專利名稱：：用于檢測核酸、核酸的甲基化狀態(tài)和突變體的包含信號對和疏水性核苷酸、無莖信標的寡...的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及檢測核酸序列的狀態(tài)，如存在、表達、曱基化和/或突變，特別是單點突變，以及其中正確靶和其它靶之間的差異可小至一個核苷酸的其它序列的領域。本發(fā)明涉及包含信號對(例如熒光團和猝滅劑)以及至少一個疏水性核苷酸的寡核苷酸和寡核脊酸類似物。本發(fā)明還涉及通過使用寡核苷酸類似物和容易獲得的儀器檢測序列差異和優(yōu)化條件的新方法。特別地，本發(fā)明涉及使用包含信號對和至少一個疏水性核苷酸的寡核普酸或寡核苷酸類似物(如包含嵌入劑的核苷酸類似物)特異性檢測耙核酸的量或檢測一個與其它序列的差異可小至一個核苷酸的序列。
背景技術：
：核酸(如DNA和RNA)以及許多核酸類似物，如PNA、HNA、MNA、ANA、LNA、INA、CNA、CeNA、TNA、(2'-NH)-TNA、(3'-NH)-TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、P-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、雙環(huán)-DNA、6-氨基-雙環(huán)-DNA、5-表-雙環(huán)-DNA、a-雙環(huán)-DNA、三環(huán)-DNA、雙環(huán)[4.3.0-DNA、雙環(huán)[3.2.1]-DNA、雙環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA、J3-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃來蘇糖基-NA、2'-R廣RNA、2'-0R廣RNA(Ri為任何取代基)、a-L-RNA、a-D-RNA、P-D-RNA和其它類似物，能夠與互補核酸鏈特異性雜交。此特異性識別可用來檢測規(guī)定的核酸序列的存在，例如用于診斷目的?？梢詸z測核酸序列之間的微小差異。也可以確定給定基因存在的mRNA的量，進而描迷該特定基因的表達水平。許多可用分析依賴于通過互補的可檢測探針來檢測特異的核酸。通常14需要分離未結合探針和結合探針以檢測所述特異性核酸，而這通常需要多個費時的分離步驟。DNA診斷學是發(fā)展最快的研究領域之一，并且現(xiàn)在隨著可獲得的人基因組圖譜(旨在獲得詳細的全序列)的日益詳細，人們對此領域的關注有望進一步擴大。已報道了具有142萬個單核苷酸多態(tài)性(SNP)的圖譜，預計至少有60,000個SNP位于人外顯子中。有趣的是，兩個人之間的基因組DNA序列的差異平均約為每IOOO個核苷酸有一個核苷酸差異。因此，特異性DNA序列可用于確定個體的身份。此外，突變可指示臨床病癥的誘因。遺傳病的一個經(jīng)典實例就是鐮狀細胞貧血，一種由單個基因(p-球蛋白基因)的單個tt變化(第6個密碼子處的GAG變?yōu)镚TG)引起的遺傳缺陷。搜索僅有一個或兩個威基差異的序列為高效(快速和易于進行以及經(jīng)濟)檢測核酸序列的工具創(chuàng)造了需求。生物學的另一個主要領域;l^因組的甲基化。基因組中"CpG'，對的甲基化是表觀遺傳信息的關鍵組成，并在印跡以及包括精神障礙、腫瘤生物學和病毒感染在內的多種臨床情況中顯示發(fā)揮重要功能。檢測基因曱基化狀態(tài)常用的靈敏技術是使用亞硫酸氬鈉處理基因組DNA，將所有未甲基化的胞嘧啶"C"轉化為脫氧核糖尿嘧啶"dU，，，而甲基化的胞嘧啶"MeC"則不反應，然后進行擴增反應。亞石克酸氫鹽處理基因組DNA將DNA轉化為富含"A-T"的，基本上是三核普酸的基因組(甲基化"CpG"對中存在的"MeC"例外)，曱基化的或未曱基化的"CpG"對的差異就轉化為序列的差異(參見圖5)。使用曱基化特異性PCR(MSP)時，可以在擴增之后通過測序、限制性酶切消化或在凝膠電泳之后通過凝膠上條帶的存在與否對DNA進行分析。可選地，可使用MSP和非特異性染料對DNA進行實時PCR分析。由于富含"A-T"的DNA親合力相對較低和辨別單個"C"和"T"核苷酸存在困難的性質，亞碌u酸氫鹽處理的DNA富含"A-T"的性質給擴增分析中的引物和探針帶來了特殊的難題。例如，檢測核酸序列突變的不同技術包括單鏈構象分析、變性梯度凝膠電泳、異源雙鏈體分析、化學錯配裂解和直接測序。Grompe(M.Grompe(1993)Ato紅eGe"幼cs，5:111-117)對這些技術進行了綜述。在這些眾多的:汰術中，也可以使用基于熒光的方法。實時聚合酶鏈式反應(RT-PCR)的發(fā)明以快速和準確的方式革新了確定基因狀態(tài)(如表達)(實時逆轉錄酶聚合酶鏈式反應)的方法，但是該技術也用于辨別相似的乾。盡管此技術已有許多進步，但仍未滿足改進這些技術的需要。當今使用最廣泛的一些探針包括分子(Molecular)信標、TaqMai^探針(TaqMan是RocheMolecularSystems,Inc的注冊商標)、蝎形(Scorpion)引物和雙雜交FRET探針(Arya等(2005)iev.Mo/.Z)zagn.5:209-219最近對此進行了綜述)。在不同的應用中，每種技術彼此都各有優(yōu)缺點。所有這些技術共同的缺點就是設計困難，通常需要計算機軟件或專家的輔助和較長時間的優(yōu)化才能工作(軟件的實例為程序，如美國AppliedBiosvtems(www.appliedbiosvstems.com)提供的PrimerExpress、PremierBiosoft(www.premierbiosoft.com)提供的BeaconDesigner和Primer3(版權所有(c)1996,1997,1998,1999,2000,2001，2004,WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch，j呆留所有4又利("http:〃frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi))。TaqMar^分析使用基于DNA的包含由熒光團和猝滅劑組成的信號對的探針。該方法優(yōu)選需要所述熒光團和所述猝滅劑位于探針的相反末端以實現(xiàn)可達到的最好信噪比。在PCR反應的擴增過程中，所述探針與其被擴增的耙序列特異性雜交。當?shù)竭_TaqMai^探針時，Taq聚合酶通過使用其外切核酸酶活性降解該探針，所述熒光團因此可以自由遠離猝滅劑，避免猝滅信號。通過所迷外切核酸酶活性產(chǎn)生的熒光與存在的乾序列的量相關。知道PCR反應的效率，即可使用所述焚光信號計算耙序列的起始量。已報道了對TaqMaif探針的一些改進，以優(yōu)化TaqMar^分析的特異性和靈敏度。這些改進包括引入小溝結合物和核苷酸類似物，如用于增加對靶序列的親合性和能夠使用較短的探針的鎖核酸(LoekedNucleicAcid)(參見詳細的說明和下文的參考文獻)。但是，在所有已報道的TaqMan⑧分析中，完整探針的熒光團的猝滅依賴于隨機巻曲螺旋(coilhelix)的形成。分子信標("發(fā)夾"或"莖環(huán)(stem-loop)"探針)包含兩個莖序列，探針的每個末端各有一個，如果沒有可用的耙序列與分隔所述兩個莖序列的序列(環(huán)序列)雜交互補，則它們將能形成雙鏈體。所述探針通常包含由連接至該探針相反末端的熒光團和猝滅劑組成的信號對。當形成莖時，熒光團和猝滅劑就會因此接近，從而猝滅信號。但是如果所述環(huán)序列與靶序列雜交，所述的兩個莖序列和所述熒光團和猝滅劑就會因此分開，允許產(chǎn)生和讀取信號。由于所述探針沒有或只有很小的背景信號，因此據(jù)稱分子信標可用于同質性分析和活細胞中的耙序列檢測。所述分子信標的莖序列與輩巴序列無關。適當?shù)那o形成和穩(wěn)定性依賴于莖的長度和G:C含量以及其溶于其中的緩沖液的條件。因為把序列的G:C含量、長度和可能存在的非耙序列的相似程度可能也會有所差異，環(huán)序列的長度和G:C含量將會隨探針不同而不同。因此有必要使用優(yōu)化的莖序列，所述莖序列依賴于環(huán)序列。此外，所述分子信標不僅將竟爭擴增子的重新退火，而且將竟爭所述探針的分子內退火。也已發(fā)表了一些關于無莖信標(線性信標)(包括基于DNA和PNA的無莖信標)的先前技術。DNA無莖信標(Myanard，US2005/0227247)被賦予了耐受5'至3'外切核酸酶活性消化和聚合酶3'延伸活性的能力。當探針未結合時，置于探針一端的熒光團^皮置于所述探針另一端的猝滅劑的猝滅，受隨機螺旋巻曲形成的控制。Maynard教導報道分子和猝滅劑分子優(yōu)選隔開18或20個堿基，以實現(xiàn)最佳的信噪比。該文件和其先前技術聲稱此比值強烈依賴于探針的長度。對核酸酶消化的抗性是這些無莖信標的固有屬性，所以這些探針不能用于核酸酶依賴性分析，如TaqMai^分析。Gildea等(WO1999/21881)介紹了基于PNA的包含信號對的線性信標，所述對的兩個部分位于探針的兩端。該發(fā)明和基于DNA的線性信標的發(fā)明的不同在于Gildea情形中的主鏈單體單元是PNA而不是DNA的主鏈單體單元。他們教導我們探針背景的降低是因為PNA的作用方式，并且相似長度和標記構型的核酸和PNA探針的結構和功能顯然不同。據(jù)說，該文件中描述的探針應不受下列因素中的兩個因素的影響探針長度、Mg^+濃度、緩沖液的離子強度以及熒光團和猝滅劑之間的光譜重疊，前三個因素一般僅在PNA和一些其它基于DNA類似物的探針中觀察到。該文件沒有描述包含插入探針中的疏水性分子的寡核苷酸類似物。該文件描述的探針也部分具有核酸酶消化抗性(PNA的固有屬性)，因此這些揮^十不能用于核酸酶依賴性分析，如TaqMan⑧分析。在先前技術中，已描述了包含信號對的核普酸和核苷酸類似物Kutyavin和同事將MGB分子接合至探針的3'-端，并將其用于5'-核酸酶PCR分析中(Kutyavin等(2000)Wwc/"ci^;s.28:655-661),同一實驗室還描述了一個叫做Eclipse的系統(tǒng)，其中MGB連接至探針的5'-端，并且不需要聚合酶的核酸酶活性Afonina，L等(1997)M/de/cjc/必i"25:2657-2660)。在這兩個系統(tǒng)中，多態(tài)性^tt(潛在的錯配點)應置于距MGB連接位點約5個核苷酸的地方，以產(chǎn)生匹配乾和錯配耙的最佳的辨別，這與普通的基于DNA的探針相反，先前的研究表明，如果多態(tài)性堿基被置于該類探針的中央，則其具有最高的熔解溫度差異以及最高的特異性。探針未結合時熒光的猝滅受限于隨機巻曲。設計選項受限制可能是一個不利條件，因為探針設計經(jīng)常必須具有高度的靈活性，以避免形成不需要的二級結構。Letertre等2003顯示，鎖核酸LNA可以用于5'-核酸酶PCR分析，其結果與使用MGBTaqMan⑧探針獲得的結果相當(Letertre，C.等(2003)Mo/.Ce〃戶roZ^17:307-311)。但是，難以設計最佳的包含LNA的探針有兩個原因第一，LNA核苷酸具有核酸酶抗性，而在5'-核酸酶分析中所述探針需要被降解，第二，LNA核苷酸具有極高的自親合性，因此如果不精心設計就將形成二級結構。先前已表明，僅具有少量LNA核苦酸的DNA-LNA雜種可以形成的二級結構如此穩(wěn)定，以至于所述探針無法與互補的單鏈DNA靶雜交(Filichev等(2004)C/iem6/oc/je附.5:1673-1679)。Seitz，O.(2000)4"g￡w.J加五d39:3249-3252)介紹了無莖肽核酸(PNA)信標。未結合靼核酸時，PNA信標趨向于折疊成致密的隨機巻曲螺旋，而這經(jīng)常是不合需要的。盡管基于PNA的技術相比基于DNA的技術在某些方面具有一些優(yōu)點，但是它們比基于DNA的技術更加昂貴，并且在合成和發(fā)現(xiàn)最佳條件方面比基于DNA的分析提出更多挑戰(zhàn)。因為PNA由蛋白質和寡核香酸組合構成，所以PNA的行為不總是易于預測。WO2004/033726介紹了在存在由連接了熒光團的探針和為雙鏈嵌入劑的自由浮動猝滅劑分子組成的熒光系統(tǒng)的條件下，測量擴增樣品中的熒光。WO1999/21881、US2002/0064772和EP1484337介紹了包含PNA和對離子強度、鎂濃度、熒光團和猝滅劑之間的光鐠重疊和探針長度不敏感的相關分子的線性信標。這些專利中沒有包括或討論包含疏水性分子的探針。US2005/0233360介紹了具有熒光團和靠近位于探針同一端的捽滅劑的探針。與互補核酸雜交后，所述熒光團或所述猝滅劑之一將與形成的雙鏈體(通過嵌入或小溝結合)相互作用，所述熒光團將能夠發(fā)熒光而不被猝滅。WO01/73118介紹了包含熒光團和任選地猝滅劑的探針。所述熒光團的行為的不同將取決于輩巴核酸中是否存在錯配，并借此辨別彼此。所述探針還可用于解鏈溫度點分析(meltingpointanalysis)。所述探針通常必須封閉3'-端以避免延伸。US2005/0227247介紹了熒光團位于一端而猝滅劑位于另一端的探針的使用，其中所述探針在3'末端的一個或多個硫代磷酸酯(phosphorthioate)插入物保護該探針不受5'至3'外切核酸酶的降解。熒光團會因隨機巻曲而發(fā)生猝滅。US2005/0227257介紹了探針雙鏈體的使用，其中一條鏈包含熒光團，而另一條鏈包含猝滅劑。一條鏈比另一條鏈長，并且如果探針對的兩條鏈彼此結合，則所迷猝滅劑和熒光團將靠近^:置。但是當存在完全互補的靶時，所述較長的探針將優(yōu)先與該靶結合，從而將所述熒光團與猝滅劑分隔開來，進而允許發(fā)熒光。探針的猝滅受探針系統(tǒng)兩個部分的雙螺旋形成的控制。US2005/0064463介紹了可任選地以熒光團和猝滅劑標記以及在探針末端包含小溝結合物(MGB)的探針。MGB增加了互補DNA的親合力，US1999/5925517和US2000/6103476介紹了稱作"分子信標"的發(fā)夾探針。所述探針包含各自位于寡核苷酸或寡核香酸類似物一端的熒光團和猝滅劑。所述寡核苷酸或寡核苷酸類似物劃分為不同的序列當所述探針未結合任何靶核酸時，序列l(wèi)和3構成發(fā)夾結構的莖，而序列2則與靶核酸互補。背景焚光依賴于序列1和3之間的雙螺旋形成。WO03/052132介紹了包含嵌入的假核苷酸以增加對乾核酸的親合力、增加核酸酶穩(wěn)定性的發(fā)夾探針(因為熒光標記物和/或降低自親合性)。該發(fā)明和說明書未討論本發(fā)明的"無莖信標"的積克念。該文件還介紹了使用互補探針檢測靶核酸，但是與本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)不同，其未介紹未結合探針的無莖猝滅。US2000/6037130介紹了具有較短波長收獲體和較長波長發(fā)射體和猝滅劑的三標記發(fā)夾揮:針。與標準的分子信標相比，存在的額外熒光團增加了熒光產(chǎn)生，并因而增加了信噪比。US2002/6355421介紹了發(fā)夾形PNA分子信標的方法、試劑盒和組合物。該文件未介紹無莖信標的概念。US2005/0158720介紹了三聯(lián)分子信標(TMB)，該信標包含三個寡核苷酸組件一個形成發(fā)夾結構，另外兩個則與形成的莖的兩側分別互補。本專利申請引用的所有專利和非專利參考文獻在此也整體結合入本文。
發(fā)明內容科學家長期以來一直希望能夠檢測、定量和鑒定核酸的靶序列。已開發(fā)了幾種用于該目的的技術，如"分子信標"("發(fā)夾探針")和"TaqMan"，但是所有現(xiàn)在可用的工具和技術都具有一些局限和缺點。分子信標是在實時PCR的退火溫度下，不但必須竟爭擴增子的重新退火，而且必須竟爭探針的分子內退火的發(fā)夾性探針。因此探針的優(yōu)化、嚴格條件和設計是必須的。但是與分子內莖形成的形成不同，TaqMan探針依賴于隨機巻曲的螺旋結構來猝滅未結合探針的熒光以及依賴于聚合酶的核酸酶活性來"激活"熒光團。異乎尋常的是，本發(fā)明公開了共價插入寡核苷酸或寡核苷酸類似物的疏水性分子促進了未結合寡核苦酸的折疊，并且同時所述疏水性分子不會阻止與靶序列(如果存在)的雜交。本發(fā)明首次提出的探針結合了疏水性分子屏蔽或減少疏水性表面與水溶液接觸(通過與其它疏水性分子相互作用)的趨勢和兩部分信號對之間增加的相互作用(寡核苷酸類似物的每半邊各有一部分)(參見圖1)。因此，本發(fā)明提到的未結合探針信號對之間的相互作用不單是因為隨機螺旋巻曲，而且另一方面不需要分子內設計莖結構以影響未結合探針的猝滅。與先前公開的"分子信標"相似的是，本發(fā)明所述探針具有很好的信噪比。所以根據(jù)本發(fā)明的探針在此也叫做"無莖信標"。本發(fā)明所述無莖信標一般短于其相應的分子信標，原因是它們一般不包含互補區(qū)(即無"莖")。它們更易于設計和優(yōu)化，并且疏水性基團的存在可以進一步簡化所述探針的純化。如上所述，它不需要:&計分子內自退火延伸區(qū)，其退火溫度必須高于讀數(shù)溫度并低于其竟爭結合靶核酸的溫度。本發(fā)明所述的無莖信標比其相應的沒有插入疏水性分子的線性探針具有更好的信噪比，并可用于核酸酴農(nóng)賴性以及核酸酶非依賴性分析。分子探針的主要挑戰(zhàn)之一就是如何能夠辨別差異小至一個核苷酸的非常相似的靶。一般而言，探針越短，一個錯配對親合性的影響越大，因此就越容易辨別完全互補乾和錯配的乾。本發(fā)明介紹了易于設計和具有低背景熒光的一種新型分子探針。所述探針由核苷酸和/或核苷酸類似物、信號對(例如熒光團和猝滅劑)和至少一個額外的疏水性部分組成，該疏水性部分將有助于實現(xiàn)比不包含所迷疏水性分子的所述核苦酸或核苷酸類似物更好的信噪比。本文所述探針可用于許多不同的應用，包括診斷乾核酸(如特殊等位基因、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、突變和甲基化狀態(tài)(表觀遺傳信息))的表達、存在。因此，本發(fā)明的第一個目標是提供包含信號對和至少一個疏水性分子，優(yōu)選地為下文所迷疏水性核苷酸的寡核苷酸類似物，其中所述寡核苷酸類似物的信噪比顯著高于或低于(與值1不同)相應的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的信噪比。因此，本發(fā)明的目標是提供包含信號對和至少一個疏水性核苷酸的寡核苷酸類似物，其中所述疏水性核苦酸具有通用結構X誦Y-Q其中X是核苷酸或核苷酸類似物或能夠摻入核酸或核酸類似物主鏈的主鏈單體單元，Q是本發(fā)明所述疏水性分子，并且不參與特異性氫鍵合，也不是信號對的部分；和子的連接體部分其中，當所述寡核香酸類似物由未與靶核酸雜交變?yōu)榕c耙核酸雜交或相反時，所述寡核苷酸類似物的信噪比顯著好于相應的不包含所述疏水性分子、由與所述寡核苷酸類似物相同的核香酸序列組成的寡核苷酸或寡核苷酸類似物和所述耙核酸的雜種(相應的雜種)的信噪比。更具體地說，本發(fā)明的目標是提供包含n個核苷酸和/或核苷酸類似物的連續(xù)序列和至少一個疏水性核普酸的寡核脊酸類似物，其中所迷寡核香酸類似物共價連接至信號對，其中所述疏水性核香酸具有通用結構X國Y-Q其中X是核苷酸或核普酸類似物或能夠摻入核酸或核酸類似物主鏈的主鏈單體單元，Q是不參與沃森-克里克(Watson-Crick)氬鍵合的疏水性分子；和Y是連接所述核普酸或核普酸類似物或主鏈單體單元和所述疏水性分子的連接體部分；和其中n是至少為4的整數(shù)；和其中所述至少一個疏水性核苷酸被置于距一端最多9個核苷酸和/或核普酸類似物的位置；和其中所述信號對由兩部分系統(tǒng)組成，其中一個部分^:置于距5'端6個核苷酸和/或核苷酸類似物以內的位置，而另一個部分^L置于距3'端6個核苷酸或核苷酸類似物以內的位置；其中所述信號對的所述部分與所述疏水性核苷酸不同，條件是當所述信號對的一個部分作為懸掛端被置于5'端時，則5'端的第一個核苷酸或核苷酸類似物不是疏水性核苦酸；當所述信號對的一個部分作為懸掛端^皮置于3'端時，則3'端的第一個核苷酸或核苷酸類似物不是疏水性核苦酸。應注意的是，雖然一些疏水性分子單獨或作為對的一部分可產(chǎn)生可檢測的信號，但是上述疏水性分子并不凈皮認為是所述信號對的部分。因此，所述寡核苷酸類似物包含疏水性核苷酸和信號對的兩個部分。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)具有增強的核酸酶穩(wěn)定性的寡核普酸類似物可以用于在例如擴增反應之后確定終點，所述核酸酶包括包含外切核酸酶活性的聚合酶。因此本發(fā)明的第二個目標是提供使用具有增強的外切-和/或內切-核酸酶穩(wěn)定性的寡核苷酸類似物(例如本發(fā)明所述的任何寡核苷酸類似物)的方法和可以用于檢測和/或鑒定大量不同的扭序列的標準條件。這些方法還可用作優(yōu)化特異性分析的條件的快速方法。因此，本發(fā)明的目標是提供檢測本發(fā)明所述寡核苷酸類似物和核酸混合物中的乾序列之間的雜交的方法，所述方法包含如下步驟1)提供可能包含耙序列的核酸混合物；和2)提供本發(fā)明所述寡核苷酸類似物；和3)將所述核酸和所述寡核苷酸類似物在允許雜交的條件下孵育；和4)檢測雜交。提供在擴增過程中檢測、鑒定和/或定量本發(fā)明所述寡核苷酸類似物和沖莫豐反中的乾序列之間的雜交的方法也是本發(fā)明的目標。a)提供適合用于檢測、鑒定和/或定量乾序列和/或突變體序列的核酸混合物；和b)提供包含擴增酶的擴增緩沖液、引物組和本發(fā)明所述寡核苷酸類似物，其中所述引物和所述寡核苷酸類似物能夠與所述靶序列和/或突變體序列雜交，所述擴增酶能夠以模板指導方式延伸引物，而所述擴增緩沖液包括擴增酶執(zhí)行此延伸所必需的物質(引物和才莫板除外)；和c)將引物和寡核脊酸類似物與核酸混合物在允許所述引物發(fā)生雜交的條件下孵育；和d)使用雜交的序列通過所述擴增酶和核苷酸、核苷酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物進行所述引物3'端的才莫板延伸；和e)將核酸、延伸產(chǎn)物和寡核普酸類似物在允許雜交的條件下孵育；和f)檢測雜交；和任選地重復步驟c)至f)。本發(fā)明進一步的目標是提供檢測或鑒定耙和/或突變體序列以及快速確定同質性分析的最佳讀數(shù)溫度范圍的通用方法，其中所述方法包含上文所述的檢測雜交的方法，其中將下列步驟添加至最后一步之后5)將所述混合物變性，然后快速冷卻至設定溫度(起點高于親合溫度)；和6)測量信號對的信號；和7)通過重復步驟1)至3)確定包含信號對的所述核酸類似物的親合力，同時逐漸降低步驟l)中的溫度，直至該溫度降低至低于親合溫度。提供包含下列步驟的確定雜交的方法也是本發(fā)明的目標a)提供包含n個核苷酸和/或核苷酸類似物的連續(xù)序列和至少一個疏水性核苷酸的寡核苷酸類似物，其中所述寡核苷酸類似物共價連接24至由兩部分系統(tǒng)組成的信號對，其中所述疏水性核苷酸具有通用結構X誦Y國Q其中X是核苷酸或核普酸類似物或能夠摻入核酸或核酸類似物主鏈的主鏈單體單元，Q是不參與特異性沃森-克里克氬鍵合的疏水性分子；和Y是連接所述核苷酸或核苷酸類似物或主鏈單體單元和所述疏水性分子的連接體部分；和其中n是至少為6的整數(shù)；和其中所述信號對的兩個部分的距離在所述寡核苷酸類似物未與靶序列雜交時比所述寡核苷酸類似物與靶序列雜交時更近；和b)提供可能包含所述寡核苷酸類似物的靶序列的核酸混合物；和c)將所述核酸和所述寡核苷酸類似物在允許雜交的條件下孵育；和d)通過確定所述信號對的所述部分是否靠近而檢測雜交；e)進而確定雜交。本發(fā)明進一步的目標是提供檢測、鑒定或定量和快速確定擴增反應的最佳讀數(shù)溫度范圍的通用方法，其中所述方法包含如下步驟1)提供適合用于檢測、鑒定和/或定量把序列和/或突變體序列的核酸混合物；和2)提供引物組、擴增緩沖液(包含擴增酶)和寡核苷酸或寡核苷酸類似物，其中所述寡核苷酸或寡核香酸類似物具有核酸酶抗性和/或所述擴增酶不包含任何核酸酶活性；和3)將所述引物和寡核苷酸或寡核苷酸類似物與所述核酸混合物在允許雜交的條件下孵育；和4)檢測雜交；和255)測量信號強度時按照一定的幅度逐漸增加溫度，直至達到所需的延伸溫度，和6)完成延伸反應，將形成的擴增子變性，然后重復步驟c)至f),直至發(fā)生所需的擴增。提供擴增乾序列的方法也是本發(fā)明的目標，所迷方法包含如下步驟1)提供任選地包含所述耙序列的核酸混合物；和2)提供引物組、擴增緩沖液(包含擴增酶)和寡核苷酸或寡核苷酸類似物，其中所述引物和所述寡核苷酸或寡核苷酸類似物能夠與所述靶序列或其互補序列雜交，條件是當所述擴增酶包含核酸酶活性時，所述寡核苷酸或寡核苷酸(oligonucletide)類似物具有核酸酶抗性；和3)將所述引物和寡核苷酸或寡核苷酸類似物與所迷核酸混合物在允許雜交的條件下孵育；和4)檢測雜交；和5)檢測雜交時按照一定的幅度逐漸增加溫度直至達到所需的延伸溫度，和6)完成延伸反應，將形成的擴增子變性，然后重復步驟3)至6)，直至發(fā)生所需的擴增。此外，還公開了如何使用至少兩個本發(fā)明所述無莖信標表征單核苷酸多態(tài)性和辨別其它非常相似的核酸。因此本發(fā)明的第三個目標是向核酸混合物提供至少兩個無莖信標，其中所迷無莖信標用與每個預期可能的基因型分別同源互補的不同信號對進行標記。本發(fā)明的第四個目標是提供包含無莖信標的試劑盒。圖1A)當不存在互補靶時，無莖信標的疏水性分子會彼此相互作用，使熒光團(圓點)和猝滅劑(黑色方塊)靠近。因此熒光團^皮猝滅。B)如果加入或形成了互補靶，例如在擴增反應過程中，無莖信標將會展開并與該靶結合。c)當無莖信標與其互補靶結合時，熒光團和猝滅劑將不再靠近，因此熒光團將會發(fā)熒光。圖2無莖DNA(TaqMan樣)序列(填充標志物，F(xiàn)AM-AAAAATCCCGCGAACTCC-BHQ1)[SEQIDNO:l]和可比較的具有4個包含疏水性分子的假核苷酸(用2表示，3-(3,4-二羥基丁基)-7,9-二甲基吡啶并[3',2':4，5]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4卿國酮)的磷酸二酯(phosphordiester)的插入物，包含下文的疏水基團XXVI)插入的無莖信標(中空標志物，F(xiàn)AM-A2AAA2ATCCCG2CGA2ACT-BHQ1)[SEQIDNO:2]分別與其匹配(菱形，GCGGGAGTTCGCGGGATTTTTTAG、[SEQIDNO:39]和錯配(方塊，GTGGGAGTTTGTGGGATTTTTTAG)[SEQIDNO:40]的DNA靶雜交的解離曲線。顯然，無莖信標SB的背景熒光大大低于DNA探針的背景熒光。如果僅DNA或SB和DNA探針二者均與靶寡核苷酸雜交，則該區(qū)域分別加芏或^下劃線。雜交區(qū)域中的錯配用灰色突出顯示。標簽"2"指插入的假核苦酸(3-(l-0-(4,4'-二曱氧三苯基曱基(dimethoxytriphenylmetyl))-2-0-(2-氰乙基二異丙基酰氨亞磷酸鹽)-l,2-丁二醇)-4-N-(7,9-二甲基-3H-吡啶并[3',2':4，5]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-酮)的亞磷酰胺)包含下文所述的編號為XXVI的嵌入疏水性基團。圖3無莖信標(SB，中空標志物，F(xiàn)AM-T2AGG2GCGT2TTTT2T-BHQ1)[SEQIDNO:3]和無莖DNA(TaqMan⑧樣探針)(實心標志物，F(xiàn)AM畫ATTTTAGGGCGTTTTTTTG誦BHQ1)[SEQIDNO:4]與其匹配的華巴(菱形，CCGCAAAAAAACGCCCTAAAATCCC、[SEQIDNO:5]和錯配的乾(方塊，CCGCAAAAAAACACCCTAAAATCCC、[SEQIDNO:6]退火的解離曲線的負導函數(shù)的比較。雖然所述DNA中還有6個互補核tt，但是SB以相同強度與其互補靶結合，只是結合更加特異。SB分別在63.7。C和49.9X:下與其匹配和錯配的靶雜交，存在13.8。C的差異，而所述DNA分別在64.9'C和57.rC下與其匹配和錯配的乾雜交，僅存在7.8。C的差異。如果僅DNA或SB和DNA探針二者均與靶寡核苷酸雜交，則該區(qū)域分別加l或^下劃線。雜交區(qū)域中的錯配用灰色突出顯示。SB的信號更高，這是因為它們的背景熒光較低。標簽"2"指插入的假核苷酸(3-(l-0-(4,4'-二甲氧三苯基甲基(dimethoxytriphenylmetyl))-2-0-(2-氰乙基二異丙基酰氨亞磷酸鹽)-l,2-丁二醇)-4-N-(7,9-二曱基-3H-吡啶并[3',2':4,5]噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮)的亞磷酰胺)包含下文所述的編號為XXVI的嵌入疏水性基團。圖4A)不存在或存在較少的互補DNA靶時部分互補的無莖信標SB。兩個探針彼此結合和/或自身進行折疊，從而猝滅焚光。曱基化檢測點(多態(tài)性位點)和探針之間的錯配用淺灰色條突出顯示。B)如果加入或者在擴增步驟中形成互補的DNA靶，SB將優(yōu)先結合DNA靶，而不是與另一SB結合。C)結果是與靶互補的SB現(xiàn)在能夠發(fā)熒光，因此可以被檢測，而另一SB自身進行折疊，并猝滅自身的熒光。圖5此圖說明亞硫酸氬鹽處理基因組DNA將所有未甲基化的脫氧胞嘧啶(dC)轉化為脫氧尿嘧啶(dU)，而將甲基化的dC保持不變。A)亞硫酸氫鈉與dC的化學反應，B)基因組DNA,C)亞硫酸氫鹽處理的未甲基化的DNA和D)亞硫酸氬鹽處理的具有一個甲基化的CpG對的DNA。中部的粗條突出顯示CpG對，而所有其它條突出顯示基因組DNA中dC的位置和變成dU。圖6測量熒光時在每個階段逐漸增加溫度的擴增設置文件。首先按照制造商的建議活化DNA聚合酶。然后執(zhí)行45個擴增循環(huán)。所述循環(huán)包含退火和首次測量(例如50°C)，之后逐漸增加溫度，例如按2度的幅度，測量每個階段的熒光。重復此操作直至達到正常的延伸溫度，例如72。C。每個測量階段的持續(xù)時間應盡可能的短。里面寫有"結束"而邊界處寫有"1"的放大鏡說明在該階段的末尾處測量了一(l)次焚光。圖7擴增設置文件使用終點親合讀數(shù)。首先根據(jù)制造商的說明活化DNA聚合酶。然后使用最佳退火溫度(例如50。C)和任選地額外的讀數(shù)溫度(例如55。C和6(TC)擴增DNA區(qū)域。重復此操作直至發(fā)生滿意的擴增。擴增之后，執(zhí)行終點親合測量，可選地可對兩條鏈進行變性(在高至95。C的溫度下)，然后逐漸降低每次冷卻的溫度(例如每個步驟rc)，進行冷卻(例如在第一步中至72°C)。每次將混合物冷卻至給定步驟的選擇溫度時都測量信號，然后將信號保持一小段時間讓探針與它的扭退火。重復此操作直20078至達到需要的溫度，至少達到兩個探針都與它們的互補靶結合的水平(例如45°C)。里面寫有"結束，，而邊界處寫有'T，的放大鏡說明在該階段的末尾處測量了一Ci;)次熒光。圖8此圖說明了如何使用圖6所示方案區(qū)分完全互補(曱基化的DNA)和錯配的靶(未甲基化的DNA)的熒光。在45t:至59。C時，甲基化的探針(FAM-A2AAA2ATCCCG2CGA2ACT-BHQ1)[SEQIDNO:7]也會少量結合錯配的靶，但是在6rc和高至7rc時，探針特異性結合完全互補靶。則在以后的測量中，可以對此探針使用6rc的讀數(shù)點。多態(tài)性位點用灰色突出顯示。標簽"2"指插入的假核苷酸(3-(l-0-(4,4'-二甲氧三笨基甲基(dimethoxytriphenylmetyl))-2-0-(2-氰乙基二異丙基酰氨亞磷酸鹽)-1,2-丁二醇)-4-N-(7,9-二甲基-3H-吡啶并[3',2':4,5]噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-S同)的亞磷酰胺)包含下文所述的編號為XXVI的嵌入疏水性基團。圖9顯示使用圖7所示方案和FAM-標記(FAM-TT1GAATCG1GTTT1T-BHQ1)[SEQIDNO:8]或HEX-標記探針完全互補(在此實例中為甲基化的DNA)和錯配的非靶(在此實例中為未曱基化的DNA)的熒光信號的實例。兩種探針均在45。C和50。C之間特異性退火。在以后的測量中，可能需要對兩種探針使用46。C的讀數(shù)點。從不同的設置文件中清楚可見，使用所述方案區(qū)分兩個相關的靶(在此實例中為甲基化的與未曱基化的DNA)非常簡單。每個探針中的多態(tài)性位點用灰色突出顯示。標簽"1"指插入的假核苷酸((S)-l-(4，4'-二曱氧三苯基曱氧基(dimethoxytriphenylmetyloxy))-3-花甲氧基&}^1161116111)40乂>0-2-丙醇的亞石辟酰胺)包含疏水性嵌入分子芘。圖10，上圖顯示實施例8所述的實驗中使用的PCR循環(huán)設置文件。中圖和下圖顯示熒光原始數(shù)據(jù)，并且下圖顯示按實施例8所述方法獲得的定量數(shù)據(jù)。圖ll，上圖顯示按實施例9所述方法獲得的結果。下圖顯示測量設置文件。圖12顯示按實施例9所述方法獲得的結果。29圖13顯示按實施例IO所述方法獲得的結果。曲線顯示使用下列探針的結果4針—0U針—02—探針—05~#:針_06~#:針—07~^笨針—ref圖14A和B說明了實時PCR設置文件，它們可以用于本發(fā)明所述方法。具體實施例方式核酸術語"核酸"涵蓋天然存在的核酸(DNA和RNA)，包括天然存在的DNA和RNA衍生物，如但不限于曱基化的DNA、含有DNA的加合物和共價結合至蛋白質的RNA。術語"核酸類似物"涵蓋天然存在的核酸(DNA和RNA)的合成衍生物和類似物。合成的類似物包含一個或多個核苷酸類似物。術語"核普酸"一般指天然存在的核普酸，例如天然存在的核糖核苷酸或脫氧核糖核普酸，或核糖核香酸或脫氧核糖核苷酸的天然存在的衍生物。術語"核苷酸類似物"包含所有能夠被摻入核酸主鏈和能夠進行特異性威基配對(參見下文)、與天然存在的核苷酸基本相像的核苷酸類似物。術語"疏水性核苷酸"指下文將詳細描述的疏水性核苷酸。疏水性核苷酸一般不是天然存在的。術語"寡核苷酸"指核苷酸的寡聚體。術語"寡核苷酸類似物"指包含至少一個疏水性核苷酸和/或核苷酸類似物和/或假核苷酸，和任選地天然存在的核苷酸的寡核苷酸。因此術語"核酸"或"核酸類似物"指基本上由多個核苷酸和/或核苷酸類似物和/或疏水性核香酸組成的任何分子。疏水性核苷酸將在下文進行詳細描述。本發(fā)明所述核酸或核酸類似物可包含具有不同的主鏈單體單元的差別更大的核普酸和核脊酸類似物(參見下文)。優(yōu)選地，本發(fā)明所述核酸或核酸類似物的單鏈能夠與大致互補的單鏈的核酸和/或核酸類似物雜交形成雙鏈的核酸或核酸類似物。更優(yōu)選地，此雙鏈的類似物能夠形成雙螺旋。優(yōu)選地，所述雙螺旋的形成是因為氫鍵合，更優(yōu)選地，所述雙螺旋是選自由A型、B型、Z型及其中間構型雙螺旋組成的組的雙螺旋。因此，本發(fā)明所述核酸和核酸類似物包括但不限于選自以下的核酸和/或核酸類似物類型PNA、HNA、畫A、ANA、LNA、INA、CNA、CeNA、TNA、(2'誦NH)畫TNA、(3'-NH)-TNA、a誦L誦核糖-LNA、a-L-木糖匪LNA、卩-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、雙環(huán)-DNA、6-^^-雙環(huán)-DNA、5國表-雙環(huán)-DNA、a-雙環(huán)-DNA、三環(huán)-DNA、雙環(huán)[4.3.0]-DNA、雙環(huán)[3.2.1]-DNA、雙環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA、P-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃來蘇糖基誦NA、2'國R廣RNA、2'-0R廣RNA(R！為取代基)、a畫L-RNA、a畫D畫RNA、P-D-RNA和其混和物和其雜種，以及其磷原子修飾(如但不限于硫代磷酸酯、曱基磷酸化物、亞磷酰胺(phosphoramidiate)、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、磷酸三酯和硼代磷酸酯)。此外，不含磷的化合物也可用于與核苷酸連接，如但不限于甲亞氨基甲基、乙酸甲酯(formacetate)、硫代乙酸甲酯(thioformacetate)和包含酰胺的連接基團。特別是核酸和核酸類似物可包含一個或多個本發(fā)明所述疏水性核苦酸。在本文中，"混合物"意在涵蓋包含不同類型核苷酸或核普酸類似物的核酸或核酸類似物鏈。此外，在本文中，"雜種，，意在涵蓋包含以下的核酸或核酸類似物一條鏈包含具有一個或多個主鏈類型的核苷酸或核脊酸類似物，而另一條鏈包含具有不同主鏈類型的核苷酸或核苷酸類似物。術語"雙鏈體"意指核酸和/或核酸類似物的兩條鏈的雜交產(chǎn)物，其中所述鏈優(yōu)選為相同類型的核酸和/或核酸類似物。HNA意指，例如如VanAetschot等，1995所述的核酸。MNA意指如Hossain等，1998所述的核酸。ANA指如Allert等，1999所述的核酸。LNA可是如WO99/14226(Exiqon)所述的任何LNA分子，優(yōu)選地，LNA是逸自WO99/14226的摘要中描述的分子。更優(yōu)選地，LNA是如Singh等(1998)、Koshkin等(1998)或Obika等(1997)所述的核酸。PNA指例如如Nielsen等，1991所述的肽核酸。INA指如專利WO03/051901所述的包含嵌入劑假核普酸的核酸。術語"核苷酸"指核酸或核酸類似物的構建組塊(buildingblock)，術語核普酸涵蓋天然存在的核普酸和其衍生物以及能夠與天然存在的核苦酸和其衍生物執(zhí)行基本上相同的功能的核苷酸。但是一般而言和更優(yōu)選地，如本文所用，術語"核苷酸"僅指天然存在的核苷酸和其天然存在的衍生物。天然存在的核苷酸包含包含四種核堿基腺"票呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)或胞嘧啶(C)之一的脫氧核糖核苷酸和包含四種核堿基腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)、鳥噪呤(G)或胞嘧啶(C)之一的核糖核苷酸。核苷酸類似物可是能夠摻入核酸主鏈和能夠進行特異性堿基配對的任何核香酸樣分子。本發(fā)明所述的非天然存在的核苷酸(核苷酸類似物)包括但不限于選自以下的核苷酸PNA、HNA、MNA、ANA、LNA、INA、CNA、CeNA、TNA、(2'-NH)-TNA、(3'-NH)-TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、p-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、雙環(huán)-DNA、6-tt-雙環(huán)-DNA、5-表-雙環(huán)-DNA、a-雙環(huán)-DNA、三環(huán)-DNA、雙環(huán)[4.3.0]-DNA、雙環(huán)[3.2.1]-DNA、雙環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA、P-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃來蘇糖基-NA、2'-R廣RNA、2'-OR廣RNA(R！為取代基)、a-L-RNA、a-D-RNA、P-D福A。本發(fā)明所述核苷酸和核苷酸類似物的功能是能夠通過互補核苷酸的核堿基的氬鍵合與所述互補核香酸發(fā)生特異性相互作用以及能夠被摻入核酸或核酸類似物。天然存在的核苷酸以及一些核苷酸類似物能夠通過酶學方法摻入核酸或核酸類似物，例如通過RNA或DNA聚合酶，但是核苦酸或核苷酸類似物也可通過化學方法摻入核酸或核酸類似物。此外，核酸或核酸類似物可通過將兩個較小的核酸或核酸類似物偶聯(lián)至另一個核酸或核酸類似物進行制備，例如這可通過連接酶用酶學方法完成，或可用化學方法完成。核苷酸或核苷酸類似物包含主鏈單體單元和核堿基。所述核堿基可是天然存在的核堿基或其衍生物或其能夠執(zhí)行基本相同功能的類似物。核堿基的功能是能夠通過氫鍵與一個或多個其它堿基特異性締合。因此核tt的重要特征就是其僅可與一個或少量其它核堿基形成穩(wěn)定的氫鍵，但是其不能與大多數(shù)其它核堿基(通常包括其自身)形成穩(wěn)定的氬鍵。一個核堿基與其它核威基的特異性相互作用通常稱為"堿基配對"。堿基配對造成互補核脊酸之間的特異性雜交。本發(fā)明所述互補核苷酸是包含能夠進行堿基配對的核堿基的核普酸。天然存在的核苷酸的核tt(nucleotbase)之間的堿基配對在此也稱作沃森-克里克氫鍵合。在DNA中，沃森-克里克氫鍵合包括腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶m形成堿基對，以及鳥噤呤(G)與胞嘧啶(C)形成堿基對。在RNA中，胸腺嘧咬被替換為尿嘧啶gj)。因此，在天然存在的核堿基中，腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)配對；而鳥噪呤(G)與胞嘧咬(C)配對。因此，例如，包含A的核苷酸與包含T或U的核苷酸互補，包含G的核苷酸與包含C的核苷酸互補。本發(fā)明所述核苷酸可進一步進行衍生以包含附加的分子實體。核苷酸可以在核堿基或主鏈單體單元上進行衍生。堿基上的優(yōu)選衍生位點包括腺嘌呤的8-位、尿嘧啶的5-位、胞嘧啶5-或6-位和鳥噪呤的7-位。雜環(huán)修飾可以歸為三個結構類別增強堿基堆疊、增加氫鍵合和它們的組合。通過擴大平面系統(tǒng)的兀-電子云增強威基堆疊的修飾的代表為在嘧咬的5-位和7-去氮-嘌呤的7-位進行接合、親脂<務飾。嘧啶的5-位取代修飾包括丙炔、己炔、噻唑和僅曱基；7-去氮噪呤的7-位取代基包括碘、丙炔基和氰基。也可以將胞嘧啶的5-位從丙炔修飾為五元雜環(huán)和修飾為三環(huán)稠環(huán)系統(tǒng)(從4-和5-位(胞嘧吱鉗)發(fā)散)。另一種類型的雜環(huán)修飾的代表為2-M-腺嘌呤，其中附加的氨基在A-T堿基對中提供了另一個氬鍵，類似于G-Ctt對的三個氬鍵。提供組合效應的雜環(huán)修飾的代表為2-M-7-去氮-7-修飾的腺嘌呤和異源雙鏈體的具有乙氧氨基官能團的三環(huán)胞嘧啶類似物。此外，N2-修飾的2-氨基腺噤呤修飾的寡核苷酸是常用的修飾。核糖或脫氧核糖部分的優(yōu)選衍生位點是非連接性碳位置C-2'和C-4'的修飾、連接性碳C-l'、C-3'和C-5'的修飾、糖氧0-4'的替換、脫水糖修飾(構象受限)、環(huán)糖修飾(構象受限)、核糖呋喃環(huán)大小的變化、糖與糖的連接位點(C-3'與C-5'/C-2'與c-5')、雜原子環(huán)修飾的糖和上述修飾的組合。但是，其它位點也可進行矛;亍生，只要核酸或核酸類似物整體的堿基配對特異性不受千擾。最后，當主鏈單體單元包含碌酸基團時，一些主鏈單體單元的磷酸可進行衍生。假核苷酸是能夠被插入核酸或核酸類似物，但不包含核堿基的核苷酸類似物。^R核香酸可是連接至其自身主鏈單體單元的疏水性分子，例如本發(fā)明所述疏水性核苷酸。假核普酸通常^又通過化學方法插入，而很少-故天然酶識別。如本文所用，寡核芬酸或寡核苷酸類似物是基本上由核苷酸和/或核苷酸類似物和/或假核苷酸序列組成的分子。優(yōu)選地，寡核苷酸或寡核苷酸類似物包含3-200、5-100、6-30個核苷酸和/或核苷酸類似物和/或布￡核苷酸和/或疏水性核苷酸個體，如上所述。靼核酸靶核酸或靶核酸類似物指包含一個或多個寡核香酸和/或寡核苷酸類似物(例如引物或探針)的一個或多個雜交位點/序列的核苷酸或核苦酸類似物序列。靶序列可發(fā)現(xiàn)于任何核酸或核酸類似物，包括但不限于，RNA、基因組DNA、質粒DNA、cDNA、線粒體DNA、亞硫酸氬鹽處理的DNA，并可例如包含野生型或突變體基因序列(如其編碼序列或調控序列)，或擴增的核酸序列(例如通過PCR進行擴增時)，或修飾的DNA(例如使用可以改變DNA的化學組成的化學劑，如DNA的亞^Tu酸氬鹽處理)。靶序列可是任何長度。所指的位點可以是或不是一個連續(xù)的序列。例如所述位點可由被任何數(shù)量的核苷酸和/或核苷酸類似物隔開的兩個或多個連續(xù)的子序列構成。但是，優(yōu)選地，所述乾序列是連續(xù)的。優(yōu)選地，所指的位點的總長度，由該特定的靶核酸或把核酸類似物上所有的子序列構成，由所述寡核苷酸和/或寡核苷酸類似物構成，通常小于100個核苷酸和/或核普酸類似物。包含至少一個信號對和至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的核苷酸類似物不被視作靶核酸。突變體序列34本發(fā)明所述術語"突變體序列"涵蓋與特異性靶序列存在至少一個，》口1，侈'J:i口2，》口3，侈'J》口4，如5，合Ji口6，》口7，侈'J:i口8，^口9，i"列》口10，如10至20，例如20至50,如多于50個核堿基差異的序列。例如本發(fā)明所述突變體序列可包含一個或多個突變。術語"突變"涵蓋與特異性乾序列相比，一個或多個核苷酸變?yōu)榱硪粋€或多個其它核香酸的變化。此外，術語"突變"涵蓋在核酸內缺失和添加核苷酸，例如與耙序列相比缺失或添加核香酸。另外，它還涵蓋曱基化模式的變化。靶序列可包含多態(tài)性位點(詳情參見下文)，因此靶序列可包含一個多態(tài)性，而"突變體序列"可包含另一個多態(tài)性。在一個實施方案中，所述靼序列是野生型序列，即最常見的天然存在的序列，而所述突變體序列與所述野生型序列相比包含一個或多個突變。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明所述突變可以是多態(tài)性，如單核苷酸多態(tài)性(SNP)。例如所述多態(tài)性可指示特異性DNA圖譜。例如，特異性DNA圖譜的信息可被用于鑒定個體。例如特異性DNA圖語可被用于鑒定罪犯或犯罪嫌疑人或鑒定尸體或尸體殘骸。在另一個實施方案中，突變涉及核苷酸的甲基化或去甲基化。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明所述突變可處于核苷酸的甲基化狀態(tài)，如CpG對的曱基化。例如甲基化可指示特異性DNA圖語，而該圖鐠的信息可指示疾病狀態(tài)。甲基化狀態(tài)的檢測通常在將非曱基化的CpG轉化為dUpG對(通過使用化學劑例如亞硫酸氬鈉處理)之后進行。此外，特異性DNA圖諳可被用于確定個體之間的關系，例如親子關系或更遠的關系。關系也可是不同的物種或給定物種不同的群體之間的關系。在一個實施方案中，突變可指示臨床疾病或突變可指示增強的臨床疾病風險。所述臨床疾病可例如選自由腫瘤性疾病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病和代謝紊亂(包括糖尿病)組成的組。此外，突變可指示預定的藥物處理的特異性響應。例如突變可指示個體是否對所述藥物處理有正響應或個體能否耐受特異性藥物處理。多態(tài)性4立點在本發(fā)明中，術語"多態(tài)性位點"涵蓋核酸中人們感興趣的特異性位置。例如，多態(tài)性位點可以是已知多態(tài)性的特異性位置，如其核苷酸性質對研究人員重要的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。它也可以是核酸中由于其它原因對研究人員重要的特異性位置。因此多態(tài)性位點是使用者在試圖區(qū)分兩個或多個可能的靶時，通過使用本發(fā)明所述無莖信標從其獲得信息的位置。多態(tài)性位點可以是核苦酸、核苷酸類似物、核酸或核酸類似物中人們感興趣的任何位點。因此，本發(fā)明所述多態(tài)性位點是在所述位點內的一個或多個位置可包含多個不同的核苷酸之一和人們對確定所述位點內包含哪個(些)核苷酸感興趣的位點。多態(tài)性位點可包含多于一個或多個核苷^/核苷酸類似物，如至少2，例如在2至10范圍內，如在2至5范圍內。優(yōu)選地，多態(tài)性位點包含一個核苷酸。因此，舉例來說，如果人們對確定給定輩巴序列內的特異性位置是A或G感興趣，那么該特異性位點即被稱為本發(fā)明所述"多態(tài)性位點"。技術人員將很容易能夠鑒定多態(tài)性位點。樣品材料描述區(qū)分包含特異性靶序列的核酸或核酸類似物和包含突變體序列的核酸的列。所述混合物可包含于細胞內，例如完整細胞內。例如，所述細胞可是原核細胞或真核細胞，如植物細胞或哺乳動物細胞。在此實施方案中，所述方法可用于進行原位雜交。36例如，所述混合物可是供試核酸或核酸類似物樣品。例如，所述樣品可是合成制備的樣品(可在體外已經(jīng)過或未經(jīng)過進一步加工)。所述供試核酸或核酸類似物樣品可包含任何核酸或核酸類似物，例如DNA、RNA、PNA、HNA、麗A、ANA、LNA、CNA、CeNA、TNA、(2'陽NH)陽TNA、(3'-NH)-TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、P-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、雙環(huán)-DNA、6-氨基-雙環(huán)-DNA、5-表-雙環(huán)-DNA、a誦雙環(huán)-DNA、三環(huán)-DNA、雙環(huán)[4.3.0]-DNA、雙環(huán)[3.2.1]-DNA、雙環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA、卩-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃來蘇糖基-NA、2'-R-RNA、2'-0R-RNA、a-L-RNA、a-D-RNA、(3-D-RNA和其混合物和其雜種。人們經(jīng)常需要測試個體，如哺乳動物，例如人類的DNA或RNA。在這種情況下，所述供試核酸或核酸類似物樣品是從所述個體獲得的樣品。所述樣品可獲自體液樣品(例如血液樣品)，活組織檢查，頭發(fā)、指曱或類似樣品或任何其它合適的樣品。在檢測相應的靶核酸和/或核酸類似物和/或其突變體的存在之前，樣品可在體外進行加工。例如樣品可經(jīng)過可將核酸從樣品中完全或部分純化出來的一個或多個純化步驟。此外，樣品可以已經(jīng)過擴增步驟，其中的核酸量已經(jīng)擴增，例如通過聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉錄聚合酶鏈式反應、連接酶鏈式反應或任何其它合適的擴增方法。此類方法對技術人員為公#p,例戈口，參見SambrookJ等，2000，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實驗手冊)(第三版)，ColdSpringHaborLaboratoryPress。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，供試核酸樣品選自由基因組DNA或基因組DNA的擴增產(chǎn)物，如基因組DNA的PCR擴增產(chǎn)物組成的組。所述方法可在檢測之前包括分離步驟，其中雜交的寡核苷酸或寡核苷酸類似物將與未雜交的寡核苷酸或寡核苷酸類似物分離，這可以有利于僅特異性檢測雜交的寡核苷酸或寡核苷酸類似物。例如，在與寡核苷酸或寡核苷酸類似物雜交之前，核酸混合物可被固定在閨體支持物上。雜交之后，未雜交的寡核苷酸或寡核苷酸類似物可^^洗脫下來，而雜交的寡核苷酸或寡核苷酸類似物可^皮檢測。但是執(zhí)行時沒有分離步驟的檢測也包含在本發(fā)明內。因此，檢測可在加入核酸混合物、本發(fā)明所述寡核香酸類似物和其它需要的試劑后的封閉管內執(zhí)行。此類方法在本文中也^皮稱為同質性方法。靶DNA可是，例如特定的基因、基因片段、微衛(wèi)星或任何其它DNA序列。人們特別感興趣的是特殊DNA(其可以是真核、原核、古細菌或病毒來源)的檢測。重要的是，本發(fā)明可有助于通過分析已知與特定微生物相關的特定序列對各種傳染性疾病進行診斷和/或基因分型。靶DNA可以復雜的生物核酸混合物(RNA和DNA)和非核酸(例如完整細胞或粗細胞提取物)形式提供。如果靶DNA為雙鏈或者具有明顯的二級和三級結構，雜交之前可能需要對其進行加熱。在這種情況下，加熱可在向含有寡核苷酸類似物的雜交介質中引入核酸之前或之后進行。一些情況下可能也需要在雜交分析之前，通過本領域已知的任何方法將核酸從復雜的生物樣品中提取出來以降低背景千擾。復雜的生物混合物。此復雜的生物混合物包括廣泛的真核和原核細胞，包括原生質體；或可容納靶脫氧核糖核酸的其它生物材料。因此，所述方法適用于組織培養(yǎng)動物細胞、動物細胞(例如血液、血清、血漿、網(wǎng)狀細胞、淋巴細胞、尿、骨髓組織、腦脊液或從血液或淋巴制備的任何產(chǎn)物)或任何類型的活組織檢查(例如肌肉活組織檢查、肝臟活組織檢查、腎活組織檢查、膀胱活組織檢查、骨活組織檢查、軟骨活組織檢查、皮膚活組織檢查、胰腺活組織檢查、腸道活組織檢查、胸腺活組織檢查、哺乳動物活組織檢查、子宮活組織檢查、睪丸活組織檢查、眼睛活組織檢查或腦活組織檢查，在裂解緩沖液中勻漿)、植物細胞或對滲透休克敏感的其它細胞和細菌、酵母、病毒、支原體、原生動物、立克次體、真菌的細胞和其它小的微生物細胞及類似細胞。例如，本發(fā)明的分析和分離程序可用于檢測感興趣的非致病性或致病性微生物。通過檢測包含疏水性核苷酸的寡核香酸或寡核苷酸類似物和生物樣品中擁有的核酸之間的特異性雜交，即可確定微生物的存在。在本發(fā)明的一個實施方案中，需要在給定的時間使用本文所述的寡核苷酸類似物檢測給定靶核酸的量。例如，在實時PCR中，這可通過定量所述寡核苷酸類似物的信號或通過查看需要對給定靶核酸進行多少擴增以產(chǎn)生可檢測的信號而完成。但是也可使用其它的定量方法。同源核酸當核酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物能夠雜交時，即說它們是同源互補的。優(yōu)選地，同源互補核酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物能夠在低嚴格性條件下雜交，更優(yōu)選地，同源互補核酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物能夠在中嚴格性條件下雜交，更優(yōu)選地，同源互補核酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物能夠在高嚴格性條件下雜交。核酸雜交領域的技術人員了解，一般用于指定或控制雜交嚴格性的因素包括變性劑(像例如曱酰胺)的濃度、鹽濃度(即離子強度)、雜交溫度、去污劑濃度、pH和離液劑(chaotrope)的存在與否。探針核堿基序列與其靶序列雜交的最佳嚴格性通常是通過逐一改變這些因素或其中的一部分因素發(fā)現(xiàn)的。如本文所用，高嚴格性條件將表示與一般應用于DNA印跡和雜交(例如，參見SouthernE.M.，1975，J.Mol.Biol.98:503-517)的嚴格性相當或至少一般嚴格的嚴格性。為此，常規(guī)的做法是包括預雜交和雜交步驟。此類步驟一般使用含有6xSSPE、5%Denhardt's、0.5%SDS、50%甲酰胺、100pg/ml變性鮭精DNA(在42°0孵育18小時)的溶液執(zhí)行，然后使用2xSSC和0.5%SDS(在室溫和在37。C)漂洗，然后用O.lxSSC和0.5%SDS(在68匸孵育30分鐘)漂洗，參見Sambrook等，1989，"MolecularCloning/ALaboratoryManual"(分子克隆實驗手冊)，ColdSpringHarbor),其通過引用結合入本文。如本文所用，中嚴格性條件將表示在含有1mMEDTA、10mMNa2HP04.H20、140mMNaCl(pH7.0)的緩沖液或與此相似的對雜交嚴格性具有大約相同的影響的緩沖液中進行雜交。優(yōu)選地，提供約1,5pM每種核酸或核酸類似物鏈?？蛇x地，中嚴格性可表示在含有50mMKCl、10mMTRIS-HCl(pH9,0)、0.1%TritonX國100、2mMMgCl2的緩沖液中進行雜交。本發(fā)明所述低嚴格性條件表示在由1MNaCl、10mMNa3PO4(pH7.0)組成的緩沖液或與此相似的對雜交嚴格性具有大約相同的影響的緩沖液中進行雜交?？蛇x地，同源互補核酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苦酸類似物是在給定序列上彼此大致互補，如大于70%互補，例如大于75%互補，如大于80%互補，例如大于85%互補，如大于90%互補，例如大于92%軍補，如大于94%互補，例如大于95%互補，如大于96%互補，例如大于97%互補的核酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物。優(yōu)選地，所述給定序列至少4個核苷酸，例如至少7個核香酸，如至少10個核苷酸，例如至少15個核苷酸，如至少20個核苷酸，例如至少25個核普酸，如10至500個核苷酸，例如4至100個核香酸，如6至30個核苷酸長。更優(yōu)選地，同源互補寡核苷酸或寡核苷酸類似物在其全長上大致同源互補。當一個核苷酸或核苷酸類似物序列的所有核堿基能夠與另一個序列的所有核威基形成沃森-克里克氬鍵時，即認為第一個核苦酸或核苷酸類似物序列與第二個核苷酸或核苷酸類似物序列互補。雜交特異性核酸和/或核酸類似物和/或寡核苷酸和/或寡核苷酸類似物的雜交特異性指所述雜交事件在給定嚴格性條件下根據(jù)同源互補的雜交配偶體的序列差異對其進行區(qū)分的能力。通常情況下，目的是要僅靶向核酸和/或核酸類似物和/或寡核苷酸和/或寡核苷酸類似物混合物中的一個特定序列(靼序列)，而避免與其它序列雜交(即使它們與所述靶序列具有很強的相似度也不行)。有時，靶和非乾序列在用于雜交的序列區(qū)僅有一個或少量核苷酸差異。如本文所用，高雜交特異性表示在某些條件下，例如高嚴格性條件下，寡核苷酸或寡核苷酸類似物與同源靶序列的雜交將顯著優(yōu)于與任何幾乎完全相同的序列(與所述乾序列僅有一個或少量堿基取代i異)的雜交。交叉雜交術語交叉雜交涵蓋至少兩個核酸和/或核酸類似物之間的任意雜交，即交叉雜交也可表示分子間雜交。因此術語交叉雜交可用于描述，例如核酸類似物序列的雜交。交叉雜交通常發(fā)生于探針和一個或多個同源互補的非靶序列之間，即使它們的互補程度低于探針和其互補乾序列的互補程度。這種不必要的效應可能是因為探針比靶大大過量和/或快速的退火動力學。交叉雜交也可通過少量核堿基對之間的氫鍵合發(fā)生，例如PCR反應中的引物之間的氫鍵合，導致形成引物二聚體和/或形成非特異性PCR產(chǎn)物。特別是包含一個或多個對相同類型的核苷酸類似物具有高親合性的核苷酸類似物的核酸趨于根椐堿基配對形成二聚體或更高級的復合體。特別是包含核苷酸類似物如但不限于，DNA、RNA、2'-0-甲基RNA、PNA、HNA、MNA、ANA、LNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、P-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、2'-R-RNA、2'-OR-RNA和其混合物的探針對包含相同類型的主鏈單體單元的其它寡核苷酸類似物一般具有高雜交親合性。因此即使各個探針分子僅具有較低的互補程度，它們仍趨于雜交。自體雜交術語自體雜交涵蓋其中核酸或核酸類似物分子通過自身回折與其自身退火，產(chǎn)生二級結構(像例如發(fā)夾結構)的過程，即自體雜交可被視為分子內雜交。在大多數(shù)應用中，避免自體雜交非常重要。產(chǎn)生所述二級結構可抑制與所需的核酸乾序列的雜交。這在大多數(shù)分析中都是不希望的，例如當所述核酸或核酸類似物用作PCR反應的引物或作為外切核酸酶分析的熒光團/猝滅劑標記的探針時。在上述兩種分析中，自體雜交可抑制與耙核酸的雜交，因此外切核酸酶分析中產(chǎn)生的信號強度將會降低。特別是包含一個或多個對相同類型的核苷酸類似物具有高親合性的核苷酸類似物的核酸趨于自體雜交。特別是包含核苷酸類似物如但不限于2'-0-甲基RNA、PNA、HNA、MNA、ANA、LNA、a-L-核糖-LNA、a誦L畫木糖-LNA、P-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、2'-R-RNA、2'-OR-RNA的探針一般具有高自體雜交親合性。因此即使各個探針分子僅具有較低的自體互補程度，它們仍趨于自體雜交。在一些發(fā)明中，最好使用發(fā)夾結構和其它二級結構。例如，分子信標就是這樣，其中熒光團和猝滅劑被置于寡核苷酸的兩端并且其中一端的一小段序列與所述寡核苷酸另一端的一小段序列互補。當不存在耙核酸(與將組成所述莖的兩個部分隔開的序列互補)時，所述寡核苷酸兩端的兩個序列將彼此雜交，生成莖結構，使焚光團和幹滅劑彼此靠近。與分子信標相似，疏水性分子的存在促進或增強了"自體雜交"，這通常也是希望的效應，例如當探針未結合時，導致無莖信標中的信號對更好地相互作用。因此本發(fā)明還包含包含一個或多個疏水性核脊酸(可有利于形成所需的所述寡核香酸類似物的三維結構)的寡核香酸類似物。在本發(fā)明中，疏水性分子可具有與分子信標中的莖相似的作用，即確保未結合探針中的信號對之間良好的相互作用。因此，在本發(fā)明的說明中，所需的疏水性自體雜交(并不是真正的自體雜交，而是自體相互作用)和氬鍵合造成的不需要的自體雜交之間有明顯分別。發(fā)夾結構通常最少由3個互補tt對組成，它們形成發(fā)夾的莖結構，而本發(fā)明所述無莖信標中的疏水性自體雜交不依賴于互補堿基對的堿基配對來增加未結合探針的信號對的相互作用。即使一個或少量核堿基按自體互補的方式匹配，其仍被視為疏水性自體雜交。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明所述寡核苷酸類似物不包含與所述寡核苷酸類似物內的另一個3核苷酸和/或核苷酸類似物連續(xù)序列互補的3核苷酸或核苷酸類似物連續(xù)序列。優(yōu)選地，本發(fā)明所述寡核苷酸類似物不包含與所述寡核苷酸類似物內的另一個4核苷酸和/或核苷酸類似物連續(xù)序列互補的4核苷酸或核苷酸類似物連續(xù)序列。例如，本發(fā)明所述寡核苷酸類似物不包含與所述寡核苷酸類似物內的另一個6核苷酸和/或核苷酸類似物連續(xù)序列互補的6核苷酸或核苷酸類似物連續(xù)序列。例如，本發(fā)明所述寡核苷酸類似物不包含與所述寡核苷酸類似物內的另一個8核苷酸和/或核香酸類似物連續(xù)序列互補的8核苷酸或核苦酸類似物連續(xù)序列。例如，本發(fā)明所述寡核苷酸類似物不包含與所述寡核苷酸類似物內的另一個10核苷酸和/或核苷酸類似物連續(xù)序列互補的10核苷酸或核香酸類似物連續(xù)序列。因此本發(fā)明優(yōu)選的實施方案提供包含信號對和至少一個疏水性分子的寡核香酸類似物，其中所述寡核苷酸類似物的信噪比顯著高于或^^于(與值1差別更大)相應的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的信噪比，并且其中所述寡核苷酸類似物與它們的靶核酸(不包含與所述乾序列不同源互補的莖結構)同源互補。這意味著本發(fā)明所述寡核苷酸類似物更易于設計，并且可以短于其相應的分子信標，因為不需要莖來優(yōu)化信噪比。熔解溫度核酸和核酸類似物的熔解指雙鏈核酸分子兩條鏈的熱分離。熔解溫度(Tm)表示出現(xiàn)50%螺旋(雜交)和巻曲(未雜交)形式的攝氏溫度。熔解溫度高指示復合體穩(wěn)定，因此兩條鏈之間的親合力高。反之，熔解溫度低指示兩條鏈之間的親合力相對較低。因此，通常來說兩條鏈之間的氬鍵合強將造成熔解溫度高。此外，熔解溫度依賴于環(huán)境的物理/化學狀態(tài)。例如熔解溫度一般依賴于鹽濃度和pH。熔解溫度可通過許多分析確定，例如其可通過使用UV光鐠確定雜交的形成和分解(熔解)或通過焚光來確定。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案在存在核酸混合物時，確定包含信號對和至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物的熔解溫度。本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案在從核酸混合物中擴增核酸序列反應之后，確定包含信號對和至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物的熔解溫度。本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案提供確定包含信號對和至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物的熔解溫度的方法，其中所述方法包含如下步驟a)提供測試靶序列或突變體序列存在所需的核酸或核酸類似物的混合物；和b)提供引物組和如本文所述的包含至少一個疏水性分子和信號對的寡核苷酸類似物，其中所迷引物和所迷寡核苷酸類似物能夠與所述耙序列和/或突變體序列雜交；和c)將所述引物和寡核苷酸類似物與所述核酸和/或核酸類似物混合物在允許所述引物與所述核酸和/或核酸類似物雜交的條件下孵育；和d)使用所述雜交的靶序列作為模板，用核苷酸或核苷酸類似物或寡核苷酸或寡核苷酸類似物對所迷引物的3'端進行延伸；和e)重復步驟c)至d)直至達到滿意的擴增；和迷突變體序列雜交的溫度；和g)增加測量信號對的信號時的溫度，直至確定所述寡核香酸類似物從其把序列熔解的溫度。此外，如本發(fā)明所公開，嵌入劑在雙鏈核酸核堿基間的嵌入作用或疏水性分子與溝結合的疏水性相互作用也可穩(wěn)定雙鏈核酸，并因此導致更高的熔解溫度。因此，經(jīng)常來說，本發(fā)明所述寡核苷酸類似物和DNA的雜種一般比相應的DNA/DNA雜種具有更高的熔解溫度。因此本發(fā)明優(yōu)選的實施方案提供包含信號對和至少一個疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸類似物，其中所述寡核苷酸類似物的熔解溫度顯著高于相應的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的熔解溫度。親合性核酸的親合性指兩個單鏈熱形成雙鏈核酸分子。與熔解溫度(Tm)—樣，親合性表示為出現(xiàn)50%螺旋(雜交)和巻曲(未雜交)形式的4聶氏溫度。在理想系統(tǒng)中，熔解溫度和親合溫度應相等或接近相等，但是有時在測量中并不能達到該平衡，其它條件或混合物中存在的分子可以影響雙鏈體的形成或變性。親合性高指示復合體穩(wěn)定，因此兩條鏈之間的親合力高。反之，親合性溫度低指示兩條鏈之間的親合力相對較低。因此，通常來說兩條鏈之間的氬鍵合強將造成親合性高。此外，如本發(fā)明所公開，嵌入劑在雙鏈核酸核威基間的嵌入作用或疏水性分子與溝結合的疏水性相互作用也可穩(wěn)定雙鏈核酸，并因此導致更高的親合性，或疏水性分子的位阻效應可導致較低的親合性。此外，親合性依賴于環(huán)境的物理/化學狀態(tài)。例如親合性一般依賴于鹽濃度和pH。親合性可通過許多途徑確定，例如其可通過使用UV光鐠確定雜交的形成和分解(熔解)或通過兩條鏈退火或變性的熒光變化來確定。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案確定包含信號對和至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物對包含核酸的混合物的親合性。本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案確定執(zhí)行擴增反應之后，包含信號對和至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物對包含核酸的混合物的親合性。本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案提供確定包含信號對和至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物的親合性的方法，其中所述方法包含如下步驟a)提供測試靶序列或突變體序列存在所需的核酸或核酸類似物的混合物;和b)提供引物組和如本文所述的包含至少一個疏水性分子和信號對的寡核苷酸類似物，其中所述引物和所述寡核苷酸類似物能夠與所述乾序列和/或突變體序列雜交;和c)將所述引物和寡核苷酸類似物與所述核酸和/或核酸類似物混合物在允許所述引物與所述核酸和/或核酸類似物雜交的條件下孵育；和d)使用所述雜交的靶序列作為模板，用核苷酸或核苷酸類似物或寡核苷酸或寡核苷酸類似物對所迷引物的3'端進行延伸；和e)重復步驟c)至d)直至達到滿意的擴增；和f)將所述混合物變性并快速冷卻至設定溫度(起點高于親合溫度)；和g)在所述寡核苷酸類似物雜交之后，擴增子重新退火之前，立即測量信號對的信號；和h)通過重復步驟f)至g)確定包含至少一個疏水性分子和信號對的所述核酸類似物的親合性，同時逐漸降低步驟f)中的溫度，直至該溫度降低至低于親合溫度。上述方法的優(yōu)點是克服了與擴增子的重新退火和包含信號對的所述核酸類似物的置換相關的問題。核酸酶抗性術語核酸酶抗性指寡核苷酸、寡核苷酸類似物、核酸或核酸類似物對核酸酶降解的抗性。核酸酶是通過將核苦酸鏈切割成較小的單元來催化核酸水解的酶的通用術語，并同時涵蓋內切核酸酶(在內部鍵處切割核酸從而產(chǎn)生不同大小的片段的核酸酶)和外切核酸酶(從核酸的一端開始，一次釋》文一個核香酸(連續(xù)地)的核酸酶)。核酸酶抗性常規(guī)是通過將寡核苷酸與細胞提取物或分離的核酸酶溶液孵育，然后測量隨時間保留的完整的寡核苷酸的程度(通常通過凝膠電泳或分光光度法測量)而測量的。測量核酸酶抗性的實例可包含下列步驟a)凝膠純化寡核苷酸類似物，并使用高效液相色譜純化的"P-ATP對其進行5'-端標記b)然后將所述寡核苷酸與蛇毒磷酸二酯酶孵育c)在不同的時間點采集樣品，立即猝滅反應d)然后在20%變性聚丙烯酰胺凝膠上分離寡核香酸代謝物，之后通過PhosphorImager分析進行定量。高核酸酶抗性指核香酸或核苷酸類似物是穩(wěn)定的或僅;故核酸酶緩慢降解(與可比較的DNA序列在相似條件下的降解速度相比)，而低核酸酶抗性指核苷酸或核苷酸類似物核_核酸酶降解的速度與相應DNA在相似條件下的降解相當。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明所述核苷酸類似物(無莖信標)優(yōu)選具有高核酸酶抗性，以便探針可以用于終點讀數(shù)(例如在存在于擴增反應之后)、在測量后重新使用或用于進一步的驗證和/或質量控制。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案提供包含信號對和至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物，其核酸酶抗性顯著高于相應的不包含所述至少一個疏水性基團的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的核酸酶抗性。本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案提供包含信號對和至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物，其中所述寡核普酸類似物對聚合酶潛在的核酸酶活性具有高核酸酶抗性。例如對抗一些TaqDNA聚合酶擁有的核酸酶活性。因此本發(fā)明優(yōu)選的實施方案提供包含信號對和至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物，其中所述寡核香酸類似物在核酸擴增使用的條件下相對穩(wěn)定。優(yōu)選地，所述寡核苷酸類似物具有高核酸酶抗性，以便它們在擴增反應中僅有較低程度的降解，例如僅降解0%，如最多1%,例如最多3%，如最多5%，例如最多7%、如最多10%，例如最多15%、如最多25%，例如最多50°/。，例如介于0%和25%,如介于0%和15%,例如介于0%和10%，如介于0%和5%。優(yōu)選地，上述降解是在與給定核酸酶(優(yōu)選為外切核酸酶，例如Taq聚合酶)在允許核酸酶活性的條件下孵育后獲得的。經(jīng)常來說，本發(fā)明所述寡核苷酸類似物在插入其中的疏水性核苷酸類似物附近具有核酸酶活性抗性。因此，如果核酸酶包含5'-3'外切核酸酶活性，則本發(fā)明所述寡核香酸類似物優(yōu)選在靠近5'端的位置包含至少一個疏水性核苷酸，例如疏水性核苷酸位于距5'端9,優(yōu)選地6，更優(yōu)選地4，例如2個核苷酸或核苦酸類似物以內。相似地，如果核酸酶包含3'-5'外切核酸酶活性，則本發(fā)明所述寡核苷酸類似物優(yōu)選在靠近3'端的位置包含至少一個疏水性核香酸，例如疏水性核苷酸位于距3'端9,優(yōu)選地6，更優(yōu)選地4，例如2，如1個核普酸或核苷酸類似物以內。如果核酸酶包含內切核酸酶活性，則所述寡核香酸類似物優(yōu)選在所述內切核酸酶的限制位點附近包含至少一個疏水性核苷酸。降低溫度(執(zhí)行標準的親合性測量)時，大多數(shù)可用的實時PCR儀器都需要一定量的時間來讀取信號強度。這一時間通常長的足夠允許擴增子(通常具有比探針對其耙序列的親合溫度更高的親合溫度)重新退火，千擾了親合性測量。但是在實時PCR測量過程中，測量條件為正常，所以擴增子的重新退火在很大程度上不會發(fā)生。因此本發(fā)明優(yōu)選的實施方案還提供使用核酸酶抗性探針快速確定例如實時擴增反應中的最佳讀數(shù)溫度范圍的方法，所述方法包含如下步驟b)提供包含信號對的核酸酶抗性寡核苷酸或寡核苷酸類似物，其中所述寡核苷酸或寡核苷酸類似物能夠與所述靶序列和/或突變體序列雜交；和c)將所述混合物變性，然后快速冷卻至設定溫度(起點高于親合溫度)，和d)測量信號對的信號，和e)通過重復步驟c)至e)，同時遂漸降低步驟c)中的溫度，直至該溫度降低至低于親合溫度而確定包含信號對的所述核酸類似物的親合力f)產(chǎn)生供以后測量的溫度(例如在所述乾核酸的擴增反應過程中)，該溫度低于得到的靶核酸的退火溫度和/或高于得到的突變體序列的退火溫度。優(yōu)選地，所述寡核苷酸或寡核苷酸類似物具有對DNA聚合酶的核酸酶活性，例如對Taq聚合酶的抗性。優(yōu)選地，能夠與輩巴序列和/或突變體序列雜交的所述寡核苷酸或寡核苷酸類似物和所述耙序列和/或所述突變體序列同源互補。如果所述包含信號對的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸類似物還包含至少一個本發(fā)明所述疏水性分子，如至少一個疏水性核苷酸，則更加優(yōu)選。所述至少一個疏水性核苷酸優(yōu)選位于上文所述的核酸酶抗性寡核芬酸類似物內。另一優(yōu)選方法是當測量起點低于親合溫度時，則在重復步驟c)至e)的過程中逐漸升高溫度。同樣優(yōu)選的還有在擴增反應過程中存在所述包含信號對的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的方法。更加優(yōu)選的實施方案是擴增反應在包含所述核酸酶抗性的寡核普酸或寡核苷酸類似物的同一容器中進行，并且上述方法也使用該容器，無需在擴增和確定退火溫度之間打開該容器(封閉管反應)。同樣優(yōu)選達到設定溫度至讀取信號之間經(jīng)過的時間足夠長使相對較小的包含信號對的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸類似物與其靶退火，但又不足長以允許全長擴增子(可以顯著千擾測量)重新退火。這意味著，當達到步驟c)中選擇的溫度時，步驟d)中進行測量之前經(jīng)過的時間是1秒，》口2秒-，侈J^口3秒、，6口4秒、，食!H口5牙少，3口6秒'，合J如7秒'，戈口8詳少，合寸如9秒，如10秒，例如11秒，如12秒，例如13秒，如14秒，例如15秒，例如最多l(xiāng)秒，如最多2秒，例如最多3秒，如最多4秒，例如最多5秒，如最多6秒，例如最多7秒，如最多8秒，例如最多9秒，如最多10秒，例如最多11秒，如最多12秒，例如最多13秒，如最多14秒，例如最多15秒，如介于1和15秒，例如介于3和20秒。本領域技術人員很容易通過觀察所述包含信號對的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的信號的變化(由退火溫度的變化造成的)找到探針的親合溫度。因為當寡核苷酸類似物未與乾序列雜交時，信號對的兩部分一般是靠近的，而當寡核苷酸類似物與其乾序列雜交時，信號對的兩部分不會靠近，所以取決于寡核苷酸類似物是否與靶序列雜交，信號對產(chǎn)生的信號將會存在差異。在以后的測量中，例如在實時PCR反應中，用作所述包含信號對的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸類似物測量點的溫度可以是比使用上述方法得到的所述核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸類似物與靶序列的退火溫度低例如TC，如2°C，例如3°C，4口4°C,例如5°C，如6°C，例如7°c，如8。c，例如9。c，如io。c，例如大于io。c，如介于rc和io。c，例如至少3。C。在以后的實時PCR反應中，用作所述包含信號對的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸類似物測量點的溫度可以是比使用上述方法得到的與突變體序列的退火溫度高例如rc，如2°C，例如3°C，如41:，例如5°C,如6"C，例如7。C，如8。C,例如9。C,如10。C，例如大于10。C，如介于1。C和1(TC，例如至少3。C。在以后使用所述包含信號對的核酸酶抗性的寡核香酸或寡核苷酸類似物的基因型特異性實時PCR反應中，用作測量點的溫度可以是，例如低于使用上述方法得到的與完全互補靶的退火溫度并高于使用上述方法得到的與突變體序列的退火溫度。上述方法的優(yōu)點是解決了在形成形成更慢但更穩(wěn)定的雙鏈體擴增子之前探針與乾序列退火的竟爭問題。但是上述方法可能不總是優(yōu)選的。因此，取決于可用儀器的靈活性、穩(wěn)健性和升溫速度，可優(yōu)選使用熔解溫度用于確定以后測量的最佳測量溫度。熔解溫度和親合溫度是探針用來檢測耙序列、確定實驗中的測量溫度的重要特征。因此本發(fā)明優(yōu)選的實施方案還提供使用核酸酶抗性探針快速確定擴增反應的最佳讀數(shù)溫度范圍的方法，所述方法包含如下步驟a)提供包含乾序列和/或突變體序列的核酸或核酸類似物混合物；和b)提供引物組和包含信號對的核酸酶抗性寡核普酸或寡核苷酸類似物(4笨針)，其中所述引物和所述探針能夠與所述靶序列和/或突變體序列雜交；和c)將所述引物和探針與所述核酸和/或核酸類似物混合物在允許所述引物與所述核酸和/或核酸類似物雜交的條件下孵育；和d)使用所述雜交的靶序列作為才莫板，用核苷酸或核普酸類似物或寡核苷酸或寡核苷酸類似物對所述引物的3'端進行延伸；和e)將所述探針與其靶序列雜交，并測量信號強度(例如在與引物雜交的溫度相同的溫度下)，和f)測量信號強度時，按照一定的幅度逐漸增加溫度，直至達到所需的延伸溫度，和g)完成延伸反應，將形成的擴增子變性，然后重復步驟c)至g)直至發(fā)生所需的擴增h)確定探針的熔解溫度。優(yōu)選地，所述寡核香酸或寡核苷酸類似物具有對DNA聚合酶的核酸酶活性，例如對Taq聚合酶的抗性。優(yōu)選地，能夠與輩巴序列和/或突變體序列雜交的所述寡核苷酸或寡核苷酸類似物和所述靶序列和/或所述突變體序列同源互補。如果所述包含信號對的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸類似物還包含至少一個本發(fā)明所述疏水性分子，如至少一個疏水性核苷酸，則更加優(yōu)選。所述至少一個疏水性核芬酸優(yōu)選位于上文所述的核酸酶抗性寡核苷酸類似物內。優(yōu)選達到探針雜交溫度和第一次讀取信號之間經(jīng)過的時間足夠長使相對較小的所述包含信號對的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸類似物與其靶退火，但又不足長以允許擴增子(顯著干擾測量)重新退火。接下來的溫度增加和測量應盡快執(zhí)行，以最大限度地減少擴增子的重新退火。優(yōu)選當達到步驟e)中選擇的溫度時，進行測量之前經(jīng)過的時間是1秒、，^口2牙少，仿:i口3禾少，i口4秒、，侈'如5秒、，3口6秒'，侈':i口7秒、，》o8秒、，例如9秒，如10秒，例如11秒，如12秒，例如13秒，如14秒，例如15秒，例如最多l(xiāng)秒，如最多2秒，例如最多3秒，如最多4秒，例如最多5秒，如最多6秒，例如最多7秒，如最多8秒，例如最多9秒，如最多10秒，例如最多11秒，如最多12秒，例如最多13秒，如最多14秒，例如最多15秒，如介于1和15秒，例如介于3和20秒。步驟f)中每次測量信號強度優(yōu)選的溫度上升為，例如rc，如2i:，例如3。C，如4。C，例如5。C，如6。C，例如7。C,如8。C，例如9。C，如介于rc和icrc。本領域技術人員很容易通過觀察所述探針的信號的變化(由增加溫度造成的)得到探針的熔解溫度。在以后的實時PCR反應中，用作所述包含信號對的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸類似物測量點的溫度可以是比使用上述方法得到的靶序列的熔解溫度低例如o.rc,如o.2。c，例如o.5。c，如rc,例如1.5。c如2°C，例如3"C，如4。C，例如5。C,如6。C，例如7。C，如8。C，例如9。C，如介于O.TC和l(TC，例如至少3°C。在以后的實時PCR反應中，用作所述包含信號對的核酸酶抗性的寡核苷酸或寡核苷酸類似物測量點的溫度可以是比使用上述方法得到的突變體序列的退火溫度高例如PC,如2。C，例如3。C，如4。C,例如5。C,如6°C，例如7°C,如8°C，例如9°C，如介于1。C和10°C，例如至少3°C。在以后使用所述包含信號對的核酸酶抗性的寡核香酸或寡核苷酸類似物的基因型特異性實時PCR反應中，用作測量點的溫度可以是，例如低于使用上述方法得到的完全互補靶的熔解溫度并高于使用上述方法得到的突變體序列的熔解溫度。如果聚合酶具有外切核酸酶活性，則不可以對不是核酸酶抗性的寡核苷酸使用上述方法或者至少上述方法是不優(yōu)選的。那樣的話探針將被降解，在所述溫度范圍內，信號強度將沒有或僅有很小變化。上述方法的優(yōu)點在于提供了在擴增反應使用的條件下，每個循環(huán)在不同溫度下的數(shù)據(jù)。因此本領域技術人員容易檢索有關探針和擴增反應二者的行為的信息，從而輕松快速地執(zhí)行設置的優(yōu)化。核酸酶抗性探針或封閉核酸酶活性的分析的另一個好處是探針的測量溫度無需與擴增反應的退火溫度或延伸溫度相關。此外，還可以在擴增過程中使用兩個或多個不同的測量溫度。當分析中存在多于一個探針時，使用兩個或多個測量溫度尤其有利。這樣就可以在各自的優(yōu)化溫度下讀取多個探針。疏水性基團本發(fā)明涉及包含疏水性核苷酸的寡核苷酸類似物，其中所述疏水性核苷酸具有通用結構X-Y-Q其中Q是疏水性分子。本發(fā)明所述疏水性分子具有疏水性并且不參與沃森-克里克氬鍵合。因此，本發(fā)明所述疏水性分子不是天然存在的核堿基。疏水性指物質排斥水或不能夠完全溶于水的傾向。疏水性物質容易溶解于許多非極性溶劑，如辛醇，但在極性溶劑水中僅有少量溶解。一種確性的對比(也稱為分配)有關。有機-水分配(P)描述了水中溶解的有機污染物在水相和不混溶的有機相之間的平衡分布。在將近100年的時間里，這兩個相就是辛醇-水分配系數(shù)，這種疏水性測量方法也廣泛用于描述有機物在天然水中的行為。疏水性越大，物質分配至疏水性有機相的傾向就越大。因此分配系數(shù)就是兩個接觸而不混溶的相之間的平衡濃度的筒單比值，即P-[有機相]/[水相]這一簡單關系假定不存在顯著的溶劑相互作用(溶劑是連續(xù)介質)、溶質-溶質相互作用(活度系數(shù)與濃度無關)或任何其它作用。在辛醇/水兩相系統(tǒng)中，化學物在辛醇相中的濃度與其在水相中的濃度的比值也被稱為K。w值。P=Kow=[辛醇相中濃度]/[水相中濃度〗K。w值不含單位，通常使用低溶質濃度(以便溶質本身不會影響分布)在室溫下測量。正辛醇是兩親性物質，兼有疏水性和親水性部分(分別為正烷基和醇基團)。這意味著它可以通過氫鍵合與親水性物質相互作用，和通過范德華力與疏水性物質相互作用。Kow值的范圍為10-3至107(logKow為-3至7)，但是大多數(shù)測量的logK。w都小于5，原因是高于此值時，化合物分配將非常強，而難于測量水相濃度(但是更高的值可以通過測量或計算獲得)。K。w并不是化學物在辛醇和水中的溶解度的比值，因為這兩個相不構成單純的雙元系統(tǒng)。特別是水在正辛醇中具有可觀的溶解度，生成了新的更親水的相。達到平衡時，有機相含有2.3mol/L的水，而水相含有4.5xl(T3mol/L的辛醇?？刂品菢O性和輕度極性化合物的辛醇-水分配系數(shù)的主要因素顯然是該化合物的疏水性，而不是正辛醇溶解度，所以有才幾相的準確性質相對不重要。一般優(yōu)選本發(fā)明所述疏水性分子的Kow至少為1。用于研究分配的其它系統(tǒng)包括[水]/[環(huán)己烷]、[水]/[氯仿]和其它。分配系數(shù)是加成性組成屬性，即，對于給定分子，分配系數(shù)可視為其組成部分的加成函數(shù)。這M于事實對于不同化合物來說，將-CH3基團從一個環(huán)境轉移的能量學是相對恒定的。這使得基于計算機的分配預測成為可能。非極性部分幾乎都不能與水分子相互作用，因此非極性部分附近的水分子重定向自身以最大限度地增加它們之間的氬鍵合。這導致水分子排序并降低系統(tǒng)的熵，但是如下文所述，這不總是起作用的僅有的力量。當兩個非極性部分或表面彼此靠近時，這些被限制的水分子就4皮擠出并游離進入大體積的水相。因此，疏水性相互作用可以視為從水相排出和熵最大化的過程。范德華相互作用也被認為參與非極性表面之間的相互作用。雖然非極性分子的平均偶極矩可為零，但是在給定瞬間，由于電子和質子的瞬時位置，偶極矩為非零。此偶極可以誘發(fā)附近中性分子的偶極矩。然后這兩個偶極可以互相吸引?？梢酝ㄟ^下列程序確定分配將相關化學物加入辛醇和水混合物，根據(jù)Kow的預期值調整所述化合物的體積比。1.在任何單相中，系統(tǒng)中溶質的濃度應少于0.01mol/L。2.必須使用非常純凈的辛醇和水。3.輕輕搖動系統(tǒng)(通常位于分液漏斗或相似設備中)直至達到平衡(0.5小時至3天)。然后離心所述系統(tǒng)以分離兩相和破壞任何乳狀液。4.然后通過適當?shù)募夹g分析所述兩個相以確定溶質濃度。如果可能，對兩個相都進行分析以實現(xiàn)質量平衡。也可以使用其它技術，例如可以將溶質在HPLC中的保留時間與疏水性關聯(lián)起來(例如Sahu&Pandit(2003)o/丄&.cfeAe/.7fec/2"o/.26:135-146)。如果實騶、沒計適當，保留時間的log值與K^的log值線性相關。此外，還使用計算機算法計算化合物的預期值(例如ALOGPS2.1h加:〃146.107.217.178/lab/alogps/starthtmK另請參見下文)。疏水性效應是非極性分子在存在水溶液時容易自我結合的屬性。在最極端的情形下，油將聚集在一起而不能與水混i^;去污劑形成的膠束和雙層(如在肥皂泡中)是疏水性效應的另一戲劇性結果。蛋白質折疊、蛋白質-蛋白質相互作用、核酸結構和蛋白質-小分子相互作用場合中也通常描述此效應。在蛋白質折疊情形下，它用于解釋為什么許多蛋白質具有由疏水性氨基酸，如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨脧基團一起組成的疏水性核；通常是圍繞中央疏水性軸形成的巻曲螺旋結構。疏水性相互作用是蛋白質折疊，以最大限度地減少與溶劑接觸的非極性(疏水性)表面面積的主要驅動力。這使折疊減少了約3-4倍。非常清楚，疏水性效應是液態(tài)水特殊屬性，最大可能是強的氬^T建合和水的小體積組合的結果。疏水性效應不僅僅是熵效應，而是熵和焓(隨溫度變化顯著)共同的貢獻。疏水性相互作用的基礎在于極性水分子和非極性分子之間缺乏強的有利的相互作用。這有效地導致了非極性分子間相互作用的增加。焓對疏水性相互作用的貢獻在20。C左右(即室溫)約為0，而熵的貢獻在140。C左右變?yōu)?。在比室溫高出許多的溫度下，非極性基團周圍的水分子的有序性逐漸降低。隨著溫度的降低，疏水性相互作用的強度也降低。這是與H-鍵相反的效應，H-鍵在較低溫度下變得更強?？赏ㄟ^將溶液溫度降低至接近零度而將疏水性效應消減至一定程度；在此溫度下，水"更喜歡"處于有序結構，而此疏水性片(patch)產(chǎn)生的有序結構也不再是能量上不利的。在低于室溫的溫度下，苯在水中的溶解度增加就完美地證明了這一點。疏水性通常用目標基團從水溶液遷移至非極性溶劑(通常為辛醇)的自由能(G遷移)來測量。一般而言，G遷移值和疏水性的其它測量值之間有很好的相關性。AG遷移=-RTlnPlnP值大于0表示化合物在有機相的濃度大于在水相的濃度。在本發(fā)明中，優(yōu)選的疏水性分子無論是通過實驗確定還是通過使用計算機程序計算(ALOGPS2.1,VirtualComputationalChemistryLaboratory,可在h加:〃146.107.217.178/lab/alo印s/starthtml在線獲得或從下列網(wǎng)址下載標準版http:〃146107.217.178/forms/downprogform.html,AlogPs2.1的描述參見Tetko和Tanchuk(2002)/.C/^亂/"/CowpW.42:1136-1145和Tetko和Tanchuk(2001)C/2e附./"/Co附/組5"c/.,41:1407-1421)，logP值均大于0的疏水性分子(不考慮主鏈單體單元或連接體，但是考慮與所述連接體或主鏈單體單元連接位置處的甲基)。有關如何計算本發(fā)明所述logP值的詳細信息，另請參見下文的實施例。因此，確定的所述logP值是代替包含曱基的連接體的疏水性分子的logP值。因此，對于任何給定的具有X-Y-Q結構的疏水性核苷酸，logP值是通過用甲基取代主鏈單體單元(X)和連接體(Y)，然后確定logP值來確定的。在本發(fā)明中，疏水性分子的logP計算值(不考慮主鏈單體單元或連4妄體，但是考慮寡核苷酸或寡核普酸類似物連接位置處的甲基)優(yōu)選為，例如大于0，如大于0.5，例如大于0.75，如大于l，例如大于1.25，如大于1.5，例如大于1.75，如大于2例如大于2.5，如大于3，例如大于4，如大于5。本發(fā)明所述疏水性分子優(yōu)選不參與沃森-克里克氬鍵合。在一個實施方案中，所述疏水性分子基本上不參與，如不參與與其它核堿基的特異性氬鍵合。此外，優(yōu)選所述疏水性分子不是信號對的組成部分。疏水性效應在如此廣泛的溫度范圍存在，這對本發(fā)明是一個很大的優(yōu)點。它意味著對于在水溶液中進行的普通分析，在任何給定溫度下，未結合探針的背景信號都將得到改進，如在2(TC至95。C范圍內的溫度下。因此本發(fā)明優(yōu)選的實施方案提供本發(fā)明所述的包含至少一個疏水性分子(如疏水性核苷酸)和信號對的寡核苷酸類似物(例如無莖信標)，在介于2(TC和95匸之間的任何溫度下，其背景信號都較相應的不包含所述疏水性基團的核酸有改進。本發(fā)明所述疏水性分子任選地通過連接體共價連接至核苷酸、核苷酸類似物或其自身的主鏈單體單元。一般而言，所述疏水性分子可共價連接至連接體，而該連接體共價連接至主鏈單體單元。包含本發(fā)明所述疏水性分子的核苷酸可以插入寡核苷酸或寡核普酸類似物的任何位置。本發(fā)明所述核苷酸應插入包含其它核苷酸或核脊酸類似物的寡核苷酸或寡核苷酸在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述疏水性分子不直接共價連接至包含天然存在的核堿基的核苷酸類似物的核苷酸。因此，在此實施方案中，連接體Y優(yōu)選不包含核堿基，并且主鏈單體單元也不包含核堿基。本發(fā)明所述疏水性分子應向包含它們的寡核苷酸類似物(例如無莖探針)引入改進的信噪比和任選地一個或多個下列特征如改進的核酸酶抗性和/或增強的親合性，但是其它特征，如序列識別、核酸酶敏感性、對緩沖液溶液離子強度的依賴性和/或Mg^依賴性，可以通過構成該寡核苷酸類似物(例如無莖信標)的其它(非疏水性)核苷酸確定。本發(fā)明的主要目標是提供包含疏水性分子的線性探針(無莖信標)，其信噪比要好于相應的不含所述疏水性分子的線性探針。當所述探針未與靶序列結合時，所述疏水性分子應有利于探針的兩半進行更近的相互作用，進而有利于信號對的兩個部分進行更近的相互作用。重要的是，未結合探針的信號對的兩半要具有強烈的相互作用(在測量溫度下)，原因是本發(fā)明使用的所有信號對的信號強度都依賴于所述對的兩個部分之間的距離。當探針與其乾核酸結合時，探針將會展開，它的兩端將被分開，但是當它未與乾核酸結合時，所述探針形成隨機的巻曲螺旋，信號對的兩個部分將彼此靠近。例如，F(xiàn)RET的效率依賴于分子間距離的逆六次方根(inversesixthpower),說明了未結合探針中信號對的兩個部分靠近對獲得好的信噪比的重要性。疏水性分子的存在增強了未結合探針兩半的相互作用。本發(fā)明所述疏水性基團優(yōu)選為能夠誘導信號對的兩個部分更好地相互作用，從而獲得更好的探針信噪比的疏水性基團。例如，如果信號對由熒光團和猝滅劑組成，則通過降低未結合探針的背景信號即可增加信噪比。不受任何特異性理論的束縛，認為疏水性分子可以增加未結合探針中信號對兩個部分的相互作用的主要原因是，本發(fā)明所述探針的另一端的疏水性分子間的疏水性相互作用試圖彼此保護以防止讓太多表面接觸親水性溶劑，從而增加了信號對兩個部分彼此靠近的可能性。因此所述探針不僅依賴于隨^L巻曲螺旋，而且有額外的力能幫助回折。使用包含信號對的探針(其中信號依賴于所述信號對的兩個部分之間的距離)檢測、鑒定或定量耙序列時，重要的一點就是信噪比要盡可能遠離1以避免假陽性和假陰性解釋。同樣重要的還有多重反應中的背景信號不能太高，原因是這樣會導致熒光團之間串話(cross-talk)。因此，優(yōu)選實施方案提供包含本發(fā)明所述至少一個疏水性分子和信號對的寡核苷酸類似物，其中至少一個所述疏水性分子位于所述寡核苷酸或寡核苷酸類似物的半側并能與位于所述寡核苷酸或寡核普酸類似物另一半的所述信號對的部分發(fā)生疏水性相互作用，以便當探針未結合時，所述信號對的兩個部分之間的相互作用強于相應的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸類似物。本發(fā)明另一個更加優(yōu)選的實施方案提供包含信號對和在所述寡核苷酸類似物的兩側各有至少一個疏水性分子的寡核香酸類似物，其中所述疏水性分子能夠彼此發(fā)生疏水性相互作用，以便當探針未結合時，所述信號對的兩個部分之間的相互作用強于相應的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸類似物。信號對兩個部分之間的增強的相互作用也可導致信號強度高于或低于相應的不包含所述嵌入劑的寡核苷酸或寡核苷酸類似物。如果所述信號對由熒光團和猝滅劑組成，則所述兩個部分之間增強的相互作用優(yōu)選造成熒光降低。本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案提供包含至少一個疏水性分子(優(yōu)選為疏水性核苷酸)、熒光團和猝滅劑的寡核苷酸類似物，當所述寡核苷酸類似物/探針未與把序列結合時，其背景信號要低于相應的不含所述疏水性分子(如疏水性核香酸)的線性探針。優(yōu)選地，上述實施方案特別適用于在封閉管(同質性)分析中使用所述寡核苷酸類似物的情形。本發(fā)明的另一個實施方案提供包含至少一個疏水性核苷酸和信號對的寡核苷酸類似物，其中所述信號對的部分在靠近時能夠形成受激子、激發(fā)復合體、FRET復合體或電荷遷移復合體，其中當所述寡核苦酸類似物/探針未與靶序列結合時，所述寡核苷酸類似物的背景信號要高于相應的不含所述疏水性核苷酸的線性探針。優(yōu)選地，上述實施方案特別適用于在封閉管(同質性)分析中使用所述寡核普酸類似物的情形。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸類似物，如無莖信標由DNA核苷酸、信號對和疏水性核苷酸組成。包含本發(fā)明所述至少一個疏水性分子(如疏水性核普酸)和信號對的寡核苷酸類似物可包含優(yōu)于相應的不包含所述疏水性分子的寡核普酸或寡核苷酸類似物的特征(無論所述探針是用于外切核酸i^農(nóng)賴性分析或非外切核酸H^賴性分析)。因此本發(fā)明優(yōu)選的實施方案提供包含至少一個疏水性分子和信號對(探針)的寡核苷酸類似物，所述寡核苷酸類似物的信噪比要好于相應的不含所述疏水性分子的線性探針，其中所述探針用于核酸酶依賴性分析。更加優(yōu)選地，所述分析依賴于聚合酶的外切核酸酶活性。對于本發(fā)明的一些應用，無莖信標必須未被例如DNA聚合酶的核酸酶活性降解或至少未有任何程度顯著的降解。因此在本發(fā)明的一些實施方案中，優(yōu)選提供包含至少一個疏水性分子和信號對的寡核苷酸類似物，其中所述寡核苷酸類似物的核酸酶穩(wěn)定性高于相應的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的核酸酶穩(wěn)定性。分子探針的主要挑戰(zhàn)之一就是如何能夠辨別差異小至一個核苷酸的非常相似的靶。一般而言，揭:針越短，一個錯配對親合性的影響越大，因此就越容易靶向完全互補靼而不是錯配的乾。高親合性DNA類似物、小溝結合物、MGB和嵌入劑之前已用于生產(chǎn)可以比相應的基于DNA的探針短的熒光探針。因此本發(fā)明優(yōu)選的實施方案提供包含至少一個疏水性分子(如疏水性核苷酸)和信號對的寡核苷酸類似物，其中所述寡核普酸類似物和靶序列(如DNA序列)的雜種的熔解溫度與相應的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸類似物和乾序列(如DNA序列)的雜種的熔解溫度相同，或咼于后者o原則上講，任何引入的探針信噪比能夠顯著好于(更加遠離值l)相應的不含所述疏水性分子(如疏水性核苷酸)的線性探針的疏水性分子(如疏水性核苷酸)都可以用于本發(fā)明。這意味著，在一個實施方案中，所述疏水性分子可以是嵌入劑、小溝結合物和以前已經(jīng)用于與探針結合的其它分子。但是產(chǎn)生的信噪比不能顯著好于(更加遠離值l)相應的不含所述疏水性脂肪酸、類固醇、小溝結合物和嵌入劑都是可以用于本發(fā)明的疏水性分子，特別是具有如上文所述的logP值的此類脂肪酸、類固醇、小溝結合物和嵌入劑。但是，本發(fā)明優(yōu)選的疏水性分子是能夠和本發(fā)明所述寡核苷酸類似物與其靶序列雜交形成的雙鏈體相互作用而不擾動所述雙鏈體(與所述疏水性分子不存在于所述寡核苷酸或寡核普酸類似物時相比)的疏水性基團。本發(fā)明所述的疏水性分子優(yōu)選包含至少一個環(huán)系統(tǒng)，如5或6元環(huán)結構。所形成的環(huán)可以是芳環(huán)或非芳環(huán)種類。優(yōu)選地，所述環(huán)系統(tǒng)由C、S、N和/或0組成，優(yōu)選地，所述環(huán)系統(tǒng)的大部分成員為C?？瑟毩⑷〈霏h(huán)系統(tǒng)的各個位置。更優(yōu)選地，本發(fā)明所述疏水性基團是嵌入劑和小溝結合物。本發(fā)明所述的疏水性基團最優(yōu)選是嵌入劑。嵌入劑本發(fā)明所述術語嵌入劑涵蓋包含至少一個能夠與核酸的核堿基共堆疊的基本上平面接合的系統(tǒng)的任何分子部分。優(yōu)選地，本發(fā)明所述嵌入劑基本上由至少一個能夠與核酸或核酸類似物的核堿基共堆疊的基本上平面才妄合的系統(tǒng)組成。嵌入劑包含至少一個兀(phi)電子系統(tǒng)，依據(jù)本發(fā)明，該7t電子系統(tǒng)可以與其它包含TI電子系統(tǒng)的分子相互作用。這些相互作用可以對所述嵌入劑的疏水性相互作用起正或負貢獻。Hunter和Sanders(1990)丄爿wC/2ew.Soc.112:5525-5534，推薦了兩個兀電子系統(tǒng)可以彼此正向相互作用的一系列不同的取向和條件。優(yōu)選地，所述嵌入劑包含選自聚芳烴(polyaromate)和雜聚芳烴(heteropolyaromate)的化學基團，更優(yōu)選地，所述嵌入劑基本上由聚芳烴或雜聚芳烴組成。最優(yōu)選地，所述嵌入劑選自聚芳烴和雜聚芳烴。本發(fā)明所述聚芳烴或雜聚芳烴可由任何合適數(shù)量的環(huán)組成，如1，例如2，如3，例如4，如5，例如6，如7,例如8,如大于8。此外，聚芳烴或雜聚芳烴可被選自由羥基、溴、氟、氯、碘、巰基、硫、氰基、烷基硫、雜環(huán)、芳基、雜芳基、氛基、烷氧羰基(carboalkoyl)、烷基、烯基、炔基、硝基、氨基、烷氧基、羰基和酰氨基組成的組的一個或多個取代。當本發(fā)明所述寡核苷酸類似物與互補靶雜交時，信號對的兩個部分(例如熒光團和猝滅劑)在空間距離上是分開的，以允許所述熒光團發(fā)焚光。本發(fā)明所述寡核苷酸類似物包含至少一個包含疏水性分子如平面(雜)芳基嵌入劑的疏水性核苷酸，當所述嵌入劑不能嵌入互補雙鏈體的減基對時，它們彼此發(fā)生疏水性相互作用或與所述信號對的任一部分發(fā)生疏水性相互作用。這樣它們就可以促進所述疏水性分子的疏水性部分和信號對之間的相互作用和最大限度地減少與緩沖液中的水的接觸。因此，如果混合物中沒有互補靶或互補靶少于寡核苷酸類似物(如無莖信標)，依據(jù)本發(fā)明，未結合的寡核苷酸類似物(探針)的疏水性分子(例如嵌入劑)將促進所述探針的兩端互相靠近，從而增強對未結合的寡核芬酸類似物(如無莖信標)的熒光團的猝滅。與傳統(tǒng)的基于DNA的分子信標不同，此回折機制與序列無關，因此無須設計自我互補的莖結構以適當?shù)剽缢龇肿?。兩個芳香系統(tǒng)之間相互作用的強度可通過上述疏水性相互作用以及電子分布、密度、取向、距離和接合系統(tǒng)的大小確定。因此，本發(fā)明所述疏水性分子可以是優(yōu)選選自以下組成的組的嵌入劑菲咯啉、吩喚、菲啶、蒽醌、芘、蒽、環(huán)烷(napthene)、菲、茵、篇(chrysene)、萘并苯(naphtacene)、吖啶酮類、苯并蒽類、均二苯代乙烯類、草酰吡啶咔唑類、疊氮苯類、卟啉類、補骨脂素類，和^皮選自由羥基、溴、氟、氯、碘、巰基、硫、氰基、烷基硫、雜環(huán)、芳基、雜芳基、羧基、烷氧羰基、烷基、烯基、炔基、硝基、氨基、烷氧基和/或酰氨基組成的組的一個或多個取代的任何上述嵌入劑。優(yōu)選地，所述嵌入劑選自由菲咯啉、吩溱、菲啶、蒽醌、芘、蒽、環(huán)烷、菲、茴、篇、萘并苯、吖啶酮類、苯并蒽類、均二苯代乙烯類、草酰吡啶咔唑類、疊氮苯類、卟啉類和補骨脂素類組成的組。更優(yōu)選地，所述嵌入劑選自由菲咯啉、吩。秦、菲啶、蒽醌、芘、蒽、環(huán)烷、菲、茵、篇、萘并苯、吖啶酮類、苯并蒽類、均二苯代乙烯類、草酰吡啶咔唑類、疊氮苯類、卟啉類和補骨脂素類組成的組。在優(yōu)選的實施方案中，所述嵌入劑選自由菲咯啉、吩*、菲啶、蒽醌、芘、蒽、菲、篇、萘并苯、苯并蒽類、均二苯代乙烯類和卟啉類組成的組。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述疏水性基團包含芘或吡啶并[3',2':4，5]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4(lH)-酮或7,9-二甲基-吡啶并[3',2',4,5]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4(3H)-酮。所述疏水性基團也可由芘或吡啶并[3',2':4,5]瘞吩并[3,2-d]嘧咬-4(lH)-酮，或7,9-二甲基-吡啶并[3'，2',4,5]噻吩并[3,2-d]嘧咬-4(3H)-酮組成。更優(yōu)選地，所述嵌入劑可選自包含如下文所示的結構之一的嵌入劑組<formula>formulaseeoriginaldocumentpage63</formula>6H-吲哚并[2,3-b]喹喔啉會啉1H-茚苯并噻唑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>OMeMe,MeO'、、,OMe+N屮XXXIV二苯并[a,g]會"秦，2,3,10,11-四曱氧基-8-甲基-NH2一N^~/xxxvk泛喹酮，3,8-二M-5-[3-(二乙基甲基銨基)丙基]國6-苯基-ON0XXXVIlH-苯并[de]異喹啉隱l,3(2H)-二酮Y、NXXXV邁、J.吡啶并[3,2-a:2',3'-c]吩溱XXXIX\喹啉，4-[(3-乙基-2(3H)-苯并噁唑亞基)曱基]-l-曱基-f、^々NXL1+H2N'吖啶，6-氨基-3,10-亞M-lO-曱基-'瑪二氫國3畫66吖啶，9-tt-10-曱基-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>^---\喹淋，l-甲基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并遂唑亞<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>1,3,6,8(2H,7H)-芘四酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>苯并[lmnp,8]菲咯啉<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>2H-l-苯并吡喃-2-酮XLVI咕噸，9-苯基-吡咬并[3',2':4,5]遂吩并[3,2-d]嘧啶-4(lH)-酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>富瓦烯以及任選地但是并不是如此優(yōu)選的，其衍生物。更優(yōu)選地，所述嵌入劑可選自由上述編號為v、xii、xiv、xv、xvii、xxiii、xxvi、xxviii、xlvii、li和lii的嵌入劑結構以及其衍生物組成的嵌入劑組，優(yōu)選選自由上述編號為v、xii、xiv、xv、xvii、xxiii、xxvi、xxvm、xlvii、Li和Lii的嵌入劑結構組成的嵌入劑組。最優(yōu)選地，所述嵌入劑選自上述編號為xn、xiv、xvn、xxin、li以及其衍生物的嵌入劑結構組，優(yōu)選選自上述編號為xii、xiv、xvii、xxm和li的嵌入劑結構組。上述實例列表不應以任何方式視為限制，而僅是為了提供包含嵌入劑的疏水性分子的可能結構的實例。此外，在每個嵌入劑上進行一個或多個化學基團取代以獲得修飾的結構也包括在本發(fā)明內。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述嵌入劑可以是國際專利申請WO03/052132在"intercalator"(嵌入劑)一節(jié)(第46頁第10行-第54頁第13行)中描述的任何嵌入劑。68小溝結合物雖然在本發(fā)明其它實施方案中，所述疏水性分子優(yōu)選不是小溝結合物，但是在一個特異性實施方案中，所述疏水性分子可以是小溝結合物。所述小溝結合物優(yōu)選是具有如上文所示的logP值的疏水性分子。小溝結合物是與雙鏈體DNA在小溝結合的一類潛在的寡核香酸或寡核苷酸類似物修飾劑。小溝結合物是采用"新月狀，，的，可以與雙螺旋中兩個磷酸-糖主鏈之間形成的深窄空間(叫做小溝)緊密結合，置換水分子和在所述小溝中形成緊密的原子接觸的長的扁平分子。它們通過氫鍵和/或疏水性相互作用穩(wěn)定于所述小溝中。上文的先前技術一節(jié)簡要解釋了Kutyavin和同事如何將MGB分子接合至探針的3'-端并將其用于5'-核酸酶PCR分析和非核酸酶依賴性分析(其中所述MGB連接至探針的5'-端)。所有這些出版物均未討論通過未結合探針的疏水性相互作用降低背景信號。因此，即使MGB在本領域為公知，在本發(fā)明之前，并不知道處于寡核苷酸類似物內正確組合和位置的所述MGB的疏水性可以用于通過增加信號對兩個部分之間的相互作用而改進信噪比。因此本發(fā)明優(yōu)選的實施方案提供包含至少一個小溝結合物和信號對的寡核苷酸類似物，其中所述小溝結合物位于所述寡核苷酸或寡核苷酸類似物的一端，并且當未與靶序列結合時，該小溝結合物與所迷寡核苷酸類似物另一半的部分具有疏水性相互作用。特別是，優(yōu)選包含小溝結合物的疏水性核苷酸不是位于寡核苷酸類似物5'端或3'端的第一個核苷酸或核苷酸類似物，而是在其內部。本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案提供的寡核香酸類似物包含信號對和位于所述寡核苷酸類似物一端的至少一個小溝結合物和另一個位于所述寡核苷酸類似物另一半的本發(fā)明所述疏水性分子，所以當所述寡核苷酸類似物未與靶序列結合時，所述小溝結合物和所述疏水性分子對彼此具有疏水性相互作用，使所述信號對的兩個部分之間更好地相互作用。主鏈單體單元依據(jù)本發(fā)明，核苷酸或核苦酸類似物的主鏈單體單元是參與摻入核酸或核酸類似物的主鏈的核苷酸的部分。主鏈單體單元(x)優(yōu)選共價連接至連接體(Y)，而連接體(Y)共價連接至疏水性分子?？梢圆捎萌魏魏线m的主鏈單體單元將疏水性核苷酸摻入本發(fā)明所述寡核苷酸類似物。也可以使用任何類型的連接體連接所述主鏈單體單元和所述疏水性分子。此外，所述主鏈單體單元可包含一個或多個離去基團、保護基團和/或反應基團，這些基團可以在合成包含所述主鏈單體單元的寡核苷酸或寡核普酸類似物的過程中或合成之后以任何方式除去或變化。主鏈單體單元可以是任何合適的主鏈單體單元。例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，主鏈單體單元可選自由以下組成的組DNA、RNA、PNA、HNA、畫A、ANA、LNA、CNA、CeNA、TNA、(2'國NH)國TNA、(3'畫NH)國TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、(3-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、雙環(huán)-DNA、6-^J^-雙環(huán)-DNA、5-表-雙環(huán)-DNA、a-雙環(huán)-DNA、三環(huán)-DNA、雙環(huán)[4.3.0]-DNA、雙環(huán)[3.2.1]-DNA、雙環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA、P-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃來蘇糖基-NA、2'-R-RNA、a-L-RNA或a-D-RNA、P-D-RNA和其混合物和其雜種的主鏈單體單元，以及其磷原子修飾，如但不限于硫代磷酸酯、曱基磷酸化物、亞磷酰胺、二^5克代磷酸酯、硒代磷酸酯、磷酸三酯和硼代磷酸酯。此外，不含磷的化合物也可用于與核苷酸連接，如但不限于甲亞氨基甲基、乙酸曱酯、硫代乙酸甲酯和包含酰胺的連接基團。特別是核酸和核酸類似物可包含一個或多個本發(fā)明所述疏水性核普酸。下文描述了本發(fā)明使用的核普酸和核苷酸類似物的一系列不同的主鏈單體單元和它們如何通過連接至所述主鏈單體單元的一個或兩個位置的連接體與核堿基連接<formula>formulaseeoriginaldocumentpage71</formula>一些類似物的寡聚體實例環(huán)己烷基-NA(CNA)一些類似物的寡聚體實例<formula>formulaseeoriginaldocumentpage73</formula>a-L-核糖-LWA相應類似物的核酸的一段Ref:RajwaD淑,V，K.etal.Ch加.Coramun.，1999,1395-13訴,Ref:叫、va鵬hLV.Ketal.Angew'Ch啦IntBd,，2000，1656-1659.Re^W咖gG，；etal.Tetrabftdron,7707*2724.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage76</formula>2'修飾的寡聚體的通用結構A堿基<formula>formulaseeoriginaldocumentpage76</formula>據(jù)我們所知尚未合成或公開的修飾的實例:上文顯示的一些主鏈單體單元已偶聯(lián)至本發(fā)明所述疏水性分子，而其它主鏈單體單元可以具有連接至核苷酸的疏水性分子?？梢栽谌魏慰捎迷?，如核堿基、主鏈或連接所述核堿基和主鏈的連接體(如果存在)的原子處連接所述疏水性分子。所述疏水性分子也可以置換所述核堿基或偶聯(lián)至其自身的任何類型的主鏈單體單元。在優(yōu)選實施方案中，主鏈單體單元不包含核堿基，如天然存在的核堿基。連接體也優(yōu)選不包含核堿基，如天然存在的核堿基。當主鏈單體單元包含核糖基團時，在一個實施方案中，所述疏水性分子優(yōu)選通過連接體共價連接至核糖基團。因此在此實施方案中，所述疏水性分子優(yōu)選不通過連接體(Y)共價連接至主鏈的磷酸基團。LNA(鎖核酸)的主鏈單體單元是空間受限的DNA主鏈單體單元，其包含限制DNA主鏈單體單元通常的構象自由的分子內橋。LNA可以是WO99/14226(Exiqon)中描述的任何LNA分子，優(yōu)選地，LNA是選自WO99/14226的摘要中描繪的分子。本發(fā)明所述LNA優(yōu)選包含將2'-0位置連接至4'-C位置的曱基連接體，但是其它LNA(如其中2'氧原子被置換為氮或石危的LNA)也包含在本發(fā)明內。包含本發(fā)明所述疏水性分子的核苷酸主鏈單體單元優(yōu)選為允許所述疏水性分子與其靼核酸相互作用的主鏈單體單元。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述主鏈單體單元選自由無環(huán)主鏈單體單元組成的組。無環(huán)意在涵蓋任何不包含環(huán)結構的主鏈單體單元，例如所述主鏈單體單元優(yōu)選不包含核糖或脫氧核糖基團。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明所述疏水性核香酸的主鏈單體單元可選自由包含至少一個選自三價和五價磷原子(如五價磷原子)的化學基團的主鏈單體單元組成的組。更優(yōu)選地，本發(fā)明所述主鏈單體單元的磷酸原子可選自由包含至少一個選自磷酸酯、磷酸二酯、磷酰胺(phosphoramidate)和亞磷酰胺(phosphoramidit)基團的化學基團的主鏈單體單元組成的組。特別是，優(yōu)選地，本發(fā)明所述疏水性核苷酸的主鏈單體單元選自由包含至少一個選自磷酸、磷酸酯、磷酸二酯、磷酰胺和亞磷酰胺基團的化學基團的無環(huán)主鏈單體單元組成的組。優(yōu)選地，所述主鏈單體單元能夠以最多5，例如最多4個原子將所述主鏈單體單元的磷原子和最近的相鄰磷原子隔開的方式摻入核酸或核酸類似物的磷酸主鏈，更優(yōu)選地，5,如最多4個原子將所述主鏈單體單元的磷原子和最近的相鄰磷原子隔開的方式摻入核酸或核酸類似物的磷酸主鏈，兩種情況下均不包括所述磷原子自身。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，所述疏水性核苷酸包含包含亞磷酰胺的主鏈單體單元，更優(yōu)選地，所述主鏈單體單元包含三^介亞磷酰胺或五價。合適的三價亞磷酰胺是可摻入核酸和/或核酸類似物主鏈的三價或五價亞磷酰胺。通常來講，所述亞磷酰胺(amidit)基團本身不可摻入核酸主鏈，而是亞磷酰胺(amidit)基團或亞磷酰胺(amidit)基團的部分可充當離去基團和/或保護基團。但是，優(yōu)選地，所述主鏈單體單元包含亞磷酰胺基團，原因是此基團可促進所述主鏈單體單元摻入核酸主鏈。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述主鏈單體單元可以是國際專利申請WO03/052132在"Backbonemonomerunit"(主鏈單體單元)一節(jié)(第24頁，第27行-第43頁，第14行)中描述的任何主鏈單體單元。連接體本發(fā)明所述疏水性核香酸的連接體是連接疏水性分子和所述疏水性核苷酸的主鏈單體的部分，優(yōu)選地共價連接所述疏水性分子和(abdtge)主鏈單體單元的部分。連接體可包含一個或多個原子或原子間的鍵。通過上文確定的主鏈和疏水性分子的定義，即表明連接體是連接主鏈和疏水性分子的最短途徑。如果疏水性分子直接連接至主鏈，則連接體是鍵。連接體通常由原子鏈或分支的原子鏈組成。鏈可以是飽和以及非飽和的。連接體還可以是接合或未接合鍵的環(huán)結構。例如，連接體可包含m個選自由C、O、S、N、P、Se、Si、Ge、Sn和Pb組成的組，優(yōu)選選自由C、O、S、N和P組成的組，更優(yōu)選地為C的原子的鏈，其中所迷鏈的一端連接至疏水性分子，而所述鏈的另一端連接至主鏈單體單元。在一些實施方案中，依據(jù)本發(fā)明，連接體和疏水性核苷酸的疏水性分子的總長度優(yōu)選介于8和13A(參見下文)。因此，應根據(jù)特定疏水性核苷酸的疏水性分子的大小選擇m。即，當嵌入劑小時，m應該相對較大，而當嵌入劑大時，m應相對專交小。但是，對于大多數(shù)用途，m將為1至7，如1至6,如1至5，如1至4的整數(shù)。如上文所述，連接體可以是非飽和鏈或另一個包括接合鍵的系統(tǒng)。例如，連接體可包含環(huán)的接合結構。優(yōu)選地，當連接體為飽和鏈時，m介于1至4。當疏水性分子為芘時，m優(yōu)選為1至7，如1至6,如1至5，如1至4,更優(yōu)選地1至4，甚至更優(yōu)選地1至3的整數(shù)，最優(yōu)選地，m為2或3。當嵌入劑具有結構NSQ時，m優(yōu)選介于2至6，更優(yōu)選地為2。在一個實施方案中，所述連接體是氮雜烷基(azaalkyl)、氧烷基(oxaalkyl)、硫烷基(thiaalkyl)或烷基鏈。例如所述連接體可以是被選自由C、H、O、S、N、P、Se、Si、Ge、Sn和Pb組成的組，優(yōu)選選自由C、H、O、S、N和P組成的組的一個或多個取代的烷基鏈。在優(yōu)選實施方案中，所述連接體由無支鏈的烷基鏈組成，其中所述鏈的一端連接至疏水性分子，而所述鏈的另一端連接至主鏈單體單元，并且其中每個C被2個H取代。更優(yōu)選地，所述無支鏈烷基鏈是1至5個原子長，如1至4個原子長，如1至3個原子長，如2至3個原子長。在另一個實施方案中，所述連接體由1至6個C原子和0至3個下列每種原子0、S、N組成。更優(yōu)選地，所迷連接體由1至6個C原子和0至1個下列每種原子0、S、N組成。在優(yōu)選實施方案中，所述連接體由C、0、S和N原子的鏈(任選地已取代)組成。優(yōu)選地，所述鏈應由最多3個原子組成，因此包含0至3個獨立選自C、0、S、N的原子(任選地已取代)。在優(yōu)選實施方案中，所述連接體由C、N、S和O原子的鏈組成，其中所述鏈的一端連接至嵌入劑，而所述鏈的另一端連接至主鏈單體單元。優(yōu)選地，此鏈包含下文所示的連接體之一，最優(yōu)選地，所述連接體由下文所示的分子之一組成yCH2廣CH2尸2/~CH2CH2H2C—CH2H2CJ0~/0~CH2H2C-dH2C—OininivvvivnoCHO>~~O^#=/PH2p~CH2OH2C~^HC=CH0~/OC三CvmixxxixnxmxivxvxviCHCH2廣CH2jS—CH2O廠OS—CH2HaC—《H2C~SSH2C—S<O-^S~^S~^xviixvmxixxxxxixxnxxmxxiv廣NHCH2,0~CH2嚴/~CH2HN_/s_/HNNH—CK2H2ONHH2C-NHxxvxxvixxvnxxvraxxx1尸NyHN-CH2戶/~0"-CH2嚴2,0~012xxxuxxxinxxxrvxxxvxxxvixxxvnxxxvm,CH2//~CH2//"0廣NMe，N-CH2,O《eH2C-MMeMeN~^MeN~^O~^MeNJHNNH—CH2H2ONMeH2C-MMeXXXKXLXLIXUIXLDIXLIVXLVXLVIMeN-CH2,CH2,0~CH2「CH2^^^CKt廣CHXLvnxLvraxlixlliun在優(yōu)選實施方案中，所述鏈包含下文所示的連接體之一，更優(yōu)選地，所述連4妻體由下文所示的分子之一組成CH2嚴2/~CH2H2C—CH2H2C~^/H2C—OH2C—O11邁vivnH2CJH2C~/H2CHC:IXLLIUI在更優(yōu)選的實施方案中，所述鏈包含下文所示的連接體之一，更優(yōu)選地，所述連4妻體由下文所示的分子之一組成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage81</formula>連"l妻體構成如上所述的疏水性核芬酸X-Y-Q式中的Y,因此X和Q不是所述連接體的組成部分。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述連接體可以是WO03/052132在"Linker"(連接體)一節(jié)(第54頁，第15行至第58頁第7行)中描述的任何連接體。標i己物在本文中，術語"標記物"因此指其自身或作為;t會測系列的一部分可檢測的基團。報告基團的功能部分的實例有生物素、地高辛、熒光基團(能夠吸收某些波長的電磁輻射，例如光或X省線，然后將吸收的能量以更長波長的射線重新發(fā)射的基團；說明性實例為丹磺?；?5-二甲基氨基)-l-萘磺酰)、DOXYL(N-氧基-4,4-二甲基噁唑烷)、PROXYL(N-氧基-2,2,5,5-四曱基吡咯烷)、TEMPO(N-氧基-2,2,6,6-四-曱基哌啶)、二硝基苯基、吖啶、香豆素、Cy3和Cy5(BiologicalDetectionSystems,Inc.的商標)、藻紅(erytrosine)、香豆酸、傘形酮、TexasRed、羅丹明、四甲基羅丹明、Rox、7-硝基苯并-2-噁-l-二唑(NBD)、芘、熒光素、"量子點"、銪、釕、釤和其它稀土金屬、放射性標記物、化學發(fā)光標記物(可通過在化學反應過程中發(fā)光進行檢測的標記物)、自旋標記物(自由基(例如取代的有機硝基氧)或可通過使用電子自旋共振譜學進行檢測的與生物分子結合的其它順磁探針(例如Cu2+、Mg2+))、酶(如過氧化物酶、堿性磷酸酶、p-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶(glycoseoxidases))、抗原、抗體、半抗原(能夠與抗體結合，但是自身不能啟動免疫響應的類型，如肽類和類固醇激素)、穿透細胞膜的載體系統(tǒng)如脂肪酸殘基、膽固醇的類固醇部分、維生素A、維生素D、維生素E、葉酸、特異性受體的肽，介導胞吞(endocytose)的基團、表皮生長因子(EGF)、緩激肽和血小板源生長因子(PDGF)。人們特別感興趣的實例是生物素、熒光素、TexasRed、羅丹明、二硝基苯、地高辛、釕、銪、Cy5、Cy3等。信號對本發(fā)明的信號對定義為組合在一起能夠產(chǎn)生依賴于物理距離、取向和/或彼此間的相互作用的可測量的變化的兩個部分。優(yōu)選地，信號對由組合在一起能夠產(chǎn)生可檢測的信號的兩部分系統(tǒng)組成，其中所述可檢測信號的變化依賴于所述對的所述部分之間的物理距離。依據(jù)本發(fā)明所述，所述信號對的部分和寡核苷酸類似物的疏水性核苷酸并不相同。因此，優(yōu)選地，當插入本發(fā)明所述寡核苷酸類似物時，所述信號對的部分也不構成與所述疏水性核苷酸相同的結構的部分。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述信號對的至少一個部分，更優(yōu)選地所述信號對的兩個部分都不和國際專利申請WO03/052132中實施例24(第199頁)描述的嵌入假核苷酸Y或實施例14(第184頁)描述的嵌入假核苷酸Y相同。同樣優(yōu)選地，當插入寡核香酸類似物時，所述信號對的部分不構成與國際專利申請WO03/052132中實施例24(第199頁)描述的嵌入假核苷酸Y或實施例14(第184頁)描述的嵌入^f叚核苷酸Y相同的結構的組成部分。產(chǎn)生的信號可以是任何性質，例如所述信號可以是系統(tǒng)熒光或電阻的變化。在優(yōu)選實施方案中，所述信號對能夠根據(jù)所述對的部分之間的距離產(chǎn)生熒光變化。本發(fā)明信號對將根據(jù)所述信號對連接的探針與乾序列雜交與否產(chǎn)生信號變化。因此優(yōu)選地，所述信號對在寡核苷酸類似物中的位置應能使所述信號對的所述部分之間的距離隨著所述寡核苦酸類似物與靶序列的雜交而增加。優(yōu)選地，本發(fā)明所述信號對由位于本發(fā)明所述寡核苷酸類似物相反的兩端的兩個部分組成。更優(yōu)選地，在本發(fā)明實施方案中，所述信號對的至少一個部分位于本發(fā)明所述寡核苷酸類似物的一端，而另一部分位于所述寡核普酸類似物的另一半。更優(yōu)選地，本發(fā)明信號對的兩個部分位于或靠近本發(fā)明所述寡核苷酸類似物相反的兩端。優(yōu)選地，所述信號對的一個部分位于5'端6,如5，例如4,如3,例如2,如1個核苷酸或核苷酸類似物以內。在優(yōu)選實施方案中，所述信號對的部分作為懸掛端被置于5'端。更優(yōu)選地，所述信號對的部分位于寡核苷酸類似物的5'端的二分之一內。更優(yōu)選地，所述信號對的部分位于寡核苷酸類似物的5'端的三分之一內。更優(yōu)選地，所述信號對的部分位于寡核苷酸類似物的5'端的四分之一內。因此，優(yōu)選的距5'端的最大距離可依賴于寡核苷酸類似物的長度。優(yōu)選地，所述信號對的另一部分位于3'端6，如5、例如4、如3,例如2，如1個核苷酸或核苷酸類似物以內。在優(yōu)選實施方案中，所述信號對的部分作為懸掛端被置于3'端。更優(yōu)選地，所述信號對的部分位于寡核苷酸類似物的3'端的二分之一內。更優(yōu)選地，所述信號對的部分位于寡核苷酸類似物的3'端的三分之一內。更優(yōu)選地，所述信號對的部分位于寡核苷酸類似物的3'端的四分之一內。因此，優(yōu)選的距3'端的最大距離可依賴于寡核苷酸類似物的長度。優(yōu)選地，所述信號對的兩個部分均位于上文所示位置。優(yōu)選使用光譜屬性(如熒光)來檢測雜交，例如當執(zhí)行例如定量PCR方法的實時檢測時。因此，優(yōu)選地，所述信號對能夠根據(jù)所述對的部分之間的距離產(chǎn)生光諮屬性，如熒光屬性的變化。熒光基團可以是任何能夠發(fā)熒光的基團，例如(但不限于)，所述焚光基團可選自由以下組成的組熒光素、FITC、羅丹明、麗絲胺羅丹明、羅丹明123、香豆素、CY-2、CY國3、CY3.5、CY-5、CY5.5、FAM、VIC、LIZ、NED、PET、Alexa染料、GFP、YFP、BFP、YO-YO、HEX、JOE、NanoOrange、尼羅紅、OliGreen、OregonGreen、Picogreen、RadiantRed、RiboGreen、ROX、R國藻紅蛋白、SYPRO橙、SYPRO紅、SYPRORuby、TAMRA、TexasRed、XRITC、碘化吡啶、吖咬橙、溴化乙錠、SYBRGold、SYBRGreenI和SYBRGreenII。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，所述信號對由兩個共價連接至包含另外的至少一個疏水性分子寡核苷酸類似物的部分組成，其中所述信號對能夠形成分子內受激子和/或分子內激發(fā)復合體和/或分子內FRET復合體和/或分子內電荷遷移復合體。特別地，當它們靠近時，它們能夠形成分子內受激子和/或分子內激發(fā)復合體和/或分子內FRET復合體和/或分子內電荷遷移復合體。當信號對的部分相距最多100A，優(yōu)選地最多75A、更優(yōu)選地最多50A，甚至更優(yōu)選地最多20A，例如最多10A時，即認為它們是靠近的。不受任何特異性理論的束縛，預期寡核苷酸類似物的構象是動態(tài)的，因此上述距離可視為平均值。本文提到的其它距離也涉及相似考慮。僅當兩個分子的位置彼此相關，以便它們能夠彼此相互作用時，分子部分才能形成受激子、激發(fā)復合體、FRET復合體或電荷遷移復合體。因此，如果有分子部分隔開兩個部分，則信號對將不能形成分子內受激子、分子內激發(fā)復合體、FRET復合體或電荷遷移復合體。此外，可包含至少一個猝滅劑分子的寡核苷酸類似物也包含在本發(fā)明內。本發(fā)明所述猝滅劑分子是能夠在熒光基團附近猝滅熒光的任何分子。猝滅劑可通過從熒光基團吸收能量并將該能量耗散為例如熱量來行使功能。因此，所述熒光基團的信號將減弱或消失。因此，如果將熒光基團和合適的猝滅劑分子置于彼此靠近的位置，熒光基團的熒光將被猝滅。當猝滅劑和焚光基團相距最多IOOA，優(yōu)選地最多75A，更優(yōu)選地最多50A，甚至更優(yōu)選地最多20A，例如最多10A時，即認為它們是靠近的。在本發(fā)明中，術語FRET還涵蓋由熒光團和猝滅劑組成的對。因此，在本發(fā)明中，術語FRET涵蓋兩類信號對熒光團-猝滅劑對(其中能量從熒光團遷移至猝滅劑并以非可見的能量(像熱和/或振動能)發(fā)射)和經(jīng)典的FRET對(其中一部分的能量遷移至另一部分，并以光(其能量低于從一部分遷移至另一部分的能量，更長的波長)的形式發(fā)射)。猝滅劑分子的實例包括但不限于，DABCYL、DABSYLTAMRA、甲基紅、BlackHolequencher-1、BlackHolequencher-2、ElleQuencher和QSY-7。但是所述猝滅劑分子一般必須根據(jù)熒光基團進行選擇。除了信號對之外，本發(fā)明所述寡核苷酸類似物可在一個實施方案中包含一個或多個直接或間接可檢測的標記物。雖然優(yōu)選地信號對的一個部分僅包含一個部分(moiety)，但是信號對的一個部分也可由多于一個部分(moiety)組成。例如，熒光-猝滅劑信號對可由三個部分組成，其中兩個部分彼此相關，以便所述部分組合在一起構成所述信號對的一個部分，而第三個部分構成另一部分。例如，熒光團部分可由US2000/6037130中描述的較短波長的收獲體和較長波長的發(fā)射體構成，另一個實例是可通過WO2005/019812中描述的表面增強拉曼光i脊(SERS)檢測的標記物對，其中所述猝滅劑部分是表面尋求基團和固體表面的復合體，但是也可使用其它組合。信號對的部分一般共價連接至寡核苷酸類似物。信號對的部分可單獨共價連接至主鏈單體單元、核苷酸和/或核苷酸類似物的任何部分(例如，包括主鏈單體單元或核堿基)。優(yōu)選地，信號對的部分單獨共價連接至核苷酸或核苷酸類似物，例如至核苷酸。因此，信號對的部分可單獨連接至主鏈單體單元的核糖部分、至主鏈單體單元的磷酸或至核堿基。信號對的部分可在化學或酶學合成寡核苷酸類似物之前、在合成過程中或在合成之后摻入所述核普酸和/或核苷酸類似物。也可使用任何合適的連"l妄體，如上文所述的任何連接體偶聯(lián)它們。依據(jù)本發(fā)明，信號對的部分優(yōu)選共價插入寡核苷酸類似物。有合適的方法供技術人員使用。熒光受激子、激發(fā)復合體、FRET和電荷遷移受激子是在電子激發(fā)狀態(tài)下結合而在基態(tài)下分離的化合物的二聚體。當單獨的化合物被激發(fā)時，它可以釋放其激發(fā)狀態(tài)，或可與同一類型的另一化合物(未被激發(fā))結合，從而形成受激子。受激子發(fā)射的熒光的波長不同于單體熒光發(fā)射。當受激子釋放其激發(fā)狀態(tài)時，結合將不再有利，兩個物質(species)將分離。激發(fā)復合體是受激子樣的二聚體，其中所述兩種化合物不同。分子內受激子是通過包含在一個分子內的兩個部分，例如同一分子內85的2個聚芳基形成的。相似地，分子內激發(fā)復合體是通過包含在一個分子內的兩個部分，例如通過2個不同的聚芳基形成的。熒光共振能量轉移(FRET)是兩個電子激發(fā)狀態(tài)的染料分子間的距離依賴性相互作用，其中激發(fā)從供體分子遷移至受體分子而不發(fā)射光子。FRET依賴于分子間距離的6次方根，使其可以在與生物大分子的直徑相當?shù)木嚯x應用。優(yōu)選地，供體和受體必須靠近(通常介于10至100A，如介于10至75A,例如介于10至50A，如介于10至20A)，才能發(fā)生FRET。此外，受體的吸收光譜必須與供體的熒光發(fā)射光鐠重疊。進一步優(yōu)選地，供體和受體躍遷偶極矩取向必須大致平行。在本發(fā)明所述的一些方法中，F(xiàn)RET對用于第一個染料發(fā)射的熒光被第二個染料吸收，而僅在紅外區(qū)發(fā)射的情況。這稱為熒光團和猝滅劑對。非FRET熒光團-猝滅劑對也已有介紹(US2000/6150097)，涵蓋不具有顯著大的光鐠重疊來解釋該猝滅劑猝滅程度的猝滅劑對熒光團的猝滅。此非FRET猝滅機制和對也包括在本發(fā)明中。電荷遷移復合體是兩個分子間或分子內部分(稱為電子供體和電子受體)之間的電荷遷移包括微弱的協(xié)同作用的化學復合體。此兩個部分可在躍遷過程中表現(xiàn)出可觀測的電荷遷移吸收帶。實例是苯酚合苯醌，其中笨酚和苯醌分子不是通過正式的化學鍵維持在一起，而是通過所迷化合物的芳環(huán)系統(tǒng)之間的電荷遷移結合在一起。FRET熒光共振能量轉移(FRET)已成為分析核酸的最常用的工具之一。這是因為FRET有助于高通量自動化并且非常敏感，使其成為序列和單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析的選擇方法。此外，它對于探測DNA和RNA結構、動力學和分子間相互作用也非常有用。FRET是兩個電子激發(fā)狀態(tài)的染料分子間的距離依賴性相互作用，其中激發(fā)從一個部分(供體分子)遷移至另一部分(受體分子)而不發(fā)射光子。FRET的效率依賴于所述分子間間距的逆六次方根，使得供體分子和受體分子間的距離非常重要。因此，F(xiàn)RET是研究一系列產(chǎn)生分子間距變化的生物現(xiàn)象的重要技術。能量遷移的效率還依賴于供體和受體分子取向、供體熒光的量子產(chǎn)率、受體的消光系數(shù)和供體發(fā)射與受體吸收之間的光鐠重疊。優(yōu)選地，本發(fā)明所述熒光團-猝滅劑信號對包括但不限于熒光基團幹滅劑FAMTAMRATETTAMRA羅丹明TAMRA香豆素DABCYLEDANSDABCYL熒光素DABCYLLuciferYellowDABCYLEosinDABCYLTAMRADABCYLCy3Blackberryquencher650TAMRABlackberryquencher650TexasRedBlackberryquencher650Cy5Blackberryquencher650Cy5.5Blackberryquencher650ROXBlackberryquencher650AlexaFluor350QSY35AlexaFluor488QSY35AlexaFluor546(JSY35AlexaFluor350DabcylAlexaFluor488DabcylAlexaFluor546DabcylAlexaFluor546QSY7和QSY9AlexaFluor488QSY7和QSY9AlexaFluor555QSY7和QSY9AlexaFluor568QSY21AlexaFluor594QSY21AlexaFluor647QSY21AlexaFluor350BHQ-0PacificBlueBHQ-0MarinaBlueBHQ-0吖啶BHQ-0EdansBH(H香豆素BHQ陽lCy2BHQ陽l丹碌酰BHQ-1Alexa488BHQ-1FAMBHQ-1OregonGreenBHQ-1羅丹明纟錄-XBHQ-1TETBHQ-1Alexa532BHQ-1VICBHQ-1HEXBHQ-1CALflourOrange560BHQ-1Alexa546BHQ-2TAMRABHQ-2羅丹明紅-XBHQ-2CALflourRed590BHQ-2Cy3.5BHQ-2ROXBHQ-2Akxa568BHQ-2CALflourRed610BHQ-288Alexa594BHQ-2CALflourRed635BHQ-2Pulsar650BHQ-2Alexa647BHQ-2Quasar670BHQ-2Cy5BHQ-3Cy5.5BHQ-3優(yōu)選地，本發(fā)明所述經(jīng)典FRET信號對包括Y旦不限于:供體受體熒光素四曱基羅丹明IAEDANS熒光素EDANSDABCYL熒光素熒光素BODIPYFLBODIPYFL熒光素QSY7染料熒光素QSY9染料AlexaFluor350AlexaFluor488AlexaFluor488AlexaFluor546AlexaFluor488AlexaFluor555AlexaFluor488AlexaFluor568AlexaFluor488AlexaFluor594AlexaFluor488AlexaFluor647AlexaFluor546AlexaFluor568AlexaFluor546AlexaFluor594AlexaFluor546AlexaFluor647AlexaFluor555AlexaFluor594AlexaFluor555AlexaFluor647AlexaFluor568AlexaFluor647AlexaFluor594AlexaFluor647"BlackHoleQuencher"、"BHQ"、"Pulsar"、"Quasar"、"CALflourOrange"和"CALflourRed"是BiosearchTechnologies,Inc.的商標，OregonGreen是MolecularProbes,Inc.6々商才示，"BlackBerry"是Berry&Associates，Inc.的商標，"Cy2"、"Cy3.5"、"Cy5"和"Cy5.5"是AmershamBiosciencesLimited的商標。"TexasRed"是MolecularProbes的注冊商標。"ROX"和"TAMRA"是AppliedBiosystems,Inc.的商標。特別地，本發(fā)明所述寡核苷酸和/或寡核苷酸類似物可包含F(xiàn)RET對。供體基團可作為懸掛端被置于5'端、3'端或兩端。同樣優(yōu)選地，至少一個受體分子連接為懸掛端。受體分子可作為懸掛端被置于5'端、3'端或兩端。優(yōu)選地，供體基團或受體基團作為懸掛端被置于寡核苷酸類似物的5'端。此外，如果供體基團作為懸掛端被置于5'端，優(yōu)選地，受體基團位于內部或3'端。反之亦然，如果受體分子作為懸桂端被置于寡核苷酸類似物的5'端，則供體分子位于內部或3'端。因此，供體基團和受體分子的位置彼此相關(彼此相互作用)，以便當分開兩個部分的序列未雜交時，受體分子能夠接受儉本基團的激發(fā)或部分激發(fā)，但是當分開兩個部分的序列與靶核酸雜交時，則不能接受供體基團的激發(fā)。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案提供包含信號對和至少一個疏水性分子的探針，其中所述疏水性分子有助于改進所述探針的信噪比(與相應不包含所述疏水性分子的探針相比)。因此，本發(fā)明優(yōu)選的實施方案提供包含信號對和至少一個疏水性分子(如疏水性核普酸)的寡核普酸類似物(無莖信標)，其中所述無莖信標將進行自體雜交(至少部分是由于疏水性相互作用)，除非在雜交條件下接觸完全互補靶。本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案提供包含熒光團、相應的醉滅劑和至少一個疏水性分子(如疏水性核香酸)的寡核苷酸類似物(無莖信標)，當探針未結合時，與相應不包含所述疏水性分子的探針的背景信號相比，所述疏水性分子有助于所述猝滅劑分子更好地猝滅所述熒光基團(更低的背景)。本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案提供包含熒光團、相應的猝滅劑和至少兩個疏水性分子(如疏水性核普酸)的寡核苷酸類似物，當探針未結合時，與相應不包含所述疏水性分子的探針的背景信號相比，所述疏水性分子有助于所述猝滅劑分子更好地猝滅所述焚光基團(更低的背景)。例如，上述屬性可通過選擇合適的疏水性核香酸位置實現(xiàn)(更多詳情請參見下文)。因此，本發(fā)明優(yōu)選的實施方案提供包含至少兩個疏水性分子(如疏水性核苷酸)和信號對的寡核苷酸類似物，其中所述信號對的光謙屬性根據(jù)與乾核酸的雜交或因為把核酸的擴增而變化。在優(yōu)選實施方案中，當沒有或有少量乾核酸時，光譜信號低，當存在較大量的乾核酸時，信號高。當用于乾序列的擴增反應過程(例如通過PCR)時，優(yōu)選地，光譜信號隨所述乾核酸序列的增加而增加。因此，優(yōu)選提供包含被第三序列隔開的第一序列和第二序列的寡核苷酸類似物，依據(jù)本發(fā)明，其中第一序列和第三序列各包含至少一個疏水性分子(如疏水性核苷酸)，其中所述第一序列與第二序列自體雜交時，光i^f言號低，當它們未雜交時高。下列情形也包含在本發(fā)明內所述第一序列可包含例如FRET、受激子或激發(fā)復合體等供體，而所述第二序列可包含例如FRET、受激子或激發(fā)復合體等受體，或反之亦然。優(yōu)選所述供體和所述受體的位置為當所述第一序列與所述第二序列自體雜交時，可發(fā)生FRET，因此，僅當所述第一序列與所述第二序列雜交時才可^r測FRET熒光。此外，構成雙鏈核酸和/或核酸類似物(例如DNA)的核苷酸或核苷酸類似物延伸產(chǎn)物的雜交或形成也可使用與所述寡核苷酸和/或寡核苷酸類似物不直接相關的標記物和任選地啟動所述延伸使用的寡核苷酸進行檢測。在一個實施方案中，此標記物可選自但不限于由以下組成的組碘化吡啶、吖咬橙、溴化乙錠、LCGreen、SYBRGold、SYBRGreenI和SYBRGreenII。熒光基團的熒光屬性可根據(jù)緩沖液條件和物理因素進行調節(jié)。例91如，溫度、離子強度和pH參數(shù)可影響獲得的特定熒光團的熒光信號強度。已知也影響芘受激子的熒光的具有不同化學基團的物質的實例是親脂表面活性劑分子，參見第5,466,578號美國專利。這些作者教導，包含連接^灰鏈的季銨鹽的陽離子表面活性劑亞群，像例如十六烷基三曱基溴化銨可以用于顯著增加使用芘受激子標記的寡核苷酸端的信號。由于表面活性劑對特別是芘的二聚體(或更高階)復合體的熒光強度的正效應可能是因為表面活性劑分子從所述二聚體置換了水分子，導致猝滅熒光，其它親脂分子對熒光強度可具有相似的效應。標準分析緩沖液中經(jīng)常使用親脂基團和可以從嵌入劑二聚體置換水的其它分子。已顯示影響熒光強度的此類分子的實例有TritonX-IOO、十二烷基硫酸鈉、甘油和DMSO。信噪比本發(fā)明所述信噪比定義為所有或幾乎所有本發(fā)明所述的寡核苷酸類似物都與同源互補靶核酸雜交時的信號強度(正信號)除以等量的所述寡核苷酸類似物未雜交時的信號強度(與完全互補靶核酸，背景信號)。信噪比=與同源互補靶序列結合時的信號未結合(與同源互補耙序列)時的信號信噪比=正信號/背景信號因此，背景信號是例如當不存在乾核酸時，當本發(fā)明所述包含至少一個疏水性分子和信號對的核苷酸類似物自體雜交時，或當兩個本發(fā)明所述核苷酸類似物互相雜交但是未與其乾核酸雜交時。一些信號對在它們強烈相互作用(在未結合探針中)時具有低信號，在它們未強烈相互作用(在雜交探針中)時具有高信號，而其它信號對在所迷信號對的兩個部分強烈相互作用時具有高信號，在未強烈相互作用時具有低信號。因此，很顯然，取決于探針中使用的信號，正信號可顯著高于或低于背景信號。因為信噪比為1表示無論探針雜交與否，信號都是相同的，優(yōu)選地，信噪比應盡可能遠離1。"信噪比顯著高于或顯著低于相應的不包含至少一個疏水性基團的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的信噪比"意指，如果相應的不包含所述至少一個疏水性基團的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的信噪比高于1，則包含信號對和至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核香酸類似物具有更高的信噪比，如果相應的不包含至少一個疏水性基團的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的信噪比低于1,則包含信號對和至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物具有更低的信噪比。更高或更低的信噪比也可描述為"信噪比距值1更遠"或"與值1的差別更大"或"得到改進"。如果當寡核苷酸類似物(例如無莖信標)未與靶序列結合時，信號對的兩個部分彼此猝滅(例如，如果信號對由熒光團和猝滅劑組成)，則本發(fā)明所述無莖信標的信噪比應高于相應的不包含至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸類似物。如果無莖信標未與乾序列結合時信號對兩個部分的信號增強(例如，如果所述信號對由兩個熒光團的經(jīng)典FRET對組成)，則本發(fā)明所述無莖信標的信噪比應低于相應的不包含至少一個疏水性分子的寡核普酸或寡核苷酸類似物。因此，本發(fā)明優(yōu)選的實施方案提供包含信號對和至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物，其信噪比顯著比相應的不包含所述至少一個疏水性基團的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的信噪比更遠離值1。本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案提供包含信號對和至少兩個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物，其信噪比顯著比相應的不包含所述至少兩個疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的信噪比更遠離值1。在一個實施方案中，信噪比是通過確定將本發(fā)明所述寡核苷酸類似物與耙核酸在低溫和高溫下孵育后的信號，然后將低溫下獲得的信號除以在高溫下獲得的信號而確定的。所述低溫應低于寡核香酸類似物和其靶序列的雜種的熔解溫度，例如在15。C至8(TC范圍內，如在15。C至50。C范圍內，例如在5(TC至8(TC范圍內，例如在25。C至70。C范圍內，優(yōu)選在15至40。C范圍內，如在25至35。C范圍內。所述高溫應高于寡核香酸類似物和其乾序列的雜種的熔解溫度，例如在50。C至95。C范圍內，如在60。C至95。C范圍內，例如在65。C至90。C范圍內。93當使用此方式確定信噪比并且信號高于背景信號時，則信噪比優(yōu)選為至少4.5、如至少5.0、例如至少5.5、如至少5.8。在優(yōu)選實施方案中，信噪比按下文實施例2或實施例10中描述的方法確定。在信號低于背景信號的實施方案中，信噪比例如低于0.75，如低于0.5，例如4氐于0.25。固體支持物優(yōu)選實施方案將本發(fā)明所述無莖信標偶聯(lián)至固體支持物，或可選地，使用所述無莖信標檢測偶聯(lián)至固體支持物的核酸或核酸類似物。然后即可通過將所述固體支持物從所述混合物中分離或通過洗去未結合的材料，將與核酸或核酸類似物雜交的所述無莖信標從所述混合物中分離。取決于所需的結果，有許多不同類型的固體支持物適合用于所述方法。在一個實施方案中，固體支持物是活化的表面?；罨谋砻嬗兄诠押塑账峄蚬押塑账犷愃莆锱c固體支持物的偶聯(lián)。例如，固體支持物可選自由磁珠、鋁珠、瓊脂糖珠、瓊脂糖凝膠珠(sepharosebeads)、3皮璃、塑并+表面、重金屬和芯片表面(chipsurfaces)組成的組。磁珠包括包含允許使用磁鐵從懸浮液中分離所述珠的磁性物質的珠。鋁珠包括允許識別所述珠的標條形碼的珠。但是本發(fā)明也可使用其它標碼和未標碼的珠。瓊脂糖珠和瓊脂糖凝膠珠可例如通過離心或過濾從懸浮液中分離。塑料表面包括例如微滴定板或可適合用于例如診斷的其它塑料設備。芯片表面可由任何合適的材料制成，例如玻璃、樹脂、金屬、覆有聚合物涂層的玻璃、覆有金屬涂層的玻璃和覆有金屬涂層的樹脂。還可以應用SPR(表面等離子體共振)傳感器板，參見第11-332595號日本專利臨時公布。也可應用CCD,參見JVMdez'cA^fe1994，第22巻，第9411期，2124-2125。芯片表面包括玻璃板上的纖維素和小聚丙烯酰胺凝膠，寡核苷酸或寡核苷酸類似物可通過聚丙烯酰胺和寡核苷酸之間的共價或非共價鍵固定至該表面(Yershov，G.等(1996)Prac.A^/.爿cad0&4，94:4913)。芯片表面還可以是如Sosnowski，R.G.等(1997)Proc.XcaJ.WSL4，94:1119-1123所述的硅芯片。此類芯片通過包含如下步驟的程序制備將微電極陣列置于硅芯片上，在所迷微電極上形成包含鏈霉親和素的瓊脂糖層，和通過使瓊脂糖層帶正電將生物素修飾的DNA片段連接至所述瓊脂糖層。此夕卜，芯片表面的制備可參見Schena，M.等(1996)Prac.A^/.乂cadt/&4，93:10614-10619，其中方法包含如下步驟用SSC(即標準氯化鈉-檸檬酸緩沖溶液)制備氨基修飾的PCR產(chǎn)物的懸浮液，將所述懸浮液點樣至載玻片，孵育點樣后的栽玻片，使用硼氬化鈉處理孵育后的載玻片，然后加熱處理后的載玻片。此外，也可使用含有固體材料的柱子。包含疏水性分子或疏水性核香酸的核苦酸任何部分和/或偶聯(lián)至其自身的主鏈單體單元。疏水性分子可在化學或酶學合成探針之前、在合成過程中或在合成之后摻入所述核苷酸和/或核苷酸類似物和/或主鏈單體單元。所述疏水性分子可以直接偶聯(lián)至核香酸和/或核苷酸類似物和/或主鏈單體單元或通過使用任何合適的連接體。但是，如上文所述，優(yōu)選地，所述疏水性分子連接至主鏈單體單元，任選地通過連接體，其中所述主鏈單體單元和所述連接體均不包含核堿基。本發(fā)明的一個方面提供包含至少一個疏水性核普酸類似物的寡核香酸類似物，其中所述疏水性核苷酸類似物具有通用結構X-Y-Q其中X是核苷酸或核苷酸類似物或能夠摻入核酸或核酸類似物主鏈的主鏈單體單元，Q是本發(fā)明所述疏水性分子；和Y是連接所述核苷酸或核苦酸類似物或主鏈單體單元和所述疏水性分子的連接體部分。術語"摻入核酸或核酸類似物的主鏈"意指所述疏水性核苷酸可插入核酸和/或核酸類似物的序列。本發(fā)明更優(yōu)選的方面，所述包含至少一個疏水性核苷酸類似物的寡核苦酸類似物能夠通過化學方法合成。更優(yōu)選地，所述包含至少一個疏水性核苷酸類似物的寡核苷酸類似物能夠通過使用本領域技術人員已知的化學反應在白動化DNA合成儀上合成。本發(fā)明的許多實施方案優(yōu)選提供包含至少兩個疏水性核苷酸類似物的寡核苷酸類似物，其中所述疏水性核苷酸類似物具有通用結構X-Y-Q其中X是核苷酸或核苷酸類似物或能夠摻入核酸或核酸類似物主鏈的主鏈單體單元，Q是本發(fā)明所述疏水性分子；和Y是連"J妻所述核苷酸或核普酸類似物或主鏈單體單元和所述疏水性分子的連接體部分。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述寡核普酸類似物(如無莖信標)中的插入疏水性核苷酸不顯著降低與乾核酸的結合。許多此類修飾對本領域技術人員為已知。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明疏水性核苷酸類似物由下列核苷酸構件(build)之一組成核脊酸的核糖環(huán)2'位置的修飾，如上文所述，已被顯示增加了對靶核酸的親合性(Yamana等(1991)T^ra/z^ra"/e".6347-6350)和/或連接至其自身的主鏈單體單元的嵌入劑(Chris-tensen等96&wwc/eZcoc她23:207-225》在優(yōu)選實施方案中，主鏈單體單元X能夠形成與寡核苷酸或寡核苷酸類似物結合的磷酸二酯或磷酸二酯類似物。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述疏水性核苷酸可例如是國際專利申請WO03/052132在第64至115頁中描述的結構1至347的任何嵌入劑假核苷酸。取決于疏水性核苷酸的性質，有不同的生產(chǎn)方法可供技術人員使用。例如，疏水性核普酸可按與制備國際專利申請WO03/052132在"Preparationofintercalatorpseudonucleotides"(制備嵌入劑*￡核苷酸)一節(jié)(第115頁，第14行至第121頁，第30行)中描述的嵌入劑假核苷酸相似的方式制備。對于所述疏水性分子不是嵌入劑的情形，技術人員將能夠對所述方案進行適當?shù)男拚?。包含疏水性基團的寡核普酸類似物本發(fā)明的目標是提供包含至少一個疏水性分子和信號對的寡核苷酸類似物，其中當所述寡核苷酸類似物由未與乾核酸雜交變?yōu)榕c乾核酸雜交或相反時，所述寡核苷酸類似物的信號的變化顯著高于相應的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸類似物(由與所述寡核苷酸類似物相同的核苷酸序列組成)和所述耙核酸之間的雜種(相應的雜種)的信號的變化。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明寡核苷酸類似物包含n個核苷酸和/或核苷酸類似物，其中n是至少為4的整數(shù)。優(yōu)選地，n至少為5，更優(yōu)選地至少為6,甚至更優(yōu)選地至少為7。例如n可以是4至100范圍內，如5至90范圍內，例如7至100范圍內，如7至80范圍內，例如7至60范圍內，如7至40范圍內，例如7至30范圍內，如7至20范圍內，例如15至50范圍內的整數(shù)。在一個實施方案中，寡核苷酸類似物可包含l至IOO個核堿基或核威基類似物，如5至40個核威基或核威基類似物，例如5至30個核堿基或核堿基類似物，如5至25個核威基或核堿基類似物，例如5至20個核堿基或核堿基類似物。更優(yōu)選地，本發(fā)明寡核苷酸類似物包含例如6至25個核堿基或核堿基類似物以及至少一個疏水性分子和信號對。97在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明寡核苷酸類似物包含例如6至25個核堿基或核威基類似物以及2至6個疏水性分子和信號對。疏水性分子可置于給定寡核苷酸或寡核普酸類似物內任何需要的位置。例如，疏水性分子可置于寡核苷酸類似物的末端或疏水性分子可置于寡核苷酸類似物的內部位置。優(yōu)選地，所述疏水性核香酸位于距一端最多9,如最多8，例如最多7,如最多6個核苷酸和/或核苷酸類似物的位置。優(yōu)選地，信號對的任一部分分別比疏水性核苷酸更靠近5'端和3'端。因此，疏水性核普酸優(yōu)選比信號對的任一部分具有更中央的位置。優(yōu)選地，信號對的任何部分相對任何疏水性核苷酸放置，其放置方式使得至少1,例如2,如3，例如4，如5,例如大于5，如1至10，優(yōu)選地1至8，如1至6，例如2至6個核苷紛核苷酸類似物將信號對的任何部分和任何疏水性核苷酸隔開。在優(yōu)選實施方案(embodent)中，所迷寡核苷酸類似物包含1至5，如5至IO,如10至15，例如15至20個疏水性核苷酸。非常優(yōu)選地，所述寡核芬酸類似物包含至少2,例如2至5個疏水性核香酸。寡核苷酸類似物的疏水性分子可相對彼此置于任何位置。例如它們可彼此臨近，或它們之間可有1，如2,例如3,如4,例如5，如大于5個核苷酸分開所述疏水性分子。但是優(yōu)選地，所有疏水性核苷酸被至少1個不是疏水性核苷酸的核普酸或核苷酸類似物分開。在所述寡核苷酸類似物包含至少2個疏水性核苷酸的實施方案中，優(yōu)選它們位于所述寡核苷酸類似物相反的兩半側。因此優(yōu)選一個疏水性核苷酸位于所述寡核苷酸類似物的5'端半側內，而另一疏水性核苦酸位于所迷寡核苷酸類似物的3'端半側內。優(yōu)選地，至少兩個，優(yōu)選所有疏水性核苷酸位于if巨一端最多9,如最多8，例如最多7，如最多6個核苷酸和/或核苷酸類似物的位置。更優(yōu)選地，至少兩個疏水性核苷酸位于相反的兩半側，并且距各自最近的端最多9，如最多8，例如最多7，如最多6個核普酸和/或核苷酸類似物內。因此，優(yōu)選的距端最遠的距離可依賴于寡核苷酸類似物的長度。此外還優(yōu)選所述信號對的任一部分位于比至少1，更優(yōu)選地至少2，例如所有疏水性核苷酸更靠近5'端和3'端的位置。因此，至少1,優(yōu)選地至少2，例如所有疏水性核苷酸優(yōu)選具有比所述信號對的任一部分更中央的位置。在本發(fā)明非常優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸類似物包含至少兩個疏水性核苷酸，并且所述至少兩個疏水性核苷酸對稱地置于所述寡核苷酸類似物內。因此，優(yōu)選地所述至少兩個疏水性核苷酸位于距信號對相應的部分大致相同的距離，更優(yōu)選地相同的距離。在另一個實施方案中，優(yōu)選地所述至少兩個疏水性核苷酸位于距寡核苷酸類似物中央大致相同的距離，更優(yōu)選地相同的距離。本文中"大致相同的距離"指距離相同數(shù)量的核苷酸和/或核苷酸類似物+/-1個核苷酸或核苷酸類似物。在所述寡核苷酸類似物包含大于3個疏水性核苷酸的實施方案中，優(yōu)選地，每對疏水性核苷酸位于距信號對的相應部分大致相同的距離，更優(yōu)選地相同的距離，或距寡核苷酸類似物中央大致相同的距離，更優(yōu)選地相同的-巨離。當所述寡核苷酸類似物包含大于一個疏水性分子時，在本發(fā)明優(yōu)選的方面，至少一個所述疏水性分子的位置將確保，當所述寡核苷酸類似物由未與乾核酸雜交變?yōu)榕c乾核酸雜交或相反時，所述寡核苷酸類似物的信號變化顯著高于相應的不包含所述疏水性分子的雜種的信號變化。更優(yōu)選地，所述寡核苷酸類似物的兩半側各置有至少一個所述疏水性核苷酸類似物。在一個優(yōu)選實施方案中，位于具有兩部分信號對，3'和5'端分別有一個部分的寡核香酸類似物內的第一個疏水性分子被置于靠近3'-端的位置，而第二個疏水性分子^f皮置于靠近5'-端的位置，即它們可以被置于它們在所述寡核苷酸類似物各自端的任何位置，并且任選地包含一皮置于任何位置的第三個、第四個、第五個或更多疏水性分子。所述疏水性核苷酸類似物可獨立位于鄰近信號對的部分，例如有一個核香酸，如兩個核99苷酸，例如3個核芬酸，如4個核香酸，例如5個核苷酸，如6個核苷酸，例如7個核苷酸，如8個核苷酸，例如9個核苷酸，如10個核苷酸，例如0至10個核香酸分開所迷疏水性核香酸類似物和最近的信號對的部分。更優(yōu)選地，所有疏水性分子的放置方式使得，當所述寡核苷酸類似物由未與靶核酸雜交變?yōu)榕c靶核酸雜交或相反時，包含所迷疏水性分子的寡核苷酸類似物的信號變化顯著高于相應的不包含所述疏水性分子的雜種的信號變化。因此在本發(fā)明的一個方面，疏水性分子的位置與其它疏水性分子和包含在相同寡核苷酸類似物內的信號對的部分有關。因此本發(fā)明優(yōu)選的實施方案提供包含兩部分信號對(其中每個部分位于所述寡核苦酸類似物的一端)和兩個本發(fā)明所述疏水性分子(所述寡核普酸類似物的每半側各有一個)的寡核苷酸類似物，其中所述疏水性分子距最近的所述信號對的部分的距離等于或大致等于另一個疏水性分子距所述信號對的另一部分的距離。本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案提供包含兩部分信號對(其中每個部分位于所述寡核苷酸類似物的一端)和至少本發(fā)明所述兩個疏水性分子的寡核苷酸類似物，其中所有疏水性分子的位置彼此相關，以致于當探針未結合時，所有疏水性分子將與至少一個其它疏水性分子發(fā)生疏水性相互作用，而此疏水性相互作用將使所迷信號對的兩個部分靠近。例如，上述屬性可通過按上文所述方式放置疏水性核苷酸實現(xiàn)。在本發(fā)明的一些實施方案中，優(yōu)選地，至少有一個核苷酸或核苷酸類似物將疏水性核普酸類似物與同一寡核苷酸類似物序列中的所有其它疏水性核香酸類似物分開。這是因為這樣一個事實，如果在寡核苷酸的小區(qū)域內的疏水性分子濃度太高，則傾向于降低與把序列的親合性。因為一些疏水性分子(尤其是具有接合7T-電子的但是也包括其它的疏水性分子)能夠通過類似FRET或非FRET的碰撞機制猝滅焚光團的熒光,所以更優(yōu)選地，至少有1，例如2，如3個核苷酸或核香酸類似物將所述疏水性核苷酸與所有其它疏水性核普酸分開和與所述信號對的任何部分100分開。這樣就最大限度地減少了所述疏水性分子的猝滅和親合性的降低。寡核苷酸類似物可包含任何類型的核苷酸和/或核苷酸類似物，如上文所述的核苷酸和/或核苷酸類似物。因此，寡核苷酸類似物可包含選自由以下組成的組的一個或多個DNA、RNA、PNA、同源DNA、b-D-吡喃阿卓糖基(Al加pyranosyl)-NA、b-D-吡喃葡萄糖基-NA、b-D-Mopyranusyl-NA、HNA、麗A、ANA、LNA、CNA、CeNA、TNA、(2'-NH)-TNA、(3'-NH)-TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、卩-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、雙環(huán)-DNA、6-氨基-雙環(huán)-DNA、5誦表-雙環(huán)-DNA、a-雙環(huán)-DNA、三環(huán)-DNA、雙環(huán)[4.3.0]-DNA、雙環(huán)[3.2.1]-DNA、雙環(huán)[4.3.0酰胺-DNA、P-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃來蘇糖基-NA、2'-R-RNA、2'-0R-RNA、a-L-RNA、a-D-RNA、卩-D-RNA的亞基和其混合物。因為疏水性分子不易溶解于水，而本發(fā)明所述雜交和/或測量將在水溶液中進行，所以可包含在無莖信標中的疏水性分子的數(shù)量存在上限。因此本發(fā)明優(yōu)選的實施方案提供易溶解于分析中使用的水相緩沖液的包含至少一個本發(fā)明所述疏水性基團的寡核苷酸類似物。本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案提供其中本發(fā)明所述疏水性核苷酸的數(shù)量最多為核堿基數(shù)量的50%的寡核苷酸類似物。這意味著，對于所述寡核苷酸類^f以物中存在的每兩個核威基，寡核普酸類似物中最多可以有一個本發(fā)明所述疏水性核苷酸。本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案提供其中本發(fā)明所述疏水性基團的數(shù)量最多為所述寡核苷酸類似物核威基數(shù)量的例如5%至50%，如5%至45%，例如10%至45%,如12%至45%的寡核苷酸類似物。在水中的溶解度依賴于所述疏水性分子的疏水性。如果所述疏水性分子為芘，優(yōu)選地，寡核苷酸類似物在每3個核苦^/核普酸類似物中包含最多1個疏水性核苷酸。如果所述疏水性分子的疏水性大于芘(即具有更高的logP值)，優(yōu)選地，寡核苷酸類似物在每4個核苷酸/核普酸類似物中包含最多1個疏水性核苷酸。如果所述疏水性分子的疏水性小于芘(即具有更低的logP值)，優(yōu)選地，寡核苷酸類似物在每2個核苷^/核苷酸類似物中包含最多1個疏水性核苷酸。但是在我們引入疏水性分子時，重要的一點是本發(fā)明的無莖信標可溶于水溶液，優(yōu)選主鏈單體單元在插入所述無莖信標的寡核苷酸類似物后帶電荷。因此在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述寡核芬酸類似物的主鏈單體單元選自具有帶電荷的主鏈的主鏈單體單元組，如DNA、RNA、HNA、畫A、ANA、LNA、CNA、CeNA、TNA、(2'-NH)-TNA、(3'國NH)-TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、卩-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、雙環(huán)-DNA、6-^J^-雙環(huán)-DNA、5-表-雙環(huán)-DNA、a-雙環(huán)-DNA、三環(huán)-DNA、雙環(huán)[4.3.0]-DNA、雙環(huán)[3.2.1]-DNA、雙環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA、P-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃來蘇糖基-NA、2'-R-RNA、a-L-RNA或a-D-RNA、P-D-RNA和其混合物和其雜種，以及其磷原子修飾，尤其是讓所述主鏈帶電荷的修飾。本發(fā)明無莖信標特別適合在封閉管分析(也叫做同質性分析)中檢測、鑒定和定量乾序列。這還包括不對稱和竟爭性PCR分析、以及包含PCR開放劑、封閉劑的分析和許多其它修飾性PCR分析。此外，由于本文提出的一些無莖信標具有核酸酶抗性，因此它們也特別適合在細胞、組織或生物體(無論存活與否)中檢測、鑒定和定量乾序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明還涉及適合檢測、鑒定或定量目標乾序列的包含兩個或多個支持物結合的無莖信標的陣列。無莖信標非常方便，因為它們提供了快速詢問大量目標樣品而無需使用另一檢測系統(tǒng)的方法。合成核酸對耙核酸的高親合性可大大促進檢測分析，此外，對耙核酸具有高親合性的合成核酸可用于許多其它用途，如基因打靶和核酸純化。已顯示包含疏水性基團的寡核苷酸類似物在一些情形下增加對同源互補核酸的親合性。一些本發(fā)明所述寡核苷酸類似物的優(yōu)點是，由包含至少一個疏水性分子的寡核苷酸類似物和基本互補的DNA組成的雜種(DNA雜種)的熔解溫度可以顯著高于由所述基本互補的DNA和與其互補的DNA組成的雙鏈體的熔解溫度。102因此，本發(fā)明所述寡核苷酸類似物可以比天然存在的核酸更高的親合性與DNA形成雜種。熔解溫度優(yōu)選增加1至30°C，例如5至2CTC,如10"C至15°C，例如2。C至5°C，如5t:至l(TC，如15。C至2(TC,例如20°C至25X:,如25。C至3(TC，例如高于30。C。在本發(fā)明另一個實施方案中，包含一個或多個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物可形成三鏈結構(三鏈體結構)，該三鏈結構由所述寡核苷酸類似物通過Hoogstein或反式Hoogstein磁基對與同源互補的核酸或核酸類似物或寡核苷酸或寡核苷酸類似物結合組成。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，所迷寡核苷酸類似物可增加所述三鏈體結構中所述Hoogstein堿基對的熔解溫度。在本發(fā)明另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸類似物可增加所述三鏈體結構中所述Hoogstein堿基對的熔解溫度，此增加不依賴于特異性序列約束(restraints)，像富含嘌呤、富含嘧咬的核酸或核酸類似物雙鏈體乾序列的存在。因此，如果所述寡核苷酸或寡核香酸類似物不含疏水性分子，則所述三鏈體結構中所述Hoogstein堿基對的熔解溫度顯著高于所述Hooogstein堿基對與所述雙鏈體耙的熔解溫度。因此，本發(fā)明所述寡核苷酸類似物可以比天然存在的核酸更高的親合性與同源互補核酸或核酸類似物或寡核苷酸或寡核苦酸類似物形成三鏈體結構。熔解溫度優(yōu)選增加2至5(TC，如2至40。C,如2至30。C，例如5至2(TC，如1(TC至15。C，例如2。C至5。C，如5。C至1(TC，例如l(TC至15°C，如15。C至20。C，例如20。C至25。C，如25。C至30。C,例如30。C至35X:，如大于35"C。三鏈體形成可涉及或不涉及鏈侵入，鏈侵入是Hoogstein堿基配對的第三條鏈侵入靶雙鏈體并置換部分或完整的相同鏈，以與互補鏈形成沃森-克里克堿基對的過程。這可開發(fā)用于多種用途。如果寡核苷酸類似物用于檢測多態(tài)性位點，優(yōu)選地，所述多態(tài)性位點位于所述寡核苷酸類似物的中央，優(yōu)選位于所述寡核苷酸類似物最中央的10，如8，例如6，如4個核普酸和/或核苷酸類似物內。多重分析(MultiDlexing)檢測、鑒定或定量乾序列時通常最好收到正信號。研究人員通常最愛問"樣品中存在哪些基因型？"，而不是僅問"樣品中存在基因型A嗎？"，因此在實驗中包括恰當?shù)膶φ辗浅Ｖ匾?。例如，定量反應的對照可以是定量一個或多個管家基因。同樣地，突變特異性^^針的對照可以是野生型特異性探針。如果可以在分析中在相同的反應容器中加入對照，則可確保對照和分析的(至少大多數(shù))條件相同，和因此通常比運行平行實驗有利。當分析中包括多于一個實驗時，即被稱為多重分析。探針的特異性也非常依賴于錯配的性質。SantaLucia證實穩(wěn)定性降低順序存在明確的趨勢"G-C">"A-T">"G.G">"G.T"2"G.A">"T.T"^"A.A，，>"T.C"2"A.C"2"C.C"，表明"G，，是最混雜的核減基，因為它形成了最強的威基對和最強的錯配(SantaLucia&Hicks(2004)爿""m.iev.萬zo//^s.說cww/.33:415-440)。另一方面，"C，，是最有識別力的核堿基，因為它形成了最強的威基對和在"A"之后三個最弱的錯配。因此單個核苷酸的特異性順序如下"C">"A"〉"T">"G"。如上文所述，DNA的曱基化狀態(tài)在亞硫酸氫鹽轉化的DNA的一條鏈上被翻譯為"C"/"T"錯配，相反地，在PCR擴增轉化的DNA之后，在互補鏈上被翻譯為"G"/"A"錯配，許多突變也是"C"到"T"的轉變。因此，如果一個探針(例如曱基化DNA特異的)在多態(tài)性位點包含高選擇性的"C"堿基，而另一探針(未甲基化DNA特異的)在多態(tài)性位點包含"A"，則這樣的組合是最有識別力的。同時這是最有效的，它意味著所述的兩個探針將是彼此高度同源的。適當設計的本發(fā)明所述寡核苷酸類似物與其完全互補DNA靶的結合要強于與非完全互補探針與另一遺傳變異體的結合。包含疏水性分子的寡核香酸類似物對被置于一個探針中，這樣如果要雜交的同源互補(但是不完全互補)探針非常適合此應用，它們將靠近另一探針的疏水性分子(參見圖5)。因此本發(fā)明實施方案提供加至同一分析容器的每個均包含本發(fā)明所述至少一個疏水性分子(如疏水性核苷酸)和信號對的至少兩個寡核普酸類似物，其中所述至少兩個寡核苷酸類似物分別與不同的把序列互補。所104述乾序列可以是把序列和其突變體序列。本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案提供至少兩個包含本發(fā)明所述至少一個疏水性分子(如疏水性核苷酸)和信號對的寡核香酸類似物，該寡核苷酸類似物能夠區(qū)分靶核酸或耙核酸類似物和至少一個已知的其突變體序列。所述靶序列和所述已知的突變體序列之間的變異可以是突變、甲基化狀態(tài)、缺失、插入或相似的小變化。在本發(fā)明的一個方面，無莖信標上標記對的信號，如果在相同分析容器中使用，可以彼此區(qū)分開來，而在其它實施方案中，其它物理差異(像熔解溫度或物理點樣)可以用于區(qū)分寡核苷酸類似物(如無莖信標)。本發(fā)明的另一方面在一個管中使用一組共同的引物組對兩個或多個寡核苷酸類似物(如無莖信標)進行多重分析。許多更新的實時PCR儀器上可以進行更高復雜性的多重分析，其中一次最多可以測量5或6個不同的熒光團。本發(fā)明所述寡核苷酸類似物(如無莖信標)的多重分析比使用大多數(shù)其它技術都更加簡單，首先是因為本發(fā)明寡核香酸類似物(如無莖信標)由于缺乏"莖"區(qū)而比普通的分子信標更短，降低了非特異性雜交的風險，此外是因為在序列內加入疏水性分子會降低序列充當非特異性才莫板而允許亂真引物延伸的風險。因此本發(fā)明優(yōu)選的實施方案還提供至少兩個能夠區(qū)分包含一個多態(tài)性位點的序列，均包含本發(fā)明所述至少一個疏水性分子(如疏水性核普酸)和信號對的寡核苷酸類似物。其中所述寡核普酸類似物參加擴增反應過程。所述擴增反應優(yōu)先在"封閉管"中進行。本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案提供能夠區(qū)分把序列和所述靶序列的單點突變，均包含本發(fā)明所述至少一個疏水性分子和信號對的兩個寡核苷酸類似物，其中所述寡核苷酸類似物參加擴增反應過程并和所述擴增序列相應的鏈同源互補。所述擴增反應優(yōu)先在"封閉管"中進行。如果所述突變是甲基化差異，"C"至"T","T"至"C"，"A"至"G"或"G"至"A"轉變，則最優(yōu)選地，一個無莖信標在所述多態(tài)性位點包含高選擇性的"C"堿基，而另一探針在所述多態(tài)性位點包含"A"。其它方法和分析條件通過雜交確定存在、鑒定和定量本發(fā)明所述靶序列和/或突變體序列的存在、鑒定和定量可通過雜交特異性信號的強度或存在與否而確定。可通過本領域公知的任何方法確定雜交程度。如果沒有可檢測的雜交，則雜交程度即被視為0。本發(fā)明所述寡核苷酸類似物包含可用于直接檢測雜交的疏水性部分和信號對?？捎米鳈z測存在、鑒定和/或定量的探針的寡核苷酸類似物應能夠與其靶核酸和/或核酸類似物發(fā)生特異性相互作用。區(qū)分靶序列和突變體序列時，熔解溫度或親合溫度的差異是可以普遍使用的參數(shù)。使用此策略時，包含本發(fā)明所述至少一個疏水性分子和信號對的寡核普酸類似物提供了有效的區(qū)分工具。當所述寡核苷酸類似物中有至少一個核苷酸未雜交時，溫度。本發(fā)明所述相應的靶核酸和/或核酸類似物或寡核苷酸類似物可通過用于檢測雜交的寡核苷酸類似物的存在的多種方法中的任何方法進行標記。是否選擇使用具有多于一個信號對的本發(fā)明所述寡核苷酸類似物可取決于需要的靈敏度、特異性以及其它因素。標記物選擇取決于靈敏度、與探針接合的難易程度、穩(wěn)定性要求和可用的儀器?？梢灶A見檢測探針包含DNA或RNA的情形。取決于選擇的標記物，此類探針可以通過各種方式進行標記。放射性探針一般使用含有所需的放射性同位素的可商業(yè)途徑獲得的核苷酸制備。放射性核苦酸可通過多種方法摻入探針，如通過雙鏈探針的切口平移；通過在存在放射性dNTP的條件下使用DNA聚合酶的Klenow片段復制具有特異性插入片段的單鏈M13質粒；通過在存在》欠射性dNTP的條件下使用逆轉錄酶從RNA模板轉錄cDNA;通過在存在放射性NTP的條件下使用SP6或T7RNA聚合酶從含有SP6啟動子或T7啟動子的載體轉錄RNA;包括熱dNTP(hotdNTP)的普通PCR;使用末端轉移酶，以放射性核苷酸對探針3'端進行加尾；或通過使用[32P]-ATP和多核苷酸激酶對探針5'端進行磷酸化。非i文射性探針通常通過間接方法進行標記。探針一般共價結合一個或多個配體分子。然后所述配體與配體抗體分子結合，所述配體抗體分子內在地可檢測或共價結合至信號系統(tǒng)，如可檢測的酶、熒光化合物或化學發(fā)光化合物。配體和配體抗體可以有很大差別。如果配體具有天然配體抗體，例如生物素、曱狀腺素和皮質醇，則其可以與標記的天然存在的配體抗體聯(lián)合使用?？蛇x地，任何半抗原或抗原化合物均可以和抗體組合使用。如上所述，本發(fā)明所述寡核苷酸類似物也直接接合至產(chǎn)生信號的化合物，例如通過與酶或熒光團接合。感興趣的作為標記物的酶主要是水解酶(特別是磷酸酶、酯酶和糖苦酶)，或氧化還原酶(特別是過氧化物酶)。熒光化合物包括但不限于熒光素和其衍生物、羅丹明和其衍生物、丹磺酰、傘形酮等?；瘜W發(fā)光化合物包括螢光素、AMPPD([3-(2'-螺旋金剛烷(spiroamantane))-4-甲氧基-4-(3'-磷酰氧基)-苯基-l,2-二氧雜環(huán)丁烷)和2,3_二氫酞溱二酮(dihydrophthalazinedione)，例如魯米i若。雜交介質或提取溶液中存在的標記探針的量可以有4艮大差別。一般使用比化學計算量的乾核酸大大過量的探針以增強所述探針與靶DNA結合的速率。通過釆用本發(fā)明所述寡核苷酸類似物對某些核酸的高親合性退火屬性和/或疏水性相互作用，可不必使用大大過量的探針。通過將反應容器浸入可商業(yè)途徑獲得的超聲儀中進行超聲處理通?？梢约涌祀s交速率。在本發(fā)明的一些實施方案中，未標記的物質或過量的標記物要在執(zhí)行檢測之前除去。除去通常通過將探針或把附著在固體支持物上(如上文所述)執(zhí)行，然后可以很容易地進行漂洗。根據(jù)使用的特定的雜交溶液，在合適的溫度下雜交適當?shù)臅r間后，將連接捕獲的探針(本發(fā)明所述寡核苷酸類似物):相應的靶DNA雜交復合體的支持物引入漂洗溶液，該溶液通常含有與提供的雜交溶液相似的試劑(例如氯化鈉、緩沖液、有^L溶劑和去污劑)。這些試劑的濃度可以與雜交介質的相似，但是當需要更強的漂洗條件時，它們通常具有較低的濃度。支持物在漂洗溶液中保持的時間段可從幾秒到幾小時或更多不等。雜交或漂洗介質都可以是嚴格的。經(jīng)過適當嚴格性的漂洗之后，即可根據(jù)標記物的性質檢測正確的雜交復合體。無莖信標直接與標記物接合。例如如果所述標記物發(fā)焚光，可以通過首先用特定波長的光照射來^r測結合了雜交復合體底物的無莖信標。樣品吸收此光，然后發(fā)射不同波長的光，后者被檢測器接收(PhysicalBiochemistry(物理生物化學)，F(xiàn)reifelder，D.，W.H.Freeman&Co.(1982),第537-542頁)。如果所述標記物具有放射性，樣品暴露于X光片或磷成像屏(phosphorimagerscreen)等。如果所述標記物是酶，樣品通過與所述酶的適當?shù)孜锓跤M行檢測。產(chǎn)生的信號可以是有色沉淀、有色或熒光可溶物質或生物發(fā)光或化學發(fā)光產(chǎn)生的光子。當所述標記物是酶時，優(yōu)選地所述酶能夠催化產(chǎn)生有色的沉淀以指示正讀數(shù)，本發(fā)明所述優(yōu)選酶可選自辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、小牛腸堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶和p-半乳糖苷酶。例如，堿性磷酸酶將使磷酸吲哚酚去磷酸化，進而參與還原反應將四唑鹽轉化為高度有色和不溶的甲(潛)(formazan)。雜交復合體的檢測可需要產(chǎn)生信號的復合體與相應的耙和寡核苷酸類似物的雜種結合。通常來講，此結合通過配體和配體抗體之間，即配體接合的探針和配體抗體接合的信號之間的相互作用發(fā)生。所述信號產(chǎn)生復合體的結合也很容易通過暴露于超聲能量而加速。標記物還可允許間接檢測所述雜交復合體。例如，如果所述標記物是半抗原或抗原，可通過使用抗體檢測樣品。在這些系統(tǒng)中，向所述抗體連接熒光或酶分子或放射性標記物會產(chǎn)生信號(Tijssen，P."PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays"(酶免疫分析實踐和理論)，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology(生物化學和分子生物學實驗技術)，Burdon，R.H.，vanKnippenberg，P.H.編，Elsevier(1985),第9-20頁。)多種類型的熒光，包括受激子、激發(fā)復合體、FRET復合體和電荷遷移復合體，可以用于檢測。一些感興趣的分析是涉及附著到固體支持物的包含疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸類似物探針的雜交和基于熒光的檢測分析。在這些情形中，附著的探針與相應的乾核酸或相應的革巴核酸類似物雜交，從而產(chǎn)生信號。然后通過嚴格的漂洗除去過量或未結合的核酸或核酸類似物鏈，并檢測剩余的標記物。此方法非常適合用于基因分型點突變和表達圖譜。通過熔解溫度檢測和區(qū)分耙核酸、乾核酸類似物和突變體序列本發(fā)明涉及包含至少一個疏水性分子和信號對的寡核苷酸類似物。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述寡核苷酸類似物對其鞋i核酸序列的親合性顯著高于對混合物中存在的任何其它核酸序列。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，檢測程序依賴于溫度，包括使用漂洗程序除去對所述寡核苷酸類似物的親合性低于所述耙核酸或靶核酸類似物的核酸或核酸類似物的分析。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，高熔解溫度指示所述混合物中存在耙核酸。在更優(yōu)選的實施方案中，雜交的檢測在嚴格的漂洗程序之后執(zhí)行，正信號指示所述混合物中存在靶核酸。雜交程度的確定可通過本領域公知的任何方法執(zhí)行。包含至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物可用于直接檢測雜交。在本發(fā)明的一個實施方案中，包含本發(fā)明所述疏水性分子和信號對的幾個不相同的寡核苷酸和/或寡核普酸類似物可用于同時尋找混合物中不同的耙核酸或核酸類似物，因此有助于檢測與所述寡核苷酸和/或寡核苷酸類似物的數(shù)目相應的多個核酸或核酸類似物。使用光錯屬性檢測、定量和/或區(qū)分耙核酸、靶核酸類似物和突變體序本發(fā)明涉及包含至少一個疏水性分子和信號對的寡核苷酸類似物,其中所述信號對包含單體熒光和/或分子內受激子和/或分子內激發(fā)復合體和/或分子內FRET復合體和/或分子內電荷遷移復合體。在優(yōu)選實施方案中，寡核香酸類似物包含的信號對的一部分位于或靠近所述寡核苷酸類似物的一端，而所述信號對的另一部分位于或靠近所述寡核苷酸類似物的另一端。此外，所述寡核苷酸類似物包含至少兩個疏水性分子，所述寡核苷酸類似物的兩半側各有一個，當未與乾核酸結合時，所述疏水性分子能夠促進所述信號對的相互作用顯著好于由與所述寡核苷酸或寡核普酸類似物相同的核苷酸序列組成的缺乏所述疏水性基團的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的信號對的相互作用。因此包含至少兩個疏水性分子的寡核苷酸類似物將比相應的不包含所述疏水性分子的寡核苷酸或寡核苷酸類似物具有更高的信號或更低的背景信號。檢測相應的耙核酸和/或乾核酸類似物和其突變體存在的方法
技術領域：
：本發(fā)明的一個目標是提供檢測包含特異性靶序列的核酸或核酸類似物的方法，其中所述乾序列可與任何其它序列存在至少一個堿基差異，其中所述方法包含如下步驟a)提供測試突變所需的核酸和/或核酸類似物混合物；和b)提供包含至少一個疏水性分子和信號對的，能夠與所述特異性序列雜交的寡核苷酸類似物；和c)將所述寡核苷酸類似物與包含核酸或核酸類似物的混合物在允許雜交的條件下孵育；和d)洗去與所述寡核香酸類似物的親合性低于所述耙序列的序列；和e)確定所述乾序列存在與否。此外，本發(fā)明提供區(qū)分包含特異性乾序列的核酸或核酸類似物和包含突變體序列的核酸的方法。優(yōu)選地，雜交、測量或分帛在高嚴格性條件下執(zhí)行。例如溶液中的分離可通過例如電泳或層析執(zhí)行。更優(yōu)選地，僅當雜交在高嚴格性條件下執(zhí)行時，包含本發(fā)明所述至少一個疏水性分子和信號對的寡核苷酸或寡核苷酸類似物才和相應的靼核酸和/或核酸類似物雜交。在另一個優(yōu)選的實施方案中，包含至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物與所述乾核酸和/或所述乾核酸類似物互補。在另一個優(yōu)選的實施方案中，包含至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物與所述耙核酸和/或所述靶核酸類似物的突變體互補。在另一個優(yōu)選的實施方案中，包含至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的至少兩個寡核苷酸類似物分別與靶序列和其至少一個已知的突變體序列互補。在另一個優(yōu)選的實施方案中，更多包含至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物用于區(qū)分靶核酸和/或靶核酸類似物和差異可小至一個位置的所有其它已知的核酸。例如，所述乾核酸和最相似的核酸之間的差異可以是突變、曱基化狀態(tài)、缺失、插入或相似的小變化。在最優(yōu)選的實施方案中，更多包含至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苷酸類似物用于區(qū)分乾核酸和/或靶核酸類似物和其已知類型的單點突變。在優(yōu)選的實施方案中，區(qū)分靶核酸和/或乾核酸類似物和其突變體是通過使用分子間受激子、激發(fā)復合體、FRET復合體和/或電荷遷移復合體執(zhí)行的。使用熔解溫度檢測相應的把核酸和/或耙核酸類似物和其突變體存在的方法
技術領域：
：本發(fā)明的一個目標是提供檢測包含特異性靶序列的核酸或核酸類似物的方法，其中所述靶序列可與任何其它序列存在至少一個核堿基差異，其中所述方法包含如下步驟a)提供測試突變所需的核酸和/或核酸類似物混合物；和b)提供包含至少一個疏水性分子和信號對的，能夠與所述特異性序列雜交的無莖信標；和c)將所述無莖信標與包含核酸或核酸類似物的混合物在允許確定熔解溫度和/或親合溫度的條件下孵育；和d)確定所述靶序列存在與否。在另一個優(yōu)選的實施方案中，使用了兩個均包含本發(fā)明所述至少一個疏水性分子和信號對的無莖信標，所述無莖信標一個是靶核酸特異性的，一個是突變體核酸特異性的。在更優(yōu)選的實施方案中，所述兩個無莖信標產(chǎn)生可以區(qū)分彼此的信號。在更優(yōu)選的實施方案中，包含本發(fā)明所述至少一個疏水性分子和信號對的靶核酸特異性的寡核苷酸或寡核苷酸類似物具有高熔解溫度和/或親合溫度意味著存在所述耙核酸，包含本發(fā)明所述至少一個疏水性分子和信號對的突變體核酸特異性的寡核苷酸或寡核苷酸類似物具有高熔解溫度和/或親合溫度意味著存在所述突變體核酸。包括酶學步驟的檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明所述乾序列和/或突變體序列的存在、鑒定或定量可通過包括酶學步驟的方法執(zhí)行。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及^r測、鑒定和/或定量靶序列和/或突變體序列的方法。本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案涉及檢測、鑒定和/或定量靶序列和/或突變體序列的方法，其中所述方法包含如下步驟g)提供檢測、鑒定和/或定量把序列或突變體序列需要使用的核酸和/或核酸類似物混合物；和h)提供引物組和本發(fā)明所述寡核苷酸類似物，其中所述引物和所述寡核苷酸類似物能夠與所述乾序列和/或突變體序列雜交；和i)將所述引物和寡核苷酸或寡核苷酸類似物與所述核酸和/或核酸類似物混合物在允許所述引物與所述核酸和/或核酸類似物雜交的條件下孵育；和j)使用所述雜交的靶序列作為才莫板，用核苷酸或核苷酸類似物或寡核苷酸或寡核苷酸類似物對所述引物的3'端進行延伸；和k)將所述包含至少一個疏水性分子的寡核普酸或寡核苷酸類似物雜交并確定所述信號對的信號強度，和1)任選地重復步驟c)至e)。優(yōu)選地，雜交在高嚴格性條件下執(zhí)行。更優(yōu)選地，僅當雜交在高嚴格性條件下執(zhí)行時，包含至少一個本發(fā)明所述疏水性分子的寡核苦酸或寡核苷酸類似物才和相應的耙核酸和/或核酸類似物雜交。另一方面，本領域技術人員可以將所述信號對的信號強度與所述靶和/或突變體序列的存在、鑒定和/或定量聯(lián)系起來。在一個實施方案中，所述方法檢測靼和/或突變體序列，其中所述突變體序列與所述靶序列至少有一個核堿基差異，優(yōu)選地所述突變體序列與所述把序列有1至5個核威基的差異。在更優(yōu)選的實施方案中，使用了兩個均包含本發(fā)明所述至少一個疏水性分子和信號對的無莖信標，所述無莖信標一個是革巴核酸特異性的，一個是突變體核酸特異性的。在本發(fā)明另一個實施方案中，本發(fā)明所述寡核苷酸或寡核苷酸類似物或核酸和/或核酸類似物可附著于固體支持物。然后通常通過高嚴格性條件下一個或多個漂洗步驟執(zhí)行分離。一些用于擴增的酶能夠降解寡核苷酸或寡核苷酸類似物，如果其在擴增過程中與耙核酸雜交。此降解可以用于檢測靶核酸的存在。因此優(yōu)選的實施方案提供本發(fā)明所述寡核苷酸或寡核脊酸類似物，其中所述寡核普酸或寡核苷酸類似物對擴增所用的酶的核酸酶活性敏感。但是酶學降解也會消除或降低執(zhí)行終點熔解和/或親合性測量的可能性，進而消除或降低通過此測量確認結果的能力。因此本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案提供包含本發(fā)明所述至少一個疏水性分子和信號對的寡核苷酸或寡核苷酸類似物，其中所述至少一個疏水性分子的位置將使其大大抑制所用的酶對所述寡核苷酸或寡核苷酸類似物的本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案提供包含本發(fā)明所述至少一個疏水性分子和信號對的寡核苷酸或寡核苷酸類似物，其中所述至少一個疏水性分子的位置將使其大大抑制所用的酶對所述寡核苷酸或寡核香酸類似物的酶學降解，所以與相應的不包含所述疏水性基團的寡核苷酸或寡核香酸類似物113相比時，其信噪比增強。在本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸或寡核苷酸類似物合理地未^皮所述酶學步驟改變，從而可以用于進一步的驗證或重新用于測量。確定輩巴核酸的量和多態(tài)性位點是否存在突變在本發(fā)明的一個實施方案中，靶和突變體序列的量是通過雜交后的包含包含至少一個疏水性分子和信號對的寡核苷酸類似物的分析的光語屬性而確定的。所迷檢測可以檢測連接至所述寡核普酸類似物的標記物對或間接地通過檢測另一標記物進4亍。本發(fā)明所述突變的存在與否可使用許多不同的分析確定。優(yōu)選地，分析包括確定熔解溫度或確定光鐠屬性或二者的混合。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，突變的存在與否是通過在雜交后確定包含至少一個疏水性分子的寡核苷酸類似物的光諳屬性確定的。所述光譜屬性可以是熒光屬性，例如所述光鐠屬性可選自由單體熒光、受激子熒光、激發(fā)復合體熒光、FRET和電荷遷移復合體UV吸收帶組成的組。也可以確定多于一個光譜屬性，例如所述光譜屬性可以是選自由單體熒光、受激子熒光、激發(fā)復合體熒光、FRET和電荷遷移復合體熒光的光譜屬性組成的組的兩個或多個，特別地所述光譜屬性可以是單體熒光和受激子或激發(fā)復合體或FRET或電荷遷移熒光。如上文所述，包含至少一個疏水性分子的寡核苷酸類似物的信號對的至少兩個部分的位置彼此相關，以便它們可以形成分子內受激子、分子內激發(fā)復合體、FRET或電荷遷移復合體，然后分開這兩個部分的核堿基對進行堿基配對，優(yōu)選造成所述兩部分不能相互作用和進而形成分子內受激子、分子內激發(fā)復合體、FRET或電荷遷移復合體。所述疏水性分子應確保未與其靶序列雜交的寡核苷酸類似物中信號對的兩部分間顯著更好的相互作用，以形成比不存在所述疏水性分子時更強的分子內受激子、分子內激發(fā)復合體、FRET或電荷遷移復合體，以便當分開信號對的所述兩個部分的核tt對進行堿基配對時，所述分子內受激子、分子內激發(fā)復合體、FRET或電荷遷移復合體的變化應顯著大于不存在所述疏水性分子時。因此，當包含至少一個疏水性分子的寡核香酸類似物的信號對的兩部分的位置彼此相關，以便它們可以形成分子內受激子、分子內激發(fā)復合體、FRET或電荷遷移復合體時，低的或基本上沒有受激子熒光、激發(fā)復合體熒光、FRET或電荷遷移復合體UV發(fā)射帶可指示不存在把核酸，而高的受激子熒光、激發(fā)復合體熒光、FRET或電荷遷移復合體UV發(fā)射帶可指示存在靶核酸，或反之依然。實施例下列實施例說明了所選擇的本發(fā)明實施方案，而不應視為對本發(fā)明的限制。實施例中使用了下列縮略語ODN:寡脫氧核苷酸實施例1此實施例顯示了如何使用上文所述的程序ALOGPS2.1h加:〃146.107.217.178/lab/alogps/starlhtml繪制分子以計算其SMILES符號(notation)和ALOGP值。通過使用ACD/Labs8.00Release查看分子。產(chǎn)品版本8.17，2005年5月4日構建。疏水性分子ALOGP值的計算是在分子通常與連接體或主鏈單體單元連4妾(當所述分子包含在核苷酸類似物，如疏水性核普酸內時)的位置連接曱基。此處顯示的連接點并非意在以任何方式進行限制。連接甲基的原因是因為當其未被完全取代時(如N-H鍵)，連接體或主鏈單體單元通常連接至高度偶極的基團。例如，如果包含所述疏水性分子的核苷酸或假核苷酸中不存在N-H鍵，這將帶來錯誤的疏水性印象。天然核堿基在通常結合至主鏈單體單元的位點處添加甲基時的115ALOGP值H3C9-甲基-9//-噤呤-6-胺SMILES:C12=NC-NC{N)=C1N=CN2CALOGPs=>0.12OH3C甲基-l,9-二氫-6/f-噪呤-6-酮SMILES:C12=C(ISNCM1C)C{=0)NC(N)=N2ALOGPs=-0.931-曱基嘧啶-2,4(1//,3^)-二酮；SMILES:C10=O)N(C)C-CC(=O)N1ALOGPs=-0.854-氨基-1-曱基嘧咬-2(1//)-酮S亂ES:C1(。0)N(G)C=CC(N》-N1ALOGPs=-0.63Q'l,5-二甲基嘧啶-2,4(l/f,3^)-二酮SMILES:C1(=0)N(C)C=C(C)C(-0)N1ALOGPs=-0.63上述結構從左至右是曱基化的核堿基腺噤呤、胞嘧啶、鳥噤呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。從上面可以看出，所有核堿基的ALOGP值都小于0，因此不是本發(fā)明所述疏水性分子。在通常接合至連接體或主鏈單體單元的位點添加曱基的疏水性、芳基嵌入劑的ALOGP值。在本文顯示的實施例中，甲基的位置并不重要。任何這些分子都可以是本發(fā)明所述疏水性分子<formula>formulaseeoriginaldocumentpage117</formula>從上文可以看出，接合系統(tǒng)越大，ALOGP值越高。在通常接合至連接體或主鏈單體單元的位點添加甲基的疏水性、雜芳基嵌入劑的ALOGP值。任何這些分子都可以是本發(fā)明所述疏水性分子。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage117</formula>3,7,9-三曱基吡啶并[3',2':4，5]噻吩并[3,2-^]嘧啶"4(3//)-酮l-甲基-l/^引哚ALOGPs=2.10ALOGPs=2.37<formula>formulaseeoriginaldocumentpage117</formula>2-甲基蒽-9,10-醌ALOGPs=3.268-曱基吡喃并[3，2:/]吲哚-2(8i/)-酮ALOGPs=2.10疏水性烷烴和烯烴的ALOGP值。CH3H3CGH9丙烷戊烷ALOGPs-3.39庚烷ALOGPs=4.66H3C壬烷ALOGPs-5.24、CH3H,C^^CH2丙-l-烯ALOGPs-1.68(3^-戊-1,3-二烯ALOGPs=2.65(3￡,5司-庚-1,3,5-三烯ALOGPs=3.40H3C'(3￡,5￡,7￡)-壬-1，3,5,7-四烯ALOGPs=4.02可以看出，ALOGP值隨烷烴和烯烴長度的增加而增加。一些Blackhole猝滅劑(BHQ)的疏水性部分的ALOGP值和SMILES符號:BHQOSMILES:C3(N-NC2-CC(C)-C<N-NC1=COC(N(G)C)G=C1)OC2)=C(C)C=CC=C3ALOGPs=6,46H3C—ON=N、,、BHQ1SMILES:C3(N-NC2=CC(OCHi(N=NC1-CC=C(N(C)CC)OC1)C=C2C)=C(N(=0)0〉OC(C)C=G3ALOGPs-6.64119<formula>formulaseeoriginaldocumentpage120</formula>可以看出，上文所示的猝滅劑是疏水性的，并且所有顯示的實例的ALOGP值都大于2。這就是為什么通過將本發(fā)明所述疏水性分子置于與所述熒光團相同的一側可以增加位于無莖信標的相應端的熒光團和疏水性猝滅劑間的相互作用的原因。所述猝滅劑和所述疏水性分子之間的疏水性相互作用可以使所述熒光團和猝滅劑靠近一一降低背景熒光。一些熒光團的信號產(chǎn)生部分的ALOGP值和SMILES符號0SMIl￡S:Ct3=CC=C(0>C<C>=C10C2=C(Ci)C0)=C(C)C=C2C340C(=0>C5-GC(a)=C(CJ)C-C45ALOGPs=5.35O5'-熒光素SMILES:C13=CC=C(O)C-C1OC2-CC(0)-CC-C2C340C(=0)C5=CC-C(C(NC)=O)C=C45ALOGPs-Z48EpochRedmondRedSMILES:C13=CC=C(0)C-C10C2=CC(0)C(C)=CC2=N3ALOGPs-2,08TAMRASMILES:C13=CC-C{N(C)C)OC10C2=CC(=P4+(C)C)C(C)=CC2-C3C4=C(CaP-])=Op=CC(C(0)NC)=C4ALOOPs=-0.15可以看出，上面所示的一些熒光團是本發(fā)明所述疏水性分子，其ALOGP值大于0。通過將本發(fā)明所述疏水性分子置于與所述猝滅劑相同的一側可以增加位于無莖信標的相應端的疏水性焚光團和猝滅劑的相互作用。所述熒光團和所述疏水性分子之間的疏水性相互作用將降低背景熒光。實施例2-低背景熒光此測量按熔解溫度實驗-使用96孔板在Mx3000,Stratagene實時PCR儀上進行。測量在反映普通的實時PCR反應使用的緩沖溶液的緩沖溶液中執(zhí)行。所述緩沖液含有4mMMgCl2、50mMKC1、10mMTRIS-HC1、pH=8.0。1mL無莖信標(5pmol4iL)和2DNA靼序列(5pmol/^L)和22上述緩沖液。首先將所述混合物加熱至95。C1分鐘以變性二級結構，然后在35。C進行雙鏈體退火，然后升溫至95。C，同時測量每度的信號變化。結果顯示于圖2,其它詳細信息(像所述無莖信標的序列)可以參見所述圖的說明。從圖2可以看出，與無莖DNA探針(未結合探針的熒光)相比，所述無莖信標的背景熒光顯著降低，而兩種探針具有相同的最大熒光(在35°C)。還可以清楚地看出，包含疏水性分子的無莖信標的背景熒光(或噪音)在整個溫度范圍內都較低，而基于DNA的探針在較低溫度時的背景熒光較高。這可能是因為所述探針在較低溫度時運動減少，造成熒光團和猝滅劑的頻繁"碰撞"減少。氫鹽處理的DNA樣品靶。該探針在RT-PCR運行過程中優(yōu)選的讀數(shù)溫度。C)中間，所以這種情形下，應該是62。C。因此，所述探針在讀數(shù)溫度具有好的信噪比非常重要。信噪比的計算如下退火時的信號(探針+匹配靶)-退火時的緩沖液信號退火時的信號(探針+錯配把)-退火時的緩沖液信號在圖1所示的實施例中，62"C時的信噪比應為43.2-0,2無莖DNA信噪比20/7-0'2:2.1122無莖信標信噪比5.9-0.2=實施例3-—些無莖信標的高親合性和特異性測量按上文實施例2所述執(zhí)行。結果和序列信息可以參見圖3和該圖的說明。所述結果顯示為信號對溫度的一階導數(shù)。圖3證明了具有嵌入疏水性分子插入的無莖信標可以設計用于實現(xiàn)比其DNA對應物更高的特異性。實施例顯示所述無莖信標(SB)分別在63.7。C和49.9。C與其匹配耙和錯配乾雜交，具有13.8。C的差異，而所述DNA分別在64.9。C和57.rC與其匹配靼和錯配輩巴雜交，僅有7.8。C的差異。因此所述無莖信標的特異性比對輩巴序列具有相同親合性的無莖DNA探針的特異性高77%，測量為與匹配靶與錯配靶親合性的差異。實施例4-在PCR分析過程中測試和優(yōu)化引物和探針此實施例中描述的試驗方案是使用能夠進行多個讀數(shù)(一個循環(huán)中大于4個讀數(shù))的實時PCR儀辨別兩個基因型A和B。此類儀器包括此研究使用的Stratagenes實時PCR儀Mx3000P。通過使用下文描述的程序，可以測試引物是否在所選的退火溫度下與才莫板作用，同時還可以單獨優(yōu)化兩個探針的讀數(shù)溫度。測量本身可以用于辨別緊密相關的基因型。1.向透明(optical)PCR管中加入10nL2xPCRMastermix、1pL正向引物(IOpmol/pL)、1pL反向引物(10pmol4iL)、lpL基因型A特異性的無莖信標(5pmol&L)、1^L基因型B特異性的無莖信標(5pmol/jiL)、5nLH20和1DNA(100pG-20nG/pL)。2.如果可以，為如上文所述的每個感興趣的靶準備兩個管，一個用于基因型A，一個用于基因型B。如果無法得到這些對照，只需準備未知樣品管。3.使用透明蓋(如果使用通過蓋測量熒光的實時PCR儀，就像大多數(shù)型號使用的那樣)或僅用標準蓋(如果使用通過管壁或管底讀數(shù)的儀器)蓋上管。4.將所述管放入實時PCR儀，并運行下列程序(如圖6所示)a.如果使用熱啟動聚合酶，則根據(jù)制造商的說明進行活化，否則只需在95。C加熱1分鐘以消除二級結構；和b.活化后使用下列步驟進行45個循環(huán)i.95X:變性30秒；和ii.引物和探針(例如在50。C)退火l:OO分鐘，終點或連續(xù)熒光測量5和iii.將溫度增加2'C，進行終點熒光測量。使用的時間間隔應盡可能的短(取決于樣品的數(shù)量和位置)；和iv.重復步驟ii直至達到約7(TC;和v.在72。延伸30秒；和5.分析數(shù)據(jù)一一在今后的實時PCR實驗中使用的針對該靶的該探針的最佳熒光讀數(shù)溫度是所述無莖信標僅與完全互補靶雜交并且具有盡可能高的信號的溫度。將得到兩個探針單獨的讀數(shù)溫度。不同溫度階段的熒光差異和此方案如何用于優(yōu)化該特定靶今后的RT-PCR運行的實例可參見圖8。此實施例還說明了在單個封閉管中對兩個無莖信標進行多重分析。實施例5-引物和探針的測試和優(yōu)化，終點確定此節(jié)介紹了如何使用終點親合測量優(yōu)化本發(fā)明所述無莖信標和辨別兩個基因型A和B。此方法特別適合用于具有高升溫速率的實時PCR儀，如例4口CorbettResearch的RotorgeneTM3000，AppliedBiosystems7500FastReal-TimePCRSystem和其它升溫(冷卻)速率》3。C/秒的快速升溫實時PCR儀，但是也可用于在標準實時PCR儀上執(zhí)行。此實施例中基于所述程序的測量在CorbettResearch的RotorgeneTM3000上執(zhí)行。1.向透明PCR管中加入102xPCRMastermix、1正向引物(IOpmol4iL)、1nL反向引物(IOpmol/^iL)、1基因型A特異性的無莖信標(5pmol/[iL)、1nL基因型B特異性的無莖信標(5pmo!AiL)、5nLH20和1[iLDNA(100pG-20nG/pL);和2.如果可以，為如上文所述的每個感興趣的靶準備兩個管，一個用于包含基因型A的DNA,—個用于包含基因型B的DNA。如果無法得到這些對照，只需準備未知樣品管；和3.使用透明蓋(如果使用通過蓋測量熒光的實時PCR儀，就像大多數(shù)型號使用的那樣)或僅標準蓋(如果使用通過管壁讀數(shù)的儀器，如澳大利亞CorbettResearchPtyLtd的RotorgeneTM)蓋上管；和4.將所述管放入實時PCR儀，并運行下列程序(如圖7所示)a.如果使用熱啟動聚合酶，則根據(jù)制造商的說明進行活化，否則只需在95。C加熱1分鐘以消除二級結構；和b.活化后使用下列步驟進行45個擴增循環(huán)(參見注8):i.95'C變性10秒；和ii.引物和探針(例如在5(TC)退火15秒，讀取終點熒光；和iii.任選地在其它一個或兩個溫度下讀取熒光；和iv.在72。延伸20秒；和b.按下列方式進行終點親合測試i.95'C變性15秒；和ii.在比上次退火低rC的溫度下退火15秒(從72。C開始)。讀取終點熒光；和iii.重復上述兩個步驟27次(72。C至45。C);和5.分析數(shù)據(jù)一一在以后的實時PCR實驗中使用的該耙的最佳熒光讀數(shù)溫度位于與完全互補靶雜交的無莖信標的熒光開始"減弱，，的溫度和與錯配靶雜交的無莖信標的熒光開始"減弱"的溫度的中間。所得到的溫度可以用作以后使用相同設置測量的讀數(shù)點。親合性測量(像此處所述的測量)是區(qū)分相似靶的非常敏感的方式。有關終點、親合性測量如何可以用于優(yōu)化相同的耙以后的RT-PCR運行和所述親合性測量如何非常有力地辨別兩個非常相似的耙的實例，可以參見圖9。實施例6-檢測HOXB5中單個CdG的曱基化狀態(tài)設置測試以查看其是否可以區(qū)分基因HOXB5中曱基化的、未甲基化的和"雜合子"的單個CpG位點。此實施例中的測量在CorbettResearch的RotorgeneTM3000上執(zhí)行。靶、引物和探針正向引物5'-lTTTGTTTAGAGGTTAAAGTTAATTTTT[SEQIDNO.11]反向引物5'-1TCAAAAAATAATTCATACTCTATAATTAC[SEQIDNO.12]未甲基化特異性探針HEX-TT1AAAAAC1C4ATTC1AAT1A-BHQ1[SEQIDNO:13]甲基化特異性探針FAM-TT1GAAT￡G1GTTT1T-BHQ1乾序列包含在預擴增的亞硫酸氬鹽處理的HeLa或BL13的DNA(外側引物5'-lGGGAGTTAGTAGGGAGGTAGT[SEQUENCEIDNO.14]和5'-lTAAAAAATCACRTACTTTTATTAACC)[SEQUENCEIDNO.15]中。測序數(shù)據(jù)已顯示HeLa在感興趣的多態(tài)性位點甲基化，而BL13則顯示為未甲基化。制備36個包含乾DNA的樣品，每種12個純HeLa、純BL13或HeLa和BL131:1的亞硫酸氬鹽處理的DNA的混合物。3種樣品均使用4種不同稀釋度的靶稀釋IO、100、1,000或100,000倍。標簽1指插入的假核苷酸，即包含疏水性和嵌入分子芘的疏水性核脊酸((S)-l-(4，4'-二甲氧三苯基曱基氧(dimethoxytriphenylmetyloxy))-3-芘甲基氧-2-丙醇的亞磷酰胺)。FAM和Hex是熒光團，而BHQ1是猝滅劑。OPCR設置正向引物1|jL(10.0pmo1/^L)反向引物1(10.0pmo1/mL)探針(FAM)1[iL(12.5pmo1/pL)探針(Hex)1pL(12.5pmo1/tiL)水5nL2xMastermix，PromegalO(jLDNA才莫板1nL(參見上文的稀釋信息)實時PCR設置文件使用的實時PCR設置文件的描述參見圖14A。結果在實時PCR過程中使用熒光測量，除一個樣品外，所有樣品均得到正確指定。使用親合性分析，所有樣品均得到正確指定。一個樣品無法擴增。實施例7-人Andrenogen受體核香酸2074中的SNP檢測設置測試以查看所用的探針組合能否區(qū)分野生型和A—G轉變突變體。此實施例中的測量在CorbettResearch的Rotorgene3000實時PCR儀上執(zhí)行。靶、引物和探針[SEQIDNO,16]正向引物5'-TCCCACATCCTGCTCAAG[SEQIDNO.17]反向引物5'-ATCTCTGCCATCATTTCCG[SEQIDNO.18]F雄-T1CAAA1AGIGA1ACTG1AT畫BHQ1野生型特異性探針[SEQIDNO.19]突變體特異性^:針HEX-2TCAAA2AG￡GA2ACTG2AT-BHQ1在此實驗中，突變體特異性探針和野生型特異性探針一起加入到同質性分析。標簽1指插入的包含疏水性、嵌入分子芘(即上文所述的編號XII)的假核苷酸或疏水性核苷酸((S)-l-(4,4'-二甲氧三苯基曱基氧)-3-芘曱基氧-2-丙醇的亞磷酰胺)。標簽2指插入的假核苷酸或疏水性核苷酸(3-(1-0-(4,4'-二甲氧三苯基曱基)-2-0-(2-氰乙基二異丙基酰氨亞磚酸鹽)-1,2-丁二醇)-4-仏(7,9-二甲基-311-吡啶并[3',2':4,5]噻吩并[3,2-(1]嘧啶-4-酮)的亞磷酰胺)(包含嵌入疏水性基團，即上文所述的編號XXVI)。FAM和Hex是熒光團，而BHQ1是猝滅劑。模板各2個樣品，cDNA提取自LNC叩(突變體)和/或THP(野生型)(總共6個樣品)。OPCR設置正向引物1nL(10.0pmol/|oL)反向引物1tiL(10.0pmo1/mL)探針(FAM)1nL(12.5pmo1/^L)探針(Hex)1pL(12.5pmo1/tiL)水5nL2xMastermix，Promega10DNA模板1實時PCR設置文件使用的實時PCR設置文件的描述參見圖14B。結果在55'C,野生型特異性探針與野生型靶和突變體靶均結合，而突變體特異性探針與其靶特異性雜交。在61。C，可以調節(jié)野生型的閾值，以便僅獲得野生型探針的特異性信號，而突變體特異性探針工作良好。在65'C，野生型特異性探針僅與其特異性靶結合，而突變體特異性探針不再結合。FAM信道的終點親合性測量顯示，野生型特異性探針僅與THPcDNA雜交而不與LNCap雜交的窗口約為5度(61至66。C)。128HEX信道的終點親合性測量顯示，使用突變體特異性探針非常容易區(qū)分與完全互補靶和單核香酸錯配靶的結合，在55。C以上有至少l(TC的窗o。結論使用所述探針組合能夠檢測人Andrenogen受體核苷酸2074中發(fā)現(xiàn)的A—G轉變。FAM-標記的探針在61至66。C窗口內是特異的，而HEX標記的探針在55至63。C之間的溫度下具有特異性。再次顯示了如本文所述的終點親合性研究可以用于特異性檢測核酸的非常小的變化。所述方法為同質性方法，其可以在最佳擴增條件下執(zhí)行擴增，然后執(zhí)行親合性測量。實施例8實時PCR和疏水性核苷酸的定位引言此實施例說明熒光信號強度與疏水性核普酸的定位有關。材料<table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table>[SEQIDNO:20〗Bgalprob—01:5'國Fam1ACCGACCCAGCGCCClB,國3'[SEQE)NO:21]5'國CGGTTACGATGCGCCCATCTACAC國3'隱CAGCACCATCACCGCGAGGC誦:Bgalprob一02:5'國FamA1CCGACCCAGCGCC1CBHQl-3'[SEQIDNO:22]Bgalprob—03:5'國FamAC1CGACCCAGCGC1CCBHQ1-3'1=結構為X-Y-q的疏水性核苷酸，其中X是通過磷酸二酯鍵連接寡聚體的主鏈單體單元并具有結構-0-CH2-CH2-0-，Y是-CH2-0-CH2-連接體，q是r-芘。引物(Primere)[SEQIDNO:23]Bgal—S函l—F:[SEQIDNO:24]Bgal—S畫l—R:結果/結論從圖IO可以看出，緊鄰信號對的IPN的定位顯著降低了熒光信號。但是只要有一個核苷酸位于所述信號對和第一個疏水性核苦酸之間就顯著改善了信號，之間有兩個核苷酸產(chǎn)生更高的信號。因此本發(fā)明優(yōu)選的實施方案不會讓疏水性核脊酸最緊鄰(熒光團部分)信號對。實施例9靶的終點加入和檢測引言此實施例"^兌明了向把核酸增加:i笨針如何可以用于檢測所述乾核酸的材料和方法首先使用指定的引物和mastermix擴增耙核酸<table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table>2xPromegaMastermix10.00mL_水4.00tiLpCHl10卩-gal野生型模板(Pubmedid595693)2.00mL可變的總體積/反應20.00-然后對所述混合物執(zhí)行下文所示的擴增設置文件:循環(huán)循環(huán)點保持@95。C,2分鐘，0秒循環(huán)(50個重復)步驟1@94X:，保持10秒步驟2@6(TC,保持30秒，循環(huán)A([Green][1][1])所需執(zhí)行所述擴增設置文件之后，將2,00^iL下列探針加入其各自的擴增反應(下表的編號11不添加探針)。5'國FamA1CCGACCCAGCGCC1CBHQ1-3'Bgalprob—02[SEQIDNO:26]Bgalprob—03:[SEQIDNO:27]Bgalprob—05:[SEQIDNO:28]Bgalprob—ref:-FamAC1CGACCCAGCGC1CCBHQ1畫3'-FamACCG1ACCCAGC1GCCCBHQ1-5'國FamACCGACCCAGCGCCCBHQ1-3'1=結構為X-Y-Q的疏水性核苷酸，其中X是通過磷酸二酯鍵連接寡聚體的主鏈單體單元并具有結構-0-CH2-CH2-0-,Y是-CH2-0-CH2-連接體，Q是l'-芘。最后使用圖ll底部顯示的設置文件執(zhí)行親合性測量。結果和結論131從圖11顯然可以看出，使用顯示的親合性測量設置文件，所有顯示的探針均可以用于輩巴核酸的終點檢測。同樣清楚的是，包含疏水性核苷酸的無莖信標比基于DNA的探針具有更高的靶核酸親合性和更高的熒光信號強度。其它在相似的反應中比較下列探針[SEQIDNO:29]Bgalprob_01:5'陽Fam1ACCGACCCAGCGCCClBHQl-3'[SEQIDNO:30]Bgalprob—05:5'-FamACCG1ACCCAGC1GCCCBHQ1畫3'[SEQIDNO:31]Bgalprob—ref:5'誦FamACCGACCCAGCGCCCBHQ1-3'1=結構為X-Y-Q的疏水性核普酸，其中X是通過磷酸二酯鍵連接寡聚體的主鏈單體單元并具有結構-0-CH2-CH2-0-,Y是-CH2-0-CH2-連接體，Q是l'-芘。從圖12可以看出，緊鄰信號對的疏水性核苷酸的定位也顯著降低了此類測量的熒光信號。實施例10無莖探針對單鏈塞聚體靶的親合性引言此實施例說明了包含疏水性修飾的無莖信標比不包含所述疏水性修飾的探針具有更高的對完全互補乾序列的親合性，其中所述疏水性修飾具有X-Y-Q結構，其中X是通過磷酸二酯鍵連接寡聚體的主鏈單體單元并具有結構-0-CH2-CH2-0-，Y是-CH2-0-CH2-連接體，Q是l'-芘。材料和方法測試了下列探針[SEQIDNO:32]Bgalprob—1:[SEQIDNO:33]Bgalprob—2[SEQIDNO:34]Bgalprob—5:[SEQIDNO:35]Bgalprob一6:[SEQIDNO:36]Bgalprob—7:[SEQIDNO:37]Bgalprob—ref:寡聚體靶序列Bgal_WT—tar:設置文件-Fam1ACCGACCCAGCGCCCIBHQ1-3'-FamAlCCGACCCAGCGCC1CBHQ1-3'-FamACCGIACCCAGCIGCCCBHQ1-3'-FamACCGAlCCCAGlCGCCCBHQ1.-FamACCGACICCAIGCGCCCBHQ1-3''-FamACCGACCCAGCGCCCBHQ1-3'-AACGGGCGCTGGGTCGGTTAC-3'循環(huán)保持@94^:，i分鐘,o秒熔解(25_90°C),第一步保持秒，下一步保持5秒，熔解A([Green][1]m)混合物寡聚體靶2.00jiL1腦ol/mLP-gal探針—1至—8和—ref2.00jjL1nmol/mL緩沖液(280mMNaCl，20mMNa2HP0410.00nL水6.00結果和結論從圖13可以看出，與相應的DNA相比，所有無莖信標均具有相似或更高的對互補寡聚核苷酸靶的親合性。此外，還可以計算出此實施例中提到的所有無莖信標(探針一l除外)具有與不含疏水性修飾的DNA探針相似或更高的信噪比(25度時的信號除以90度時的信號)。信噪比:<table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table>權利要求1.一種寡核苷酸類似物，其包含n個核苷酸和/或核苷酸類似物的連續(xù)序列和至少一個疏水性核苷酸，其中所述寡核苷酸類似物共價連接至信號對，其中所述疏水性核苷酸具有通用結構X-Y-Q其中X是核苷酸或核苷酸類似物或能夠摻入核酸或核酸類似物主鏈的主鏈單體單元，Q是不參與沃森-克里克氫鍵合的疏水性分子；和Y是連接所述核苷酸或核苷酸類似物或主鏈單體單元和所述疏水性分子的連接體部分；和其中n是至少為4的整數(shù)；和其中所述至少一個疏水性核苷酸被置于距一端最多9個核苷酸和/或核苷酸類似物的位置；和其中所述信號對由兩部分系統(tǒng)組成，其中一個部分被置于距5′端最多6個核苷酸和/或核苷酸類似物的位置，而另一個部分被置于距3′端最多6個核苷酸或核苷酸類似物的位置；其中所述信號對的所述部分與所述疏水性核苷酸不同，條件是當所述信號對的一個部分作為懸掛端被置于5′端時，則5′端的第一個核苷酸或核苷酸類似物不是疏水性核苷酸；當所述信號對的一個部分作為懸掛端被置于3′端時，則3′端的第一個核苷酸或核苷酸類似物不是疏水性核苷酸。2.如權利要求1所述的寡核香酸類似物，其中在連接至所述連接體Y的位置添加曱基時，至少一個疏水性分子Q具有的logP值大于O,如大于0.5，例如大于0.75，如大于1，例如大于1.25，如大于1.5,例如大于1.75，如大于2，例如大于2.5,如大于3，例如大于4,如大于5。3.如權利要求2所述的寡核苷酸類似物，其中所述logP值是使用計算機程序ALOGPS2.1確定的ALogP值。4.如權利要求1所述的寡核苷酸類似物，其中至少一個疏水性分子Q包含選自由碳水化合物、類固醇、聚芳烴和雜聚芳烴的鏈組成的組的化學基團。5.如權利要求1所述的寡核苷酸類似物，其中至少一個疏水性分子Q選自由聚芳烴和雜聚芳烴組成的組，所述聚芳烴和雜聚芳烴任選地被選自由羥基、溴、氟、氯、碘、巰基、硫、氰基、烷基硫、雜環(huán)、芳基、雜芳基、羧基、烷氧羰基、烷基、烯基、塊基、硝基、氨基、烷氧基和酰氨基組成的組的一個或多個取代。6.如權利要求5所迷的寡核苷酸類似物，其中所述聚芳烴或雜聚芳烴依氺居本發(fā)明可由1，例如2，如3,例如4，如5,例如6,如7，例如8,如多于8個環(huán)組成。7.如權利要求1所述的寡核苷酸類似物，其中至少一個疏水性分子Q選自由嵌入劑和小溝結合物組成的組。8.如權利要求1所述的寡核苷酸類似物，其中至少一個疏水性分子Q選自由嵌入劑組成的組。9.如權利要求8所述的寡核普酸類似物，其中所述嵌入劑選自由以下組成的組苯、并環(huán)戊二烯、茚、萘、奧、不對稱引達省、對稱引達省、亞聯(lián)苯基、苊、非那烯、庚搭烯、菲烷、熒蒽、菲咯啉、吩嗪、菲啶、蒽醌、芘、蒽、環(huán)烷、菲、氟烷、茵、^、萘并苯、吖啶酮類、苯并蒽類、均二苯代乙烯類、草酰吡咬,唑類、疊氮苯類、。卜啉類和補骨脂素類和其衍生物。10.如權利要求1所述的寡核苷酸類似物，其中至少一個疏水性基團Q選自由以下組成的癥且<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>11.如權利要求1所述的寡核苷酸類似物，其中至少一個疏水性基團包含芘或吡啶并[3'，2':4,5]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4(lH)-酮或7,9-二曱基-吡啶并[3',2',4,5]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4(3H)-酮。12.如權利要求1所述的寡核苷酸類似物，其中所有疏水性分子Q選自根據(jù)權利要求2至10的任何疏水性分子。13.如權利要求l所述的寡核苷酸類似物，其中所有疏水性分子Q是芘或吡啶并[3',2':4,5]綣吩并[3,2-d]嘧啶-4(lH)-酮或7,9-二甲基-吡啶并[3',2',4,5]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4(3H)-酮。14.如前述任一項權利要求所述的寡核苷酸類似物，其中至少一個主鏈單體單元(X)選自由無環(huán)主鏈單體單元組成的組。15.如權利要求1至13任一項所述的寡核苷酸類似物，其中至少一個主鏈單體單元選自由亞磷酰胺組成的組。16.如權利要求1至13任一項所述的寡核苷酸類似物，其中至少一個主鏈單體單元選自由以下纟且成的纟且DNA、RNA、PNA、HNA、MNA、ANA、LNA、CNA、CeNA、TNA、(2'畫NH)-TNA、(3'-呵畫TNA、a誦L-核糖隱LNA、a-L-木糖-LNA、J3-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、雙環(huán)-DNA、6-氨基-雙環(huán)-DNA、5-表-雙環(huán)-DNA、a-雙環(huán)-DNA、三環(huán)-DNA、雙環(huán)[4.3.0]-DNA、雙環(huán)[3.2.1]-DNA、雙環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA、卩-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃來蘇糖基-NA、2'-R-RNA、a-L-RNA、a-D-RNA和卩-D-RNA的主鏈單體單元。17.如權利要求1至16任一項所述的寡核苷酸類似物，其中一個或多個核苷酸或核苷酸類似物是DNA和/或2'-0-Me-RNA核普酸。18.如權利要求16所述的寡核苷酸類似物，其中至少一個主鏈單體單元還包含核堿基或核堿基類似物。19.如權利要求16所述的寡核苷酸類似物，其中至少一個連接體Y連接至最少一個主鏈單體單元的糖環(huán)、核堿基或磷酸二酯鍵。20.如權利要求1至19任一項所述的寡核苷酸類似物，其中至少一個連接體Y包含x個選自由C、O、S、N和P組成的組的原子的鏈。21.如權利要求20所述的寡核苷酸類似物，其中所述鏈被選自由C、H、O、S、N和P組成的組的一個或多個取代。22.如權利要求1至21任一項所述的寡核普酸類似物，其中所述信號對能夠根據(jù)所述對的所述部分之間的物理距離改變可檢測的信號。23.如權利要求22所述的寡核香酸類似物，其中所述可檢測的信號是熒光。24.如權利要求1至23任一項所述的寡核普酸類似物，其中所迷信號對的所述部分能夠在所述信號對的所述部分靠近時形成分子內受激子、分子內激發(fā)復合體、FRET復合體或電荷遷移復合體。25.如權利要求1至24任一項所述的寡核苷酸類似物，其中所述信號對的一個部分是熒光團，而所述信號對的另一部分是猝滅劑，其中所述熒光團和所述猝滅劑能夠形成分子內FRET復合體。26.如權利要求1至25任一項所述的寡核苷酸類似物，其中所述信號對的一個部分作為懸掛端被置于5'端，而所述信號對的另一部分作為懸掛端^^置于3'端。27.如權利要求1至26任一項所述的寡核苷酸類似物，其中n是至少為7的整數(shù)。28.如權利要求1至27任一項所述的寡核苷酸類似物，其中所述寡核苷酸類似物包含1至5，如5至10，如10至15，例如15至20個疏水性核苷酸。29.如權利要求1至28任一項所迷的寡核苷酸類似物，其中所迷寡核苷酸每3個核苷酸或核普酸類似物包含最多1個疏水性核苷酸。30.如前述任一項權利要求所述的寡核苷酸類似物，其中所述寡核普酸類似物包含至少兩個疏水性核苷酸。31.如權利要求30所述的寡核苷酸類似物，其中所有疏水性核苷酸被至少1個不是疏水性核普酸的核香酸或核苦酸類似物分開。32.如權利要求30至31任一項所述的寡核苷酸類似物，其中至少兩個所迷疏水性核苷酸位于所述寡核苷酸類似物的相反兩側。33.如權利要求30至32任一項所述的寡核苷酸類似物，其中至少一個疏水性核苷酸位于距5'端9個核苷酸和/或核苷酸類似物以內，和至少一個疏水性核苷酸位于距3'端9個核苷酸和/或核苷酸類似物以內。34.如權利要求30至33任一項所述的寡核苷酸類似物，其中至少兩個疏水性核普酸位于距所述信號對的相應部分大致相等的距離。35.如權利要求30至33任一項所述的寡核苷酸類似物，其中所述疏水性核苷酸的疏水性分子能夠彼此發(fā)生疏水性相互作用，從而使所述信號對的兩個部分靠近，如在100A之內，例如80A之內，如60A之內，例如40A之內，如20A之內，例如15A之內，如10A之內，例如5A之內。36.如權利要求30至35任一項所述的寡核苷酸核苷酸類似物，其中沒有疏水性核苷酸距5'端的距離比距所述信號對的一個部分的距離更近，也沒有疏水性核苷酸距3'端的距離比距所述信號對的另一部分的距離更近。37.如前述任一項權利要求所述的寡核苷酸類似物，其中所述寡核芬酸固定于固體支持物。38.如前述任一項權利要求所迷的寡核苷酸類似物，其中所述寡核苷酸是陣列的一個組件。39.如前述任一項權利要求所述的寡核苷酸類似物，其中所述寡核香酸類似物具有與相應的不包含疏水性核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸類似物相比，相同或更高的對其乾序列的親合性。40.如前述任一項權利要求所述的寡核苷酸類似物，其中所述寡核苦酸比相應的不包含所述至少一個疏水性核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸類似物對核酸酶降解顯著更不敏感。41.如前述任一項權利要求所述的寡核香酸，其中所述寡核苷酸可溶于水。42.如前述任一項權利要求所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸類似物內沒有4個核苷酸和/或核苷酸類似物的連續(xù)序列與所述寡核苷酸類似物內另一4個核苷酸和/或核苷酸類似物的連續(xù)序列互補。43.—種確定雜交的方法，其包含如下步驟a)提供包含n個核苷酸和/或核苷酸類似物的連續(xù)序列和至少一個疏水性核苷酸的寡核苷酸類似物，其中所述寡核苷酸類似物共價連接至由兩部分系統(tǒng)組成的信號對，其中所述疏水性核脊酸具有通用結構X誦Y畫Q其中X是核苷酸或核苷酸類似物或能夠摻入核酸或核酸類似物主鏈的主鏈單體單元，Q是不參與特異性沃森-克里克氫鍵合的疏水性分子；和Y是連接所述核普酸或核香酸類似物或主鏈單體單元和所述疏水性分子的連接體部分；和其中n是至少為6的整數(shù)；和其中所述信號對的兩個部分的距離在所述寡核香酸類似物未與革巴序列雜交時比所述寡核苷酸類似物與靶序列雜交時更近；和b)提供可能包含所述寡核苷酸類似物的耙序列的核酸混合物；和c)將所述核酸和所述寡核苷酸類似物在允許雜交的條件下孵育；和d)通過確定所述信號對的所述部分是否靠近而檢測雜交；e)從而確定雜交。44.如權利要求43所述的方法，其中所述寡核苷酸類似物是根據(jù)權利要求1至42任一項所述的寡核苷酸類似物。45.如權利要求43至44任一項所述的方法，其中當所述信號對的所述部分彼此相距在100A之內，例如80A之內，如60A之內，例如40A之內，如20A之內，例如15A之內，如10A之內，例如5A之內時，即認為它們是靠近的。46.—種在擴增過程中檢測和/或定量根據(jù)權利要求1至42任一項所述的寡核苷酸類似物和靶序列之間的雜交的方法，所述方法包含如下步驟a)提供可能包含乾序列的核酸混合物；和b)提供包含擴增酶的擴增緩沖液、引物組和根據(jù)權利要求1至42任一項所述的寡核苷酸類似物，其中所述引物和所述寡核苷酸類似物能夠和所述^^序列或與其互補的序列雜交，所述擴增酶能夠以才莫^反指導方式延伸引物，而所述擴增緩沖液為所述擴增酶在存在引物和模板的情況下執(zhí)行此延伸提供條件；和c)將所述引物和寡核苷酸類似物與所述核酸混合物在允許所述引物發(fā)生雜交的條件下孵育；和d)使用所述靶序列作為才莫^反，使用所述擴增酶延伸所述雜交引物的3'端;和e)將所述核酸、延伸產(chǎn)物和所述寡核苷酸類似物在允許雜交的條件下孵育；和0檢測雜交和任選地定量雜交；和g)任選地重復步驟c)至f)。47.如權利要求43至46任一項所述的方法，其中多于一個根據(jù)權利要求1至42任一項所述的寡核苷酸類似物用于同時檢測多于一個的靶或突變體序列。48.如權利要求46所述的方法，其中步驟d)、e)和f)的順序更改為e)、f)和d)。49.如權利要求43至48任一項所述的方法，其中所述核酸混合物是擴增產(chǎn)物。50.如權利要求43至49任一項所述的方法，其中所述耙序列包含在擴增產(chǎn)物內。51.如權利要求43至50任一項所述的方法，其中所述方法是作為"封閉管"(同質性)反應執(zhí)行的。52.如權利要求43至51任一項所述的方法，其中所述靶序列是由DNA或RNA組成的核酸。53.如權利要求52所述的方法，其中所迷DNA或RNA已經(jīng)過化學或酶學處理，例如用亞硫酸氬鈉處理。54.如權利要求43至45任一項所述的方法，其中所述方法用于檢測無i侖存活與否的細l包或組織中的革巴序列。55.如權利要求54所述的方法，其中所迷細胞或組織中的耙序列使用原位雜交檢測。56.如權利要求43至55任一項所述的方法，其中所述信號對能夠根據(jù)所述對的所述部分之間的物理距離改變可檢測的信號，并且雜交是通過檢測所述可檢測的信號的變化進行檢測的。57.如權利要求43至57任一項所述的方法，其中所述信號對能夠根據(jù)所述對的所述部分之間的物理距離改變可檢測的信號，并且雜交是通過定量所述可檢測的信號的變化進行定量的。58.如權利要求56至57任一項所述的方法，其中信號高于預定限值指示雜交。59.如權利要求56至57任一項所述的方法，其中信號低于預定限值指示雜交。60.如權利要求43至59任一項所述的方法，其中檢測所述可檢測的信號包含確定所述寡核普酸類似物的光語屬性。61.如權利要求60所述的方法，其中所述光譜屬性是焚光屬性。62.如權利要求43至61任一項所述的方法，其中所述雜交檢測包含確定熔解溫度和/或親合溫度。63.如權利要求62所述的方法，其中熔解溫度或親合溫度高于預定限值指示雜交。64.如權利要求43至63任一項所述的方法，其中雜交指示所迷才莫板中存在靶序列。65.如權利要求63所述的方法，其中高熔解溫度指示與突變體序列雜交，低熔解溫度指示與把序列雜交。66.如權利要求63所述的方法，其中高熔解溫度指示與所述靶序列雜交，低熔解溫度指示與突變體序列雜交。67.如權利要求43至66任一項所述的方法，其中所述信號對產(chǎn)生的可檢測的信號的強度可以與存在的耙或突變體序列的量相關。68.如權利要求43至67任一項所述的方法，其中所述寡核苷酸類似物在所述方法的整個過程中穩(wěn)定。69.如權利要求68所述的方法，其中所述寡核苷酸類似物可以用于進一步的測量或質量控制。70.如權利要求46至69任一項所述的方法，其中所述擴增酶包含核酸酶活性。71.如權利要求70所迷的方法，其中核酸酶活性除去所迷信號對的最5'端的部分。72.如權利要求43至71任一項所述的方法，其中所迷靶序列預期包含至少一個多態(tài)性位點。73.如;f又利要求72所述的方法，其中所述寡核苷酸類似物與所述靶序列互補，并且所述至少一個多態(tài)性位點位于所述寡核苷酸類似物的中央部分。74.如權利要求72和73任一項所述的方法，其中寡核苷酸類似物與所述乾序列互補，并且所述寡核苷酸類似物在至少一個多態(tài)性位點包含A或C。75.如權利要求72所述的方法，其中提供至少兩個根據(jù)權利要求1至40任一項所述的寡核苷酸類似物，其中所述寡核苷酸類似物之一與所述乾序列的一個基因型互補，所述寡核苷酸類似物的另一個與所述乾序列的另一個基因型互補。76.如權利要求75所述的方法，其中所述第一個寡核苷酸類似物還與所述第二個寡核苷酸類似物同源互補。77.如權利要求76所述的方法，其中一個寡核香酸類似物在所述多態(tài)性位點包含"C"核堿基，另一個寡核苷酸類似物在所述多態(tài)性位點包含"A"核堿基。78.如權利要求75至77任一項所述的方法，其中所述寡核苷酸類似物的信號對產(chǎn)生可以區(qū)分彼此的可檢測的信號。79.—種確定寡核苷酸類似物與靶序列的親合溫度的方法，所述方法包含執(zhí)行根據(jù)權利要求43至78任一項所述的方法，其中最后一步之后執(zhí)行下列步驟a)將所述混合物變性并快速冷卻至高于所述親合溫度的第一個預定溫度；和b)通過確定所述信號對的可檢測的信號檢測雜交，其中所述信號對能夠根據(jù)所述對的所述部分之間的物理距離改變所述可檢測的信號；和c)將所述混合物變性并快速冷卻至第二個預定溫度，其中所述第二個預定溫度低于所述第一個預定溫度，d)通過確定所述可檢測的信號檢測雜交，e)重復步驟3)和4)，其中所述預定溫度逐漸被降低至低于所述親合溫度，f)然后確定所迷核酸類似物與所述乾序列的親合溫度。80.—種擴增靶序列的方法，所述方法包含如下步驟a)提供任選地包含所述耙序列的核酸混合物；和b)提供引物組、包含擴增酶的擴增緩沖液、和寡核苷酸或寡核苷酸類似物，其中所述引物和所述寡核苷酸或寡核普酸類似物能夠與所述乾序列或其互補序列雜交，條件是當所述擴增酶包含核酸酶活性時，所述寡核普酸或寡核苷酸類似物具有核酸酶抗性；和c)將所述引物和寡核苷酸或寡核普酸類似物與所述核酸混合物在允許雜交的條件下孵育；和d)檢測雜交；和e)按一定幅度逐漸增加檢測雜交時的溫度，直至達到所需的延伸溫度，和f)完成所述延伸反應，然后將形成的擴增子變性，并重復步驟c)至f)直至發(fā)生所需的擴增。81.如權利要求79和80任一項所述的方法，其中所述寡核苷酸或寡核苷酸類似物是根據(jù)權利要求1至40任一項所述的寡核苷酸類似物。82.如權利要求79至81任一項所述的方法，其中所述溫度的逐漸變化是每次例如0.5。C，如rC，例如2。C，如3。C,例如4。C，如5。C，例如大于5r。83.如權利要求79至82任一項所述的方法，其中所述方法在封閉管中執(zhí)行。84.如權利要求79至83任一項所述的方法，其中達到所述預定溫度和檢測雜交之間的時間足以讓小的寡核苷酸或寡核苷酸類似物與革巴序列退火。85.如權利要求84所述的方法，其中達到所述預定溫度和檢測雜交之間的時間是例如1秒，如2秒，例如3秒，如4秒，例如5秒，如6秒，例如7秒，如8秒，例如9秒，如10秒，例如11秒，如12秒，例如13秒，如14秒，例如15秒，如1至15秒之間，例如3至20秒之間。86.如權利要求79至85任一項所述的方法，其中所述親合溫度用于辨別耙序列和其突變體序列。87.如權利要求79至86任一項所述的方法，其中在同一封閉管中使用兩個或多個根據(jù)權利要求1至42任一項所述的寡核苷酸類似物。88.如;f又利要求87所述的寡核苷酸類似物，其中所迷寡核苷酸類似物的信號對能夠產(chǎn)生可以區(qū)分彼此的可檢測的信號。89.如權利要求87所述的寡核普酸類似物，其中至少一個寡核苷酸類似物與靶序列互補，并且至少一個寡核苷酸類似物與突變體序列互補。全文摘要本發(fā)明涉及包含信號對和至少疏水性核苷酸的新穎寡核苷酸。寡核苷酸類似物可用于檢測核酸序列的狀態(tài)，如存在、表達、甲基化和/或突變(特別是單點突變)，以及其中正確靶和其它靶之間的差異可小至一個核苷酸的其它序列的狀態(tài)。本發(fā)明還涉及通過使用寡核苷酸類似物和容易獲得的儀器檢測序列差異和優(yōu)化條件的新方法。特別地，本發(fā)明涉及使用包含信號對和至少一個疏水性核苷酸(如包含嵌入劑的核苷酸類似物)的寡核苷酸或寡核苷酸類似物，特異性檢測靶核酸的量或檢測一個與其它序列之間的差異可能小至一個核苷酸的序列。文檔編號C12Q1/68GK101448957SQ200780017820公開日2009年6月3日申請日期2007年3月16日優(yōu)先權日2006年3月16日發(fā)明者尤爾弗·本奇·克里斯滕森申請人:潘塔貝斯公司