溶液中固定1周。石蠟包埋，作10μm連續(xù)切片，每100μm取1片。焦油紫染色，光鏡檢查。各組剩下的小鼠于末次注射阿魏酸鈉溶液后的第1日、第31日、第61日和第91日分別進(jìn)行4次行為學(xué)檢查，檢查小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，自主活動(dòng)，爬繩能力等。
結(jié)果行為檢查結(jié)果顯示，藥物(阿魏酸鈉)對(duì)照組與正常對(duì)照組小鼠的學(xué)習(xí)記憶、爬繩能力和自主活動(dòng)無明顯差別。MSG組小鼠的學(xué)習(xí)記憶、爬繩能力，前3次檢查，較之對(duì)照組都顯著降低，差異非常顯著(P＜0.01)，第4次(即第91日)檢查有一定提高，但差異仍顯著(P＜0.05)。與之相反，MSG小鼠的自主活動(dòng)前3次檢查都明顯增加，差異非常顯著(P＜0.01)，第4次(即91日)檢查則接近正常(P＞0.05)。4次行為檢查結(jié)果都顯示，實(shí)驗(yàn)組(MSG+阿魏酸鈉)小鼠的各種行為學(xué)檢查與正常對(duì)照組小鼠無明顯差別(P＞0.05)。形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果顯示，藥物(阿魏酸鈉)對(duì)照組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)與正常對(duì)照組無明顯差別，MSG組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞則明顯變性、壞死，而MSG+阿魏酸鈉處理的實(shí)驗(yàn)組小鼠海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)與正常對(duì)照組和藥物(阿魏酸鈉)對(duì)照組小鼠的接近，無明顯差別(圖3)。
4.神經(jīng)干細(xì)胞移植合用阿魏酸鈉修復(fù)脊髓損傷材料和方法1)大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定取孕16-18日的SD大鼠，斷髓犧牲，放入75％酒精中浸泡消毒1min。超凈工作臺(tái)上打開腹腔，取出子宮，一一取出胎鼠，剪開頭皮，去除顱骨，剝離硬膜，分離胎鼠大腦半球，取大腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下腦室旁腦組織，將其放入盤中。加入PBS，用眼科剪剪成約1mm3組織小塊，用微量加樣器反復(fù)輕柔吹打。通過250目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，加PBS，光鏡下觀察，制成單細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。培養(yǎng)，傳代，5-7日傳代一次。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞行nestin、NSE、GFAP免疫組化鑒定。
2)脊髓損傷的動(dòng)物模型成年SD大鼠48只，雌雄不拘，隨機(jī)平均分為3組損傷組(A組，假手術(shù)對(duì)照組)、神經(jīng)干細(xì)胞移植組(B組)及神經(jīng)干細(xì)胞移植合用阿魏酸鈉組(C組)。用體積分?jǐn)?shù)3％戊巴比妥鈉麻醉，背正中縱形切口，顯露并切除T10-12棘突和椎板，充分暴露脊髓將其橫斷并剪去0.3-0.5cm，制作大鼠后肢癱瘓動(dòng)物模型，但不損傷A組動(dòng)物脊髓。
3)神經(jīng)干細(xì)胞移植及合用阿魏酸鈉B、C組動(dòng)物在損傷后3d進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植。之前將培養(yǎng)傳代的神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞計(jì)數(shù)后，選取生長(zhǎng)良好的培養(yǎng)細(xì)胞(活細(xì)胞達(dá)95％以上)，500r/min離心10min，取細(xì)胞團(tuán)塊，加生理鹽水制成1×102/ml細(xì)胞懸液。沿原切口部位暴露脊髓損傷灶，作局部多點(diǎn)注射。C組動(dòng)物在神經(jīng)干細(xì)胞移植后次日起腹腔注射阿魏酸鈉溶液(60mg/kg體重)，每天1次，共計(jì)30日。A、B組腹腔注射同體積生理鹽水。
4)觀察指標(biāo)①各組動(dòng)物按雙后肢功能恢復(fù)情況進(jìn)行等級(jí)評(píng)分。雙后肢完全癱瘓為0分；重度癱瘓(肌張力存在)為1分；中度癱瘓仍可行走者為2分；正常為3分。
②脊髓移植區(qū)的組織形態(tài)學(xué)變化細(xì)胞移植30日后，取出移植區(qū)脊髓，作切片以常規(guī)蘇木素·伊紅染色，觀察比較各組間的組織學(xué)變化。
結(jié)果1)大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng) 原始神經(jīng)干細(xì)胞為圓球狀，體積較人類神經(jīng)干細(xì)胞略大，活細(xì)胞比例大于95％。培養(yǎng)2-3日后，細(xì)胞分裂形成多個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，懸浮生長(zhǎng)。之后細(xì)胞團(tuán)逐漸增大，少量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，并出現(xiàn)突起，相互交織成網(wǎng)狀。經(jīng)液體微孔稀釋法處理的單個(gè)細(xì)胞，仍然可見細(xì)胞分裂。Nestin免疫組化染色呈陽性。
2)神經(jīng)干細(xì)胞移植及合用阿魏酸鈉①細(xì)胞移植后第6-8日，C組動(dòng)物癱瘓的后肢肌力開始恢復(fù)，細(xì)胞移植后第8-10日B組動(dòng)物癱瘓的后肢肌力開始恢復(fù)，被評(píng)為1分；第12-18日C組動(dòng)物可爬行，第16-22日B組動(dòng)物可爬行，評(píng)為2分；30日后，B組動(dòng)物后肢活動(dòng)活躍，已接近3分，C組動(dòng)物后肢活動(dòng)恢復(fù)正常，評(píng)為3分，；對(duì)照組癱瘓的肢體無任何恢復(fù)仍為0分。
②細(xì)胞移植30日后脊髓移植區(qū)肉眼可見有增生的組織充填，鏡下有大量新生的細(xì)胞，表現(xiàn)為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞陽性染色(GFAP(+)、NSE(+)，C組動(dòng)物脊髓移植區(qū)組織充填較B組動(dòng)物的更充實(shí)；對(duì)照組肉眼見兩斷端間呈空腔狀，鏡下脊髓殘端變性壞死明顯。
5.神經(jīng)干細(xì)胞移植合用阿魏酸鈉修復(fù)腦損傷材料和方法1)大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定同上。
2)腦損傷的動(dòng)物模型SD大鼠24只，雌雄兼有。體積分?jǐn)?shù)3％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后頭頂正中切開頭皮，鉆開頂骨，顯露右側(cè)大腦半球。用直徑0.3cm的克氏針垂直向大鼠大腦右側(cè)頂葉皮質(zhì)刺入0.5cm左右，造成腦挫裂傷動(dòng)物模型。動(dòng)物隨機(jī)平均分為4組A組，對(duì)照組，單側(cè)損傷，未作移植；B組，單側(cè)損傷，未作移植，腹腔注射阿魏酸鈉溶液；C組，單側(cè)損傷，細(xì)胞移植；D組，單側(cè)損傷，細(xì)胞移植并腹腔注射阿魏酸鈉溶液。24h后進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植(及合用阿魏酸鈉)實(shí)驗(yàn)。
3)神經(jīng)干細(xì)胞移植及合用阿魏酸鈉按上述分組要求進(jìn)行腦損傷部位的神經(jīng)干細(xì)胞移植(6×104神經(jīng)干細(xì)胞，多點(diǎn)注射)，腹腔注射阿魏酸鈉溶液(60mg/kg體重)，每日1次，共計(jì)45日。術(shù)后46日斷髓犧牲動(dòng)物，取腦標(biāo)本，肉眼和顯微鏡下觀察。
結(jié)果C組(細(xì)胞移植)動(dòng)物肉眼觀損傷區(qū)腦組織基本平坦，僅見輕微灰褐色色素沉著，顯微鏡下可見大量新生的細(xì)胞和血管，而變性或壞死細(xì)胞則很少；D組(細(xì)胞移植及合用阿魏酸鈉)動(dòng)物肉眼觀損傷區(qū)腦組織平坦，無色素沉著，顯微鏡下可見大量新生的細(xì)胞和血管。對(duì)照組動(dòng)物損傷區(qū)局限性輕度凹陷，腦組織壞死，呈深灰褐色，其內(nèi)有陳舊性凝血塊，顯微鏡下則可見損傷區(qū)大量神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，區(qū)域性融合呈空泡狀，缺乏細(xì)胞增生跡象。
6.神經(jīng)干細(xì)胞移植合用阿魏酸鈉實(shí)驗(yàn)治療動(dòng)物帕金森病材料和方法1)試劑1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP，)，是一種神經(jīng)毒素，來源于人工合成毒品的中間產(chǎn)物。由于它的致幻作用，曾被作為毒品吸食，在對(duì)這些吸毒者的研究中偶然發(fā)現(xiàn)能引起類似帕金森病的癥狀。Langston(1983)報(bào)告該物質(zhì)在人類可引起帕金森病綜合征，Burns(1983)發(fā)現(xiàn)其在靈長(zhǎng)類動(dòng)物也可引起酷似人類帕金森病的表現(xiàn)。病理、生化研究證實(shí)MPTP在人和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物引起的帕金森病綜合征同人類原發(fā)性帕金森病的表現(xiàn)也極其相似，表現(xiàn)為黑質(zhì)致密部多巴安能神經(jīng)元變性、死亡，黑質(zhì)及紋狀體酪氨酸羥化酶活性、多巴安及其代謝產(chǎn)物含量降低。MPTP造成的神經(jīng)化學(xué)、動(dòng)物行為和組織病理學(xué)改變都與人類的帕金森病癥狀類似，被公認(rèn)是最好的帕金森病動(dòng)物模型。
2)動(dòng)物10-12周齡，體重25～30g C57/BI褐小鼠。
3)小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定取孕15日的C57/BI褐小鼠，仿大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定方法進(jìn)行。
4)帕金森病動(dòng)物模型C57/BI褐小鼠40只，雌雄不拘，腹腔內(nèi)注射MPTP 20mg/kg，每2h一次，共4次。
5)小鼠腦室神經(jīng)細(xì)胞移植法用手抓住小鼠頭部皮膚并將皮膚拉緊，在距頭部中線2mm處與兩側(cè)耳根前部連線相交叉的點(diǎn)，用3/8英寸(長(zhǎng))27gauge的皮下針頭垂直刺人，穿破顱骨進(jìn)入腦室，緩慢注入細(xì)胞懸液。
6)分組小鼠腹腔注射MPTP后隨機(jī)平均分為4組A組，對(duì)照組，注射MPTP后24h緩慢向小鼠側(cè)腦室注射生理鹽水10μl，每5日1次，共計(jì)2次，左右側(cè)腦室各1次；B組，阿魏酸鈉組，注射MPTP后24h緩慢向小鼠側(cè)腦室注射生理鹽水10μl，每5日1次，共計(jì)2次，左右側(cè)腦室各1次，同時(shí)腹腔注射阿魏酸鈉溶液(60mg/kg體重)，每日1次，共計(jì)30日；C組，細(xì)胞移植組，注射MPTP后24h緩慢向小鼠側(cè)腦室注射神經(jīng)干細(xì)胞懸液10μl(5×103細(xì)胞)，每5日1次，共計(jì)2次，左右側(cè)腦室各1次，；D組，細(xì)胞移植并合用阿魏酸鈉組，注射MPTP后24h緩慢向小鼠側(cè)腦室注射神經(jīng)干細(xì)胞懸液10μl(5×103細(xì)胞)，每5日1次，共計(jì)2次，左右側(cè)腦室各1次，同時(shí)腹腔注射阿魏酸鈉溶液(60mg/kg體重)，每日1次，共計(jì)30日。
7)病理組織學(xué)檢查末次注射后24h從每組隨機(jī)取4只小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉(0.06mg/kg體重)麻醉，用10％福爾馬林溶液作心臟灌流犧牲小鼠。斷頭取腦，置相同濃度福爾馬林溶液中固定1周。石蠟包埋，作10μm連續(xù)切片，每100μm取1片。焦油紫染色，光鏡檢查。
7)動(dòng)物行為學(xué)改變的觀察 觀察檢測(cè)小鼠肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)情況。
(1)爬桿試驗(yàn)將一直徑為25cm的軟木小球固定于一根長(zhǎng)50cm粗1cm的木桿頂端，木桿上纏上紗布以防打滑，然后將被測(cè)小鼠放到小球上，并記錄以下幾個(gè)時(shí)間。①小鼠從小球上下來所需要的時(shí)間；②小鼠爬完桿子的上半部分所用的時(shí)間；③小鼠爬完桿子下半部分所用的時(shí)間。然后按以下標(biāo)準(zhǔn)記分3s內(nèi)完成上述某一動(dòng)作的記3分；6s內(nèi)完成的記2分；超過6s的記1分。最后計(jì)算得分情況，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
(2)懸掛實(shí)驗(yàn)將受試小鼠懸掛于一水平電線上，如小鼠用兩后爪抓住電線則記3分，如用一后爪抓住電線則記2分。如果小鼠兩后爪均抓不住電線則記1分，最后計(jì)算得分情況，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
(3)游泳實(shí)驗(yàn)將受試小鼠放人一個(gè)20cm×30cm×20cm規(guī)格的水箱中，水溫為22～25℃。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下在受試時(shí)間(5min)內(nèi)能連續(xù)不斷游泳者記3.0分；大部分時(shí)間游泳僅偶爾漂浮者記2.5分；漂浮時(shí)間占整個(gè)受試時(shí)間50％以上者記2.0分；偶爾游泳者記1.5分；偶爾用后肢游動(dòng)并漂浮在一邊者記1.0分。最后計(jì)算得分情況，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果綜合病理組織學(xué)檢查和動(dòng)物行為學(xué)改變觀察結(jié)果，實(shí)驗(yàn)治療帕金森病的效果從大到小依次為細(xì)胞移植并合用阿魏酸鈉組＞細(xì)胞移植組＞單用阿魏酸鈉組。
7.神經(jīng)干細(xì)胞移植合用阿魏酸鈉的臨床意義利用自體和異體干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病可提供一種有廣闊應(yīng)用前景的新治療途徑。目前應(yīng)用最多、治療效果最好的是腦組織神經(jīng)干細(xì)胞移植治療帕金森病。從患者受損腦組織中提取神經(jīng)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)、擴(kuò)增后再植入損傷部位，患者可恢復(fù)部分認(rèn)知功能?；颊咦泽w骨髓間質(zhì)干細(xì)胞亦可作為干細(xì)胞來源。上文結(jié)果提示，干細(xì)胞移植的同時(shí)合用阿魏酸鈉治療效果更好。
人類胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)成功為長(zhǎng)期困擾醫(yī)學(xué)界的難題如帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化、腦和神經(jīng)損傷后修復(fù)等帶來了解決的希望。選擇的移植材料的最好來源，從其出現(xiàn)開始人們就寄予厚望，體外定向誘導(dǎo)人類胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞是目前研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。擬胚體分化法及高細(xì)胞密度延長(zhǎng)培養(yǎng)分化法均可誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，上文結(jié)果提示，阿魏酸鈉可作為誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)劑。
移植轉(zhuǎn)基因的干細(xì)胞還可治療神經(jīng)遺傳性疾病，干細(xì)胞作為基因工程細(xì)胞具有自身固有的優(yōu)勢(shì)，阿魏酸鈉可誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，在結(jié)構(gòu)上與宿主受損的腦組織相整合，同時(shí)還能在腦內(nèi)遷移較遠(yuǎn)的距離。
腫瘤生長(zhǎng)不可避免地導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高及再灌注的血流量增多，同時(shí)受損細(xì)胞異常的離子流動(dòng)以及興奮性谷氨酸的釋放也會(huì)造成相關(guān)的損害?；熂胺暖煏?huì)殺傷少突膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞、以及海馬齒狀回前體細(xì)胞等，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。因此，對(duì)腦腫瘤理想的治療是既能殺傷腫瘤細(xì)胞又能修復(fù)損傷的腦組織。在化療及放療的同時(shí)移植神經(jīng)干細(xì)胞并合用阿魏酸鈉，有可能改善臨床治療效果。
8.下列的配方舉例說明本發(fā)明的制劑。
附圖注釋附圖1A.阿魏酸；B.阿魏酸鈉附圖2阿魏酸鈉體外定向誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞A.小鼠胚胎干細(xì)胞(對(duì)照組，×50)；B.小鼠胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞(阿魏酸鈉10μM，12h，×50)附圖3阿魏酸鈉對(duì)小鼠妊娠末期谷氨酸單鈉灌胃導(dǎo)致的發(fā)育中胎腦損傷的修復(fù)作用A.對(duì)照，×200；B.谷氨酸單鈉(3.0g/kg)，×200；C.谷氨酸單鈉(3.0g/kg)+阿魏酸鈉(60mg/kg/日，30日)，×200實(shí)施例1片劑，
制造方法在適當(dāng)?shù)幕旌蠙C(jī)中混合第1項(xiàng)和第2項(xiàng)組分15分鐘，第3組分與混合物?；Ｈ绻枰?，通過一個(gè)初篩研磨潮濕的顆粒，并使之干燥。如果需要，將干燥的顆粒過篩，并與第4項(xiàng)混合10-15分鐘。加入第5項(xiàng)混合1-3分鐘。在適當(dāng)?shù)膲浩瑱C(jī)中將混合物壓成適當(dāng)?shù)某叽绾椭亓俊?br> 實(shí)施例2膠囊劑
制造方法將第1、2和第3項(xiàng)在適當(dāng)?shù)幕旌蠙C(jī)中混合10-15分鐘，加入第4項(xiàng)混合1-3分鐘。在適當(dāng)?shù)陌覚C(jī)上將該混合物裝入適當(dāng)?shù)哪z囊中。
實(shí)施例3注射液1阿魏酸鈉100g2葡萄糖 400g3注射用水加至10000ml實(shí)施例4粉劑阿魏酸鈉 純度≥97％ 10-1000mg包裝阿魏酸鈉 純度≥97.5％10-1000mg包裝阿魏酸鈉 純度≥98％ 5-500mg包裝阿魏酸鈉 純度≥98.5％5-500mg包裝阿魏酸鈉 純度≥99％ 1-100mg包裝阿魏酸鈉 純度≥99.5％1-100mg包裝阿魏酸鈉 純度≥99.9％1-100mg包裝
權(quán)利要求
1.阿魏酸及其鈉鹽用于制備誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的試劑和藥物用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及作為誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的阿魏酸及其鈉鹽的試劑和藥物用途。阿魏酸(ferulic acid)，3－(4－h(huán)ydroxyl－3－methoxyphenyl)－2－propenoic acid，分子式C
文檔編號(hào)C12N5/08GK1969836SQ20051011965
公開日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2005年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日
發(fā)明者于廷曦, 于立堅(jiān), 馬潤(rùn)娣 申請(qǐng)人:于廷曦