專利名稱：用于可替寧快速檢測的微流控芯片及其制備方法
用于可替寧快速檢測的微流控芯片及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于快速檢測可替寧 (cotinine)的微流控芯片，并提供了該芯片的制備方法。
背景技術(shù)：
吸煙危害健康，國內(nèi)外已有眾多報道研究了香煙中各種成分對于人體的危害，并 發(fā)展成為公共健康問題。各國政府對吸煙及二手煙的暴露所引起的個人和社會問題都給予 充分關(guān)注和巨大的經(jīng)濟(jì)投入，煙氣中有害成分的快速檢測，對于煙草產(chǎn)品的開發(fā)，人類健康 和環(huán)境保護(hù)等都有著重要的現(xiàn)實意義。
尼古丁(1-甲基-2-(3-吡啶基)吡咯烷，俗名煙堿，英文名是nicotine，簡稱Nic， 分子式為C10H14N2)。是香煙中的主要毒物之一，遍布煙草全株而富集于煙葉。我國產(chǎn)的 煙葉尼古丁含量一般為 4%，有些引進(jìn)品種高達(dá)10% 12%。尼古丁常溫下為無色 或淺黃色油狀液體，在空氣中易變深色，極易溶于水和酒精，味辛辣，易揮發(fā)并具有強(qiáng)烈的 煙草味。尼古丁劇毒，可用作殺蟲劑和獸用驅(qū)蟲劑；它對心血管和呼吸系統(tǒng)有直接的毒害作 用，可引起呼吸加快、血壓升高、心跳加快、甚至心律不齊并誘發(fā)心臟?。凰€會破壞體內(nèi)吸 收的維生素c，從而減弱人體的免疫能力。尼古丁極易被口腔、消化道和呼吸道吸收，也可 通過皮膚進(jìn)入體內(nèi)，攝入少量可促使體內(nèi)釋放腎上腺素和去甲腎上腺素及兒茶酚胺等體內(nèi) 物質(zhì)，使中樞神經(jīng)興奮，量多時能抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使心臟麻痹乃至死亡。成人致死量為 40 75mg (約相當(dāng)于2包香煙尼古丁總量)，兒童致死量約為10 20mg。不會吸煙的人， 抽一支煙后就會覺的頭痛、惡心、心跳加快、面色蒼白，這就是尼古丁中毒。吸煙時，約25% 的尼古丁被破壞，50%擴(kuò)散到空間，5%殘留在煙頭內(nèi)，只有約20%的尼古丁真正被吸煙者 吸人體內(nèi)。尼古丁在空氣中與人體內(nèi)都會發(fā)生變化，可替寧(cotinine)是尼古丁在空氣和 人體中最主要氧化產(chǎn)物，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期較長，大于10小時，而尼古丁在空氣中半 衰期較短，不易定量測定，不能作為有效測定煙氣成分的標(biāo)志物。所以，目前較多的選用可 替寧作為煙氣暴露的特異性和敏感性標(biāo)志物，其含量的檢測間接反應(yīng)尼古丁的含量。目前 已有商品化的檢測唾液中可替寧含量的ELISA試劑盒。
目前，對于煙氣中各種有害成分的檢測分析，主要是傳統(tǒng)的分析化學(xué)方法，通過薄 層色譜，氣相色譜等方法進(jìn)行研究。氣相色譜等方法周期長，成本高，并且對工作人員有較 高的要求，由于儀器體積偏大，價格昂貴，難以做到實時在線監(jiān)測。而薄層色譜等方法靈敏 度，穩(wěn)定性等方面在很多情況下，又難以達(dá)到實驗要求。以上傳統(tǒng)檢測方法都涉及昂貴、精 細(xì)的實驗設(shè)備，具有專業(yè)技術(shù)的實驗人員和實驗場所，因此對于煙氣成分中有害成分的快 速檢測分析，需要有新技術(shù)來實現(xiàn)快速，靈敏，高通量的檢測需求。
迄今為止國內(nèi)外尚無實用的代表性煙氣中有害成分的快速檢測系統(tǒng)。未來的技術(shù) 發(fā)展主要集中在檢測儀器的多功能化和微型化上。當(dāng)前的煙氣有害成分檢測的發(fā)展趨勢 是(1)連續(xù)分析來達(dá)到監(jiān)控的目的；( 快速分析來達(dá)到在線檢測和預(yù)警；(3)高度自動 化來完成在各種環(huán)境的普及；(4)便攜性來適應(yīng)快速布置的需要。
儀器的微型化集中在微流體芯片在環(huán)境分析的應(yīng)用方面。該技術(shù)在化學(xué)、生物、生 物醫(yī)學(xué)工程尤其在生物分析方面有著廣泛的應(yīng)用。以微流體芯片為基礎(chǔ)的微型傳感器或者 分析儀器是未來環(huán)境分析的發(fā)展趨勢。
20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的微流體學(xué)科是指操作微小網(wǎng)絡(luò)通道(5-500微米)中流 體的科學(xué)技術(shù)。是分子生物學(xué)技術(shù)、微加工技術(shù)、機(jī)械制造技術(shù)、計算機(jī)技術(shù)等多種現(xiàn)代技 術(shù)的發(fā)展與融合。是基于大規(guī)模平行處理生物信息分子原理的微型裝置，具有信息通量大、 自動化、系統(tǒng)化的特點。微流體芯片用于操作，傳輸微升(10-6L)至毫微微升(10-15L)量 級的流體?？蓪⑸磻?yīng)的若干步驟包括分析、洗滌、檢測等集成在一塊或幾塊微流體芯片 上，其微通道孔徑只有微米級大小，具有濃縮和富集的作用，可以加速反應(yīng)縮短測試時間， 從而大大降低了測試成本。和常規(guī)的實驗技術(shù)相比，該技術(shù)極大降低了試劑的消耗量(至 少3個數(shù)量級)、同時分析產(chǎn)生的廢液極少。在微小范圍內(nèi)的能量傳遞、物質(zhì)分散更快更均 勻，熱能傳導(dǎo)快，也更易實現(xiàn)各種操控，因此反應(yīng)快、收率高，污染少、成本低。新一代的微流 體芯片由高分子材料，例如硅酮polydimethylsiloxane (PDMS)，制成(見附圖1)，材料造價 低廉(少于10美金/片)，制造周期短(少于M小時)，所需設(shè)備為少數(shù)常規(guī)設(shè)備，不需要 大型機(jī)密儀器，適合于大規(guī)模生產(chǎn)，可用于生產(chǎn)一次性使用產(chǎn)品。該技術(shù)的發(fā)展的趨勢是芯 片實驗室，即可將整個生化實驗室功能集成在一塊芯片上完成。
另外，由于PDMS材料的物理彈性，多種功能性模塊，例如微閥門，流體泵以及流體 混合器，都可以集成到微流體芯片中。而這些微閥門，流體泵等功能模塊的可通過計算機(jī)編 程控制。這樣的集成化、數(shù)控式微流體芯片，便可以完成一些復(fù)雜的操作。例如分離，進(jìn)樣， 清洗，色譜柱分離鑒定等化學(xué)或生物分析操作。以微流體芯片為基礎(chǔ)的儀器例如PCR，蛋白 結(jié)晶儀，DNA測試儀都已經(jīng)被設(shè)計制造出來。同常規(guī)方式相比，它的主要特點是
1)低價，因為使用的試劑的量極其微量，完成測試需要的費(fèi)用極低；
2)高效，在微流體芯片中反應(yīng)速度快，傳熱傳質(zhì)效率高，測試速度快；
3)應(yīng)用模版技術(shù)制造，適用于大規(guī)模生產(chǎn)；
4)容易集成，不同目標(biāo)的測試模塊可方便的集成到一塊芯片中，完成多目標(biāo)并行 分析；
5)自動化程度高，它可以很方便和現(xiàn)代電子技術(shù)結(jié)合，不僅使芯片分析測試自動， 而且信號傳輸以及信號自動分析也可以自動完成。
6)兼容性好，其他的微分析技術(shù)，例如微電極技術(shù)，生物傳感器技術(shù)也可以整合到 微流體芯片技術(shù)中。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于對可替寧(cotinine)快速檢測的微流控芯片。 該芯片同現(xiàn)行的檢測技術(shù)相比具有高效、低價、便攜和自動化的特點。
本發(fā)明提供的包括對實際樣品中cotinine進(jìn)行快速檢測的微流控芯片，以光學(xué) 透明材料為基材，主要由樣品通道層，閥門控制層及基片層構(gòu)成；其中，樣品通道層內(nèi)含樣 品富集及免疫分析模塊；該樣品富集及免疫分析模塊由一個或幾個并聯(lián)或串聯(lián)的納升體積 的免疫色譜柱微分析室所組成。每個分析室連接有多個進(jìn)樣口和出樣口，每個微分析室通 過聚合填料鍵合固定有可替寧抗體蛋白，能夠和樣品混合物中的cotinine發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，免疫分析信號由標(biāo)記的抗原實現(xiàn)，經(jīng)過多次洗滌之后，免疫標(biāo)記信號的產(chǎn)生的變化 如熒光強(qiáng)度的變化可以被信號采集模塊采集分析；信號采集模塊由紫外LED和熒光光敏器 件陣列組成，抗體可替寧間的特異性結(jié)合導(dǎo)致的光學(xué)信號都可被光敏器件陣列采集并傳至 到微處理器(計算機(jī))中和數(shù)據(jù)庫相比較，來分析樣品所含成分的濃度。
本發(fā)明用于現(xiàn)場生物檢測分析的免疫微流控芯片的光學(xué)透明材料選自無機(jī)材料: 石英、玻璃，硬質(zhì)高分子聚合物聚碳酸脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚對本二甲酸乙二醇脂、聚 苯乙烯、聚丙烯，彈性聚合物聚二甲基硅氧烷；模具材料為硅片。
本發(fā)明中樣品通道層中有免疫色譜柱微分析室。閥門控制層含有氣壓控制閥門， 控制樣品通道層相關(guān)孔道的開關(guān)。閥門控制層的閥門通過氣壓或電子元件控制，閥門通道 的直徑為1 30 μ m。
本發(fā)明微流控芯片的免疫色譜柱微分析室為整體柱或聚合填料灌柱，聚合填料為 硅膠填料或其它有機(jī)聚合物。
本發(fā)明微流控芯片的微分析室中可根據(jù)檢測目的的不同，灌注已鍵合或可以鍵合 不同抗原或抗體的填料。
本發(fā)明的免疫色譜柱微分析室的個數(shù)可由實際情況確定，如樣品數(shù)及其中各成分 的性質(zhì)差別，在本發(fā)明的具體實施中制備了一個單樣品的微流控芯片，可根據(jù)實際情況將 該單通道以不同方式并聯(lián)、串聯(lián)。
本發(fā)明的色譜柱微分析室的個數(shù)可由實際情況確定，如樣品數(shù)及其中各成分的性 質(zhì)差別，在本發(fā)明的具體實施中制備了一個單樣品的微流控芯片，可根據(jù)實際情況將該單 通道以不同方式串聯(lián)。
整個測試系統(tǒng)控制硬件部分主要由控制部分(計算機(jī))，操作系統(tǒng)(集成化微流體 芯片，數(shù)控界面)和數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)分析部分(計算機(jī))。軟件系統(tǒng)主要包括LABVIEW程序 (控制)和ImagePr0程序(數(shù)據(jù)分析)。
本發(fā)明提供了上述微流控芯片的制備方法具體如下(以負(fù)膠為例)
(1)基片準(zhǔn)備將硅片放入Piranha溶液去氧化后用氮?dú)獯蹈?，用SU-82050系列 經(jīng)旋涂機(jī)甩涂，在恒溫加熱板上軟烘；
(2)曝光和烘焙將設(shè)計好的樣品通道層，閥門控制層的硅片模板分別放置在甩 涂好的基片上，應(yīng)用紫外曝光機(jī)曝光，之后在加熱板上烘焙；
(3)顯影將硅片放入顯影液中顯影，之后分別用異丙醇和去離子水清洗干凈，并 用氮?dú)獯蹈桑?br> (4)硬烘在熱板上緩慢加熱固定；
(5)澆注PDMS (聚二甲基硅氧烷)單體及固化劑按質(zhì)量配比5 1至20 1混 合均勻，分別倒在相應(yīng)的硅片模具上，在烘箱內(nèi)固化，剝離；
(6)鍵合將兩層PDMS芯片校準(zhǔn)鍵合形成微通道腔，再與基片層鍵合。


圖1 一種用于cotonine的快速檢測微流控芯片的設(shè)計圖。
圖2 —種用于cotonine的快速檢測微流控芯片的具體實施示意圖。
圖中標(biāo)號1氣閥氣體入口，2樣品入口，3氣閥氣體通道，4樣品通道，5填料進(jìn)/出口，6微分析室，7樣品出口。
具體實施方式
基片準(zhǔn)備。將硅片放入Piranha溶液(98%濃硫酸30%雙氧水=7 3)煮沸 清洗15min。用去離子水沖洗5遍后用氮?dú)獯蹈桑⒃?00°C烘焙30min.
甩涂。將Microchem公司的SU_8膠(下同)倒在硅片中央，傾斜硅片邊緣，使 SU-8覆蓋住硅片大部分區(qū)域。靜置15min，同時消除掉傾倒過程中產(chǎn)生的氣泡。用旋涂機(jī) (Spin-Coater KW-4A, Chemat Technology, Inc.)進(jìn)行兩次遞進(jìn)式甩涂500 轉(zhuǎn)/min 旋涂 25s，3000轉(zhuǎn)/min旋涂50s，使膠分布較為均勻，靜置IOmin緩解邊緣突起效應(yīng)。
軟烘。在熱板上以5°C /min的速率逐步升到95°C，期間在65°C、95°C和65°C的條 件下，分別保持3min、6min和3min。
曝光。采用接觸式曝光機(jī)(波長365nm)，這是因為SU-8膠在365nm的紫外光波段 吸收少，可以獲得很好的曝光一致。
曝光后烘焙。再熱板上以5°C /min的速率由室溫逐步升到95°C，期間在65°C和 95°C分別保持Imin和5min。之后以0. 5°C /min的速率緩慢降至室溫。
顯影在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，顯影液的主要成分是丙二醇甲醚醋酸酯(PGMEA)。在SU_8 模具與顯影液分別靜置達(dá)到室溫后，將模具放入顯影液中顯影7min，之后分別用異丙醇和 去離子水清洗干凈，并用氮?dú)獯蹈伞?br> 硬烘。在熱板上180°C保溫5min，再于200°C保溫25min，再緩慢降至室溫。
澆注聚二甲基硅氧烷(PDMQ聚合物成型。將把采用光刻法制作的微通道PDMS印 章分別用丙酮、無水乙醇分別超聲5min，清除通道印章上的水分，把清洗好的印章60°C烘 箱烘烤4h。PDMS單體與固化劑按照5 1的質(zhì)量配比混合均勻，除凈氣泡。倒在經(jīng)三甲基 氯硅烷處理過的SU-8模具上，在調(diào)整好的水平熱板上80°C保持池固化。形成上層具有反 應(yīng)微通道層的基片。
具有控制通道的PDMS層制作。在硅片上甩涂光刻膠，經(jīng)紫外曝光、顯影，制成硅基 光陽模，并于120°C退火30min，使光刻膠軟化，硅基光膠陽模用三甲基氯硅烷在氣相中處 理7min，使其表面硅烷化，以防止在注塑過程中PDMS的粘附。并且具有控制通道的PDMS層 單體與固化劑的比例為20 1，相對較軟。在甩膠機(jī)上2000轉(zhuǎn)/min甩涂35s。形成下層 具有控制閥門通道的基片。
鍵合及接口制作。將上層基片打孔，下層基片打孔用于控制通道。上下兩片仔細(xì) 對合，80°C過夜固化，與玻璃蓋片熱鍵和。
單個免疫微分析室的體積為180 μ mX 30 μ mX 2 μ m。
若免疫微分析室色譜柱為聚合材料填充柱，可經(jīng)圖一三個進(jìn)樣通道中任一個將已 吸附抗體的聚合材料填料灌注裝柱，閉合柱底閥門，控制閥門氣壓不超過20psi，同時控制 裝柱速度，待填料裝滿后進(jìn)緩沖液平衡色譜柱，實際樣品(煙氣吸收溶液或尿液，唾液等) 溶液、特異性抗體及標(biāo)記競爭物經(jīng)圖一中任一進(jìn)樣孔進(jìn)入色譜柱，溫育10-20分鐘，進(jìn)洗滌 緩沖液洗去過量的抗體及標(biāo)記競爭物，加入顯色緩沖液顯色，抗體/continine間的特異性 結(jié)合導(dǎo)致的光學(xué)信號都可被信號采集模塊的光敏器件陣列采集并傳至到微處理器(計算 機(jī))中和數(shù)據(jù)庫相比較，來分析樣品所含成分的濃度。
整個測試系統(tǒng)控制硬件部分主要由控制部分(計算機(jī))，操作系統(tǒng)(集成化微流體 芯片，數(shù)控界面)和數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)分析部分(計算機(jī))。軟件系統(tǒng)主要包括LABVIEW程序 (控制)和ImagePro程序(數(shù)據(jù)分析)如圖2所示。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用于快速檢測可替寧的微流控芯片，其特征在于該芯片以光學(xué)透明材料為基 材，主要由樣品通道層，閥門控制層及基片層構(gòu)成；其中，樣品通道層內(nèi)含樣品富集及免疫 分析模塊；該樣品富集免疫分析模塊由一個，或幾個并聯(lián)或串聯(lián)的納升體積的免疫色譜柱 微分析室組成，每個分析室通過聚合填料鍵合固定有可替寧抗體蛋白或抗原，以便發(fā)生免 疫反應(yīng)；閥門控制層含有氣壓控制閥門，控制樣品通道層相關(guān)孔道的開關(guān)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述光學(xué)透明材料選自無機(jī)材料 石英、玻璃，硬質(zhì)高分子聚合物聚碳酸脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚對本二甲酸乙二醇脂、聚 苯乙烯、聚丙烯，彈性聚合物聚二甲基硅氧烷；模具材料為硅片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于免疫色譜柱為整體柱或聚合填料灌 柱，聚合填料為硅膠填料或其它有機(jī)聚合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于免疫分析模塊的鍵合物為二抗或抗 原，免疫分析信號由標(biāo)記的反應(yīng)物實現(xiàn)，標(biāo)記物為各種染料或熒光。
5.一種如權(quán)利要求1所述的微流控芯片的制備方法，其特征在于采用模塑法，具體步 驟如下(1)基片準(zhǔn)備將硅片放入Piranha溶液去氧化后用氮?dú)獯蹈?，用SU-82050系列經(jīng)旋 涂機(jī)甩涂，在恒溫加熱板上軟烘；(2)曝光和烘焙將設(shè)計好的樣品通道層，閥門控制層的硅片模板分別放置在甩涂好 的基片上，應(yīng)用紫外曝光機(jī)曝光，之后在加熱板上烘焙；(3)顯影將硅片放入顯影液中顯影，之后分別用異丙醇和去離子水清洗干凈，并用氮 氣吹干；(4)硬烘在熱板上緩慢加熱固定；(5)澆注聚二甲基硅氧烷單體及固化劑按質(zhì)量配比5 1至20 1混合均勻，分別 倒在相應(yīng)的硅片模具上，在烘箱內(nèi)固化，剝離；(6)鍵合將兩層聚二甲基硅氧烷芯片校準(zhǔn)鍵合形成微通道腔，再與基片層鍵合。
6.如權(quán)利要求1所述微流控芯片在分析檢測可替寧中的應(yīng)用，其特征在于具體步驟如下樣品溶液由所述微流控芯片的進(jìn)樣口進(jìn)入芯片，芯片微分析室中的可替寧抗體蛋白 或抗原與樣品中的可替寧發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，免疫分析信號由標(biāo)記的抗原實現(xiàn)，經(jīng)過多 次洗滌之后，免疫標(biāo)記信號的產(chǎn)生的變化被信號采集模塊采集分析；信號采集模塊由紫外 LED和熒光光敏器件陣列組成，抗體可替寧間的特異性結(jié)合導(dǎo)致的光學(xué)信號被光敏器件陣 列采集并傳至到微處理器中和數(shù)據(jù)庫相比較，來分析樣品所含成分的濃度。
全文摘要
本發(fā)明屬生物分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種可替寧快速檢測的微流控芯片及其制備方法。該芯片采用模塑法以光學(xué)透明的聚二甲基硅氧烷等為材料，主要由樣品反應(yīng)微通道層，閥門控制層及基片層構(gòu)成。芯片內(nèi)含樣品富集及免疫分析模塊和信號采集模塊，該模塊由并行的幾個納升體積的免疫色譜柱微分析室組成，每個分析室固定了可替寧抗體蛋白或抗原，實現(xiàn)了對不同來源的樣品中可替寧的快速檢測。本發(fā)明具有快速、高效、便攜低價和易自動化控制的特點，可完成自動信號采集、遠(yuǎn)程傳輸和信號分析，適合于空氣中該成分的快速檢測及醫(yī)學(xué)臨床檢測。
文檔編號G01N30/56GK102033127SQ200910247558
公開日2011年4月27日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者劉思秀, 劉超, 張金玲, 趙望, 隋國棟 申請人:復(fù)旦大學(xué)