專利名稱：制備用于生物燃料、生物柴油和其它有用的化學(xué)品的脂肪酸的方法
制備用于生物燃料、生物柴油和其它有用的化學(xué)品的脂肪
酸的方法
背景技術(shù)：
石油是一種非再生資源。因此，許多人擔(dān)心未來石油儲(chǔ)備的枯竭。有些人已指出世界石油資源將在21世紀(jì)用盡(Kerr RA, Science 1998，281，1128)。這促進(jìn)了可替代的碳?xì)浠衔锂a(chǎn)品的發(fā)展，例如來自植物衍生原料和廢物的乙醇和其它微生物發(fā)酵產(chǎn)品。事實(shí)上，當(dāng)前研究估計(jì)，美國每年可以輕易生產(chǎn)十億噸干生物質(zhì) (生物質(zhì)原料)材料(其中超過一半是廢物)。其中主要是纖維素生物資源的形式。纖維素包含于全世界幾乎每一種在草甸、森林和田地中天然、自由生長的植物、樹木和灌木，這不需要農(nóng)業(yè)作用或成本去促使其生長。據(jù)估計(jì)，在2030年，這些纖維素材料可以用來產(chǎn)生足夠的乙醇，以代替30%或更多的美國能源需求。該策略的重大優(yōu)點(diǎn)在于纖維是地球上最豐富的并且可再生的碳源，其向可用燃料的有效轉(zhuǎn)化可以解決世界能源問題。纖維素乙醇已被廣泛研究。纖維素乙醇與例如來自玉米淀粉或糖的其它來源的乙醇是在化學(xué)上相同的，但是其具有纖維素原料非常豐富且來源廣泛的優(yōu)點(diǎn)。然而，其不同之處在于其需要大量處理來使得糖單體被常規(guī)用于發(fā)酵制備乙醇的微生物使用。雖然纖維素是一種豐富的植物原料資源，但是它的剛性結(jié)構(gòu)使得纖維素成了一種難以加工的起始原料。因此，需要一種有效的預(yù)處理將纖維素從木質(zhì)素包封和它的晶體結(jié)構(gòu)中釋放出來，從而使其可以經(jīng)受隨后的水解步驟。到目前為止，大多數(shù)預(yù)處理通過物理或化學(xué)方法完成。為了實(shí)現(xiàn)更高的效率，一些研究人員開始尋求兩種效果的結(jié)合。到目前為止，可用的預(yù)處理技術(shù)包括酸水解，蒸汽膨脹，氨纖維膨脹、堿濕氧化和臭氧預(yù)處理。除了有效的纖維素釋放外，理想的預(yù)處理需要最小化降解產(chǎn)物的形成，因?yàn)樗麄儗﹄S后的水解和發(fā)酵處理有抑制作用。抑制物的存在使得很難制得乙醇?？v使通過酸水解的預(yù)處理可能是最古老并且研究最多的預(yù)處理技術(shù)，其還是產(chǎn)生了一些有效抑制物，包括糠醛和羥甲基糠醛(HMF)，它們被認(rèn)為是目前為止存在于木質(zhì)纖維水解產(chǎn)物的最大毒性抑制物。纖維素分子由各種長鏈糖分子組成。在水解過程中，在發(fā)酵成為乙醇產(chǎn)物之前，這些長鏈破裂成為游離糖。有兩種主要的纖維素水解方法i)使用酸的化學(xué)反應(yīng)，或者ii)酶反應(yīng)。然而，目前的水解方法是昂貴并且低效的。例如，酶水解方法需要得自外部供應(yīng)商的昂貴的纖維素酶。另一個(gè)將纖維素產(chǎn)品轉(zhuǎn)化成乙醇的問題是高達(dá)50%的可利用碳到二氧化碳通過發(fā)酵處理內(nèi)在地?fù)p失。此外，乙醇比汽油和柴油更具腐蝕性。所以，這需要獨(dú)特的配送基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)以及專門設(shè)計(jì)的引擎。最后，乙醇的效力比化石氣體低20-30%，并且乙醇更易蒸發(fā)，在整個(gè)生產(chǎn)和配送過程中有更高比例的損耗。一種可以從纖維素制備生物柴油的方法將減輕乙醇和其它生物柴油制品相關(guān)的問題。
得自微生物(例如藻類或細(xì)菌)的生物柴油還是無毒的、生物可降解的并且無硫的。由于大部分從燃燒的生物柴油中釋放的二氧化碳是從微生物(例如藻類和細(xì)菌)生長期間吸收而再循環(huán)的，因此可以相信，生物柴油的燃燒相比石油燃燒釋放較少的二氧化碳， 石油是從已經(jīng)貯藏了數(shù)個(gè)世紀(jì)的來源中釋放二氧化碳。因此，使用微生物制備生物柴油可以產(chǎn)生較少的例如二氧化碳的溫室氣體。一些微生物物種理想地適用于生物柴油的制備，這是由于他們的高含油量。某些微生物含有作為膜成分、貯存產(chǎn)物、代謝產(chǎn)物和能量源的脂類和/或其它所需的碳?xì)浠衔?。微生物中顯示出的脂類、碳?xì)浠衔锖椭舅岬谋壤鶕?jù)培養(yǎng)的微生物的種類而不同。然而，發(fā)現(xiàn)某些菌株中高達(dá)其總重的90%包含脂類、脂肪酸和其它所需碳水化合物含量 (例如，葡萄藻屬(Botryococcus))。例如小球藻屬(Chlorela sp.)和杜氏藻屬(Dunaliella)的藻類是用于生物柴油的脂肪酸源，這已經(jīng)被認(rèn)識(shí)很久了。的確，這些真核微生物產(chǎn)生較高的脂肪酸產(chǎn)量(干重的 20-80% )，并且可以使用太陽能利用CO2。然而，光合過程并不能有效地使得該過程稱為成本節(jié)約的生物柴油源。另選地是使用藻類的有機(jī)異養(yǎng)特性，并且使其生長在例如葡萄糖的碳源上。在這些情況下，脂肪酸的產(chǎn)量極端的高，并且該脂肪酸具有很高的品質(zhì)。剩余的干重主要包括蛋白質(zhì)。然而，可用碳源非常稀少并且昂貴，以致于不能實(shí)現(xiàn)任何商業(yè)生命力。微生物中積聚的脂類和其它所需的碳?xì)浠衔锟梢栽诃h(huán)境應(yīng)激階段期間產(chǎn)生，包括在營養(yǎng)不足狀態(tài)下生長。相應(yīng)地，微生物的脂類和脂肪酸含量可以根據(jù)培養(yǎng)條件而不同。這些微生物中自然產(chǎn)生的脂類和其它碳?xì)浠衔锟梢苑蛛x并且酯基轉(zhuǎn)移從而獲得生物柴油。具有一元醇(大多數(shù)情況為甲醇)的脂類的酯基轉(zhuǎn)移作用可以產(chǎn)生烷基酯， 這是生物柴油的主要成分。脂類的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)導(dǎo)致了具有與所用起始脂類(例如，油脂可以的自動(dòng)物或植物源)類似脂肪酸曲線的生物柴油燃料。由于所得生物柴油脂肪酸曲線可以根據(jù)脂類來源而不同，由酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)生的烷基酯也將產(chǎn)生變化。因此，生物柴油的特性也可以根據(jù)脂類源而不同(例如，參見^Auchardt等，TRANSESTERIFICATION OF VEGETABLE OILS :A REVIEW,J. Braz. Chem. Soc，vol. 9，1，199-210，1998 和 G. Knothe，F(xiàn)UEL PROCESSING TECHNOLOGY, 86,1059-1070 (2005)，均引入本文以作參考)。概述本發(fā)明涉及一種從生物質(zhì)制備脂肪酸的方法，特別地，一種從生物質(zhì)制備脂肪酸并且用于從所述脂肪酸制備生物燃料的方法。特別地，本發(fā)明涉及一種制備脂肪酸的方法， 通過(i)在一定條件下將纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的至少一種的混合物用至少一種產(chǎn)生一種或多種纖維素酶、半纖維素酶和漆酶的微生物菌株接種，從而產(chǎn)生葡萄糖、纖維二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纖維素糖的至少一種，這些酶水解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的至少一種；(ii)抑制所述至少一種微生物菌株的生長；(iii)在一定條件下將步驟(ii)的混合物用至少一種藻類株系接種，該藻類株系代謝所述葡萄糖、纖維二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纖維素糖的至少一種，以使所述至少一種藻類株系產(chǎn)生一種或多種脂肪酸；和任選地，(iv)從所述至少一種藻類株系回收一種或多種脂肪酸。本發(fā)明的這些以及其它特征將進(jìn)一步參照下面的附圖和詳細(xì)說明進(jìn)行闡明和示例。附圖簡要說明附

圖1是例示生物乙醇制備的常規(guī)方法的流程圖。附圖2是例示用于本發(fā)明脂肪酸制備和生物燃料制備的一般方法的流程圖。附圖3是例示用于本發(fā)明脂肪酸制備和生物燃料制備的特定方法的流程圖。附圖4是例示用于本發(fā)明脂肪酸制備和生物燃料制備的特定方法的一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方式
的流程圖。發(fā)明詳細(xì)說明現(xiàn)在將對本發(fā)明實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)參考。實(shí)施方式的實(shí)施例例示于隨附的附圖中。雖然將結(jié)合這些實(shí)施方式描述本發(fā)明，但是可以理解的是，這不意味著將發(fā)明限定于這些實(shí)施方式。相反，這是想要覆蓋可能包含在所附權(quán)利要求定義發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)的替代物、變型以及等同物。在下面的說明中，給出了許多具體的細(xì)節(jié)以提供本發(fā)明的深入理解。本發(fā)明可以在沒有某些或全部這些具體的細(xì)節(jié)下完成。在其它的例子中，熟知的過程操作沒有給予詳細(xì)說明，這是為了不給本發(fā)明造成不必要的不清楚。本發(fā)明涉及一種從生物質(zhì)材料制備脂肪酸的方法。該脂肪酸可以用于例如生物燃料的制備。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
涉及一種制備脂肪酸的方法，通過(i)在一定條件下將纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的至少一種的混合物用至少一種產(chǎn)生一種或多種纖維素酶、半纖維素酶和漆酶的微生物菌株接種，從而產(chǎn)生至少葡萄糖、纖維二糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和其它半纖維素糖的至少一種，所述酶水解至少纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的至少一種；(ii)抑制所述至少一種微生物菌株的生長，并且回收上清液中的細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)的纖維素酶(細(xì)胞內(nèi)纖維素酶的回收可以通過使用常規(guī)技術(shù)破裂/破壞細(xì)胞從而釋放細(xì)胞內(nèi)的酶，包括超聲波處理，弗氏細(xì)胞壓碎器，溫度，化學(xué)處理，酶處理，均質(zhì)機(jī)，微波)。(iii)在所述至少一種藻類株系產(chǎn)生一種或多種脂肪酸的條件下，將步驟(ii)的混合物用至少一種藻類株系接種，所述藻類株系代謝所述葡萄糖、纖維二糖、木糖、甘露糖、 半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纖維素糖的至少一種；和任選地，(iv)從所述至少一種藻類株系回收所述一種或多種脂肪酸。步驟(i)中的混合物可以得自生物質(zhì)。生物質(zhì)是任何得自植物或動(dòng)物的有機(jī)原料，包括活的或最近死亡的生物學(xué)原料，其可以用作燃料或用于工業(yè)生產(chǎn)。最普通地，生物質(zhì)指的是為了用作生物燃料而種植的植物體(Plant matter)，但是其還包括用于纖維、化學(xué)品或熱能生產(chǎn)的植物體或動(dòng)物體(animal matter)。生物質(zhì)是可再生能源。有廣泛的各種生物質(zhì)源，包括樹木和牧場作物以及森林地、農(nóng)業(yè)作物以及城市垃圾，他們都可以用于本發(fā)明。生活用的生物質(zhì)源的例子包括農(nóng)業(yè)或森林殘留物、城市固體廢物、工業(yè)廢物以及陸地和水生作物。
世界上有很多種類的植物，有很多種將他們用于能量制備的方法。一般地，有兩種途徑培育特定用于能源使用的植物，和使用用于其它事物的植物的殘留物。本發(fā)明中使用的植物類型根據(jù)氣候、土壤、地理、人口等等從地區(qū)到地區(qū)是不同的。能源作物(也被稱為“能量作物”)可以以潛在的非常大的量在農(nóng)田中種植。樹和草，包括某地區(qū)天然生長的，是優(yōu)選的能源作物，但是其它農(nóng)業(yè)上的支持性 (agriculturally sustainable)較低的作物，包括玉米也可以被使用。樹木是用于本發(fā)明方法的良好的可再生生物質(zhì)來源。除了生長快以外，某些樹木在接近地面處被砍斷之后還可以重新生長(稱為“矮林作業(yè)”)。這使得樹木在重載之前的 20或30年可以每3-8年收獲一次。這種樹木(也被稱為“短期輪作木材”)在收獲之間的年月中可以長到40英尺高。在美國北部較冷較濕的地區(qū)，優(yōu)選栽種美國梧桐和路路通。然而在最溫暖的佛羅里達(dá)和加利福尼亞地區(qū)，桉樹和松樹可能生長良好。草是用于本發(fā)明的良好可再生生物質(zhì)來源。細(xì)莖多年生草普遍存在于整個(gè)美國地區(qū)。例子包括柳枝稷、大須芒草以及其它天然品種，他們在美國很多地區(qū)快速生長，并且可以在重栽之前可以收獲多達(dá)10年。包括甘蔗和象草的粗莖多年生植物可以在炎熱并且潮濕氣候的地區(qū)，例如福羅里達(dá)和夏威夷。例如玉米和高粱的一年生植物是通常種植用于食物的另一類型的草。油料植物也是用于本發(fā)明的一種良好的生物質(zhì)來源。這樣的植物包括例如產(chǎn)油的大豆和向日葵，他們可以用于制備生物燃料。其它一些具有良好產(chǎn)率的油料植物極少用作能源原料，這是因?yàn)樗麄儦埩舻亩蛊蓪τ诓溉閯?dòng)物是有毒的，例如麻風(fēng)樹或蓖麻子植物，并且他們實(shí)際上良好的生物質(zhì)農(nóng)作物。另一個(gè)不同類型的油料作物是微藻類。這些小型水生植物具有在美國西南沙漠地區(qū)某些湖泊炎熱、低淺、含鹽的水中極快速生長的可能。在這點(diǎn)上，生物質(zhì)一般得自產(chǎn)生大量植物和動(dòng)物廢物的林業(yè)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)的廢棄產(chǎn)物。目前，林業(yè)廢物是熱和電的巨大來源，木材廠、紙漿廠和造紙廠使用他們來給工廠供能。另一種木材廢物的來源通常是是木料采收作業(yè)后在森林中留下的樹梢和樹枝。其它木材廢料的來源包括來自鋸木廠的樹皮和鋸削，家具制備中產(chǎn)生的刨花，和來自紙漿廠和造紙廠的有機(jī)淤泥(或“料液”)。就像林業(yè)那樣，大量的農(nóng)作物殘留物在收獲后留在了田里。這些廢物可以收集用于生物燃料制備。畜牧場產(chǎn)生很多糞便形式的“潮濕廢物”。這些廢物可以收集并通過本發(fā)明使用，以制備用于生物燃料制備的脂肪酸。人們產(chǎn)生很多形式的生物質(zhì)廢物，包括“城市木材廢物”(例如航運(yùn)貨架和剩余的建筑木料)，垃圾的生物可降解部分(紙、食物、皮革和畜欄廢物等等)和廢物分解時(shí)垃圾釋放的氣體。甚至我們的污水可以用作能源，一些污水處理廠收集污水釋放的甲烷，并且將其燃燒用于產(chǎn)熱和產(chǎn)電，從而減少大氣污染和全球變暖氣體的排放。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明使用得自植物或動(dòng)物的生物質(zhì)。這些生物質(zhì)材料可以是任何形式的，包括例如碎片原料、植物廢物、動(dòng)物廢物等。這些植物生物質(zhì)一般包含約10-35%木質(zhì)素；約15-35%半纖維素；和約 30-60%纖維素?？捎糜诒景l(fā)明的植物生物質(zhì)包括至少一種選自木材、紙、稻草、樹葉、秕、殼、剪枝、草的成分，包括柳枝稷、芒屬、麻、植物紙漿、玉米、豆粕、秸稈、甘蔗、甜菜、高粱、木薯、白楊、 柳樹、馬鈴薯廢物、甘蔗渣、鋸屑、以及混合的植物廢物、油棕(棕櫚油)和林木粉碎廢物。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，植物生物質(zhì)可以得自至少一種選自柳枝稷，秸稈和混合的植物廢物的植物。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，植物生物質(zhì)得自柳枝稷，這是由于他較高水平的纖維素。需要注意的是，任何這樣的生物質(zhì)材料可以用于本發(fā)明的方法中。植物生物質(zhì)最初可以經(jīng)過預(yù)處理從而制備用于步驟(i)的混合物。預(yù)處理步驟有助于改變生物質(zhì)的宏觀和微觀尺寸和結(jié)構(gòu)，以及亞顯微化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)，從而使碳水化合物部分向單糖的水解可以更快的完成，并且具有更高的產(chǎn)率。常規(guī)預(yù)處理過程在Nathan Mosier, Charles Wyman, Bruce Dale，Richard Elander, Y. Y. Lee, Mark Holtzapple， Michael Ladisch， “ Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass，〃 Bioresource Technology :96, pp. 673-686 (2005)中公幵， 引入本文作為參考，并且將在下面進(jìn)行討論。預(yù)處理方法可以是物理的或者化學(xué)的。一些方法結(jié)合了兩種效果(McMillan， 1994 ；Hsu, 1996)。出于分類的目的，將蒸汽和水從考慮用于預(yù)處理的化學(xué)試劑中排除，這是因?yàn)樯镔|(zhì)中沒有加入外來化學(xué)試劑。物理處理方包括粉碎(機(jī)械減少生物質(zhì)顆粒尺寸)、 蒸汽爆炸和水熱。某些時(shí)候需要包括干法、濕法和震動(dòng)球磨(Millett等，1979，River和 Emert，1987，Sidirus 和 Koukios，1989)以及擠壓磨(Tassinari 等，1980，1982)的粉碎，以使得隨后處理步驟中操作更簡單。酸和堿可以促進(jìn)水解，并且提高在預(yù)處理期間通過除去半纖維或木質(zhì)素而從纖維回收葡萄糖的產(chǎn)率。通常使用的酸和堿包括，例如，分別為H2SO4 和NaOH。纖維素溶劑是另一種類型的化學(xué)添加劑。將甘蔗渣、玉米稈、牛尾草和鴨茅中的纖維素溶解的溶劑可以獲得纖維素到葡萄糖的90%轉(zhuǎn)化(Ladisch等1978 ；Hamilton等， 1984)，并且顯示在水解前使生物質(zhì)結(jié)構(gòu)斷裂時(shí)，酶水解可以得到極大促進(jìn)。已知堿性H202、 臭氧、有機(jī)溶劑制漿(在含水乙醇中使用劉易斯酸、FeCl3、(Al)2SO4)、甘油、二妒甚燒、苯酚或乙二醇屬于使纖維素結(jié)構(gòu)斷裂并且促進(jìn)水解的溶劑(Wood and Saddler, 1988) 0濃縮的無機(jī)酸(H2S04、HC1)、氨水基的溶劑(NH3、胼)、質(zhì)子惰性溶劑(DMSO)、金屬復(fù)合物(高鐵酒石酸鈉、氫氧化鎘乙二胺溶液和銅氨液)和濕氧化法也可以減少纖維素結(jié)晶性并且斷裂木質(zhì)素與纖維素的結(jié)合并溶解半纖維素。這些方法，雖然是有效的，但是當(dāng)測定葡萄糖值(大約
/lb)時(shí)，目前對于實(shí)踐來講太過昂貴。以下蒸汽爆炸、液體熱水、稀釋的酸、石灰和氨水預(yù)處理(AFEX)可能具有作為成本合算的處理的可能。需要注意的是，任何這些預(yù)處理操作都可以用使用，以改變生物質(zhì)從而獲得用于本發(fā)明的混合物。在這點(diǎn)上，步驟(i)中的微生物可以適用于任何預(yù)處理操作，并且他們相關(guān)的殘留化合物可以包括例如糠醛、羥甲基糠醛(HMF)、例如3，4-二羥基苯甲醛的酚類化合物、3-甲氧基-4-羥基-苯甲酸、肉桂酸、苯胺、香草醛醇以及例如氫氧化鈉的復(fù)合鈉、硝酸復(fù)合物或銨，這取決于選擇的預(yù)處理方法。酸預(yù)處理是常見的預(yù)處理操作。通過酸水解的酸預(yù)處理和熱處理可以用于制備在本發(fā)明步驟(i)中被接種的混合物。任何合適的酸都可以用于該步驟中，優(yōu)選地是將半纖維素從纖維素水解掉的酸。一些可以使用的常見的酸包括選自鹽酸、磷酸、硫酸或亞硫酸的無機(jī)酸。優(yōu)選例如濃度為約0.5%-2.0%的硫酸。合適的有機(jī)酸可以是碳酸、酒石酸、檸檬酸、葡糖醛酸、乙酸、甲酸或類似的單或多聚羧酸。酸預(yù)處理一般還包括例如在約 700C -500°C的范圍內(nèi)，或約120°C -200°C的范圍內(nèi)加熱混合物。這些酸預(yù)處理操作可以用來產(chǎn)生用于步驟(i)的混合物。需要注意的是，當(dāng)生物質(zhì)得自植物時(shí)，混合物包括纖維素、半纖維、木質(zhì)素、糠醛、 酚類化合物和乙酸的至少一種。在步驟(i)中，預(yù)處理操作之后，將混合物用至少一種微生物菌株接種，該菌株是細(xì)胞外纖維素生成者。該微生物可以產(chǎn)生一種或多種在一定條件下水解存在于混合物中纖維素和半纖維素的至少一種的纖維素酶，以制備葡萄糖、纖維二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、 鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纖維素糖的至少一種。纖維素酶指的是水解纖維素、半纖維素、和/或木質(zhì)素的一組酶。其一般指的是由可以催化纖維分解(或水解)的例如古菌(archaea)、真菌、細(xì)菌、原生動(dòng)物的微生物(即， 細(xì)胞外纖維素生成者)產(chǎn)生的一類酶。然而，需要注意的是，也有其它類型微生物產(chǎn)生的纖維素酶。重要的是注意本發(fā)明可以使用任何可以產(chǎn)生一種或多種纖維素酶的細(xì)胞外和/ 或細(xì)胞內(nèi)纖維素酶生產(chǎn)者，所述纖維素酶選自內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β -糖苷酶、 半纖維素酶和漆酶?？梢杂糜诒景l(fā)明的產(chǎn)生纖維素酶的微生物的例子包括所附表1中的那些。因此，微生物產(chǎn)生的纖維素酶可以對步驟(i)中混合物實(shí)施酶水解。在酶水解結(jié)束時(shí)，所得培養(yǎng)基可能含有葡萄糖、纖維二糖、乙酸、糠醛、木質(zhì)素、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、 半乳糖和其它半纖維素糖。此外，本發(fā)明可以使用任何作為產(chǎn)生用于步驟(i)中酶水解的必需纖維素酶的纖維素酶生產(chǎn)者的微生物。照這樣，任何產(chǎn)生細(xì)胞外和/細(xì)胞內(nèi)纖維素酶的包括細(xì)菌、古菌的原核生物以及包括真菌的真核生物可以用作步驟(i)中的微生物。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)纖維素酶生產(chǎn)者是選自腐質(zhì)霉屬 (Humicola)、木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、 桿菌屬(Bacillus)、噬纖維菌屬(Cytophaga)和生孢噬纖維菌屬(Sporocytophaga)的真菌、古菌或細(xì)菌。根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方式
，細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)纖維素酶生產(chǎn)者可以是選自灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、木素木霉(Trichoderma lignorum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、撫抱青霉(Penicillium verruculosum)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、熱葡糖昔酶芽胞桿菌(Bacillus thermoglucosidasius)、噬纖維菌(Cytophaga spp.)和生抱if纖維菌(Sporocytophaga spp.)的至少一種。此外，作為細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)漆酶生產(chǎn)者的微生物也可以用于本發(fā)明。因此， 任何產(chǎn)生細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)漆酶的包括細(xì)菌，古菌的原核生物以及包括真菌的真核生物都可以用作步驟(i)中的微生物。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)漆酶生產(chǎn)者是選自腐質(zhì)霉屬(Humicola)、木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、桿菌屬(Bacillus)、噬纖維菌屬(Cytophaga)和生孢噬纖維菌屬(Sporocytophaga)的真菌、細(xì)菌或古菌。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)具體實(shí)施方式
，細(xì)胞外和/ 或細(xì)胞內(nèi)漆酶生產(chǎn)者可以是選自灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、木素木霉(Trichoderma lignorum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、撫抱青霉(Penicillium verruculosum)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)、熱葡糖昔酶芽胞桿菌(Bacillus thermoglucosidasius)、噬胞菌 (Cytophaga spp.)和生孢噬纖維素(Sporocytophaga spp.)的一種?？梢杂糜诒景l(fā)明的產(chǎn)生漆酶的微生物的例子包括所附表1中的那些。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，微生物菌株是真菌，更優(yōu)選地，是需氧真菌，例如里氏木毒(Trichoderma reesei)0此外，任何細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)纖維素酶生產(chǎn)者或細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)漆酶生產(chǎn)者可以用于本發(fā)明，以制備步驟(i)中酶水解必需的酶。例子包括列于所附表1和2中的那些。在本發(fā)明中，微生物的類型可以選擇和/或發(fā)展為對所用植物生物質(zhì)類型呈特異性。微生物菌株可以耐受由生物質(zhì)預(yù)處理、例如酸或堿處理所產(chǎn)生的一種或多種化合物。這些在生物質(zhì)預(yù)處理步驟中產(chǎn)生的化合物包括，例如，糠醛、3，4-二羥基苯甲醛、3-甲氧基-4-羥基苯甲酸酸、肉桂酸、香草醛、香草醛醇、乙酸、木質(zhì)素和其它殘留鹽或雜質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的方法使用至少一種進(jìn)化改良的并且對于所用具體生物質(zhì)種類呈特異性的微生物。進(jìn)化改良的微生物可以更有效地代謝(酶解)作為目標(biāo)的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)，并且這些微生物可以更好的耐受殘留化合物，例如糠醛和乙酸。在這點(diǎn)上，進(jìn)化改良的微生物相對未改良的野生型形式的微生物可以具有對糠醛和乙酸更強(qiáng)的耐受性。進(jìn)化改良的微生物還可以產(chǎn)生一種或多種纖維素酶和/或漆酶，它們更少地受木質(zhì)素抑制和/或具有提高的代謝木質(zhì)素的能力。照這樣，進(jìn)化改良的微生物可以具有提高的產(chǎn)生消化木質(zhì)素的酶(例如漆酶)的能力。因此，相比未改良的野生型形式的微生物，進(jìn)化改良的微生物產(chǎn)生的纖維素酶、半纖維素酶和/或漆酶可以具有較強(qiáng)的代謝具有木質(zhì)素的纖維素和半纖維素的能力。由于使用了進(jìn)化改良的微生物，本發(fā)明可以在步驟⑴的混合物/培養(yǎng)基中原位產(chǎn)生纖維素酶。結(jié)果是，不再需要從外界供應(yīng)商購買昂貴的纖維素酶。相比生物燃料制備的傳統(tǒng)方法，這降低了操作成本。此外，還由于使用了進(jìn)化改良的微生物，不再需要將本發(fā)明中經(jīng)酸預(yù)處理的混合物清洗和去毒，以除去通常會(huì)抑制生物燃料生產(chǎn)的糠醛、乙酸和鹽 (如在傳統(tǒng)方法中)。通過除去清洗和去毒步驟，本發(fā)明相比生物燃料制備的傳統(tǒng)方法還可以進(jìn)一步減少操作成本。需要注意的是，進(jìn)化改良的微生物定義為是被自然選擇技術(shù)改良的微生物。這些技術(shù)包括，例如，連續(xù)移植(serial transfer)、連續(xù)稀釋、遺傳工程(Genetic Engine)、連續(xù)培養(yǎng)和恒化培養(yǎng)。美國專利US 6，686，194-B1中已經(jīng)描述了一種方法和恒化培養(yǎng)裝置 (遺傳動(dòng)力，其可以避免連續(xù)培養(yǎng)中稀釋抵抗)，引入本文以作參考。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，微生物通過使用如PCT申請PCT/US05/05616或美國專利申請US No. 11/508, 286中公開的連續(xù)培養(yǎng)操作進(jìn)行進(jìn)化改良，兩者均引入本文以作參考。通過以這種方式培養(yǎng)微生物，將產(chǎn)生有益的突變從而獲得嶄新的等位基因(即， 基因變種)，該等位基因提高了特定環(huán)境中微生物的存活可能性和/或生長速率。
照這樣，本發(fā)明的微生物(例如，真菌、古菌、藻類或細(xì)菌)可以構(gòu)成不同的菌株， 其可以通過培養(yǎng)過程中獲得的突變來鑒別，并且這些突變可以使新細(xì)胞從他們祖先的基因型特征中區(qū)分開來。因此，可以通過在自然選擇過程中分離具有提高的繁殖速率的單體從而選擇新的微生物菌株。選擇用于進(jìn)化改良微生物的參數(shù)。通過舉例的方法，步驟(i)中的微生物可以通過自然選擇技術(shù)進(jìn)行進(jìn)化改良，因此通過進(jìn)化，其進(jìn)化成為適用于所選擇的特定碳源。這包括通過在所用的自然選擇技術(shù)(例如連續(xù)培養(yǎng))中的適應(yīng)性來鑒別和選擇最快生長的變異微生物，其比野生型在特定碳源上生長更快。這還包括選擇當(dāng)使用稀釋酸預(yù)處理時(shí)，具有對糠醛和乙酸的提高的耐受力的突變微生物；或者選擇產(chǎn)生一種或多種較少受木質(zhì)素抑制的纖維素酶和/或漆酶和/或具有提高的代謝木質(zhì)素能力的變異微生物。這還可以包括選擇產(chǎn)生上述必要纖維素酶的微生物。需要注意的是，通過使用這些參數(shù)，任一種自然選擇技術(shù)可以用于本發(fā)明以進(jìn)化改良本發(fā)明中的微生物。因此，微生物可以以許多方式進(jìn)化改良，因此它們的生長速率、成活力和作為生物燃料或其它碳?xì)浠衔锂a(chǎn)品的實(shí)用性可以得到提高。因此，可以將微生物進(jìn)化改良從而增強(qiáng)它們在特定底物上生長的能力，所述底物包含生物質(zhì)和任何可能的與化學(xué)預(yù)處理有關(guān)的殘留的化學(xué)藥品。在這點(diǎn)上，微生物可以對特定生物質(zhì)植物和最終相關(guān)的殘留化學(xué)藥品進(jìn)行進(jìn)化改良。微生物(例如真菌、藻類或細(xì)菌)優(yōu)選地是自然存在且未通過DNA技術(shù)改良的。換句話講，不需要將微生物遺傳改良從而獲得所需的特征。相應(yīng)地，所需特征可以通過使用上述技術(shù)對微生物進(jìn)化改良而獲得。雖然如此，甚至遺傳改良的微生物也可以通過重組DNA 技術(shù)進(jìn)化改良，從而增加它們的生長速率和/或改良物的成活力。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，微生物是真菌，特別地，里氏木霉(Trichoderma reesei，也稱為紅褐肉座菌Hypocrea jecorina)，其已經(jīng)通過連續(xù)培養(yǎng)進(jìn)化改良。步驟(i)中的纖維素酶活性可以使用常規(guī)技術(shù)測定，從而評(píng)估纖維素酶活性水平，以確定何時(shí)通過進(jìn)行步驟(ii)來抑制和/或停止微生物的生長。在本發(fā)明的步驟(ii)中，通過一種或多種常規(guī)技術(shù)抑制微生物的生長和酶產(chǎn)生， 所述技術(shù)例如選自熱激、UV照射、射線照射、氣體注射以及所述至少一種微生物的遺傳改良(先于步驟(i))，使得所述至少一種遺傳改良微生物的生長可以得到抑制，例如當(dāng)溫度增加到45°C時(shí)。同時(shí)，可以使用常規(guī)技術(shù)將細(xì)胞破裂，用于上清液中細(xì)胞內(nèi)纖維素酶的釋放。本發(fā)明的步驟(iii)包括將步驟(ii)混合物用至少一種藻類株系接種，所述藻類株系可以在一定條件下代謝所述葡萄糖、纖維二糖、木糖或其它半纖維素糖的至少一種，使得所述至少一種藻類株系產(chǎn)生一種或多種脂肪酸。優(yōu)選地，上述至少一種藻類株系的生長實(shí)質(zhì)上不被存在于混合物中的的一種或多種木質(zhì)素、糠醛、鹽和纖維素酶所抑制。藻類株系還可以生長在選自有氧、缺氧、光養(yǎng)和異養(yǎng)條件的一種或多種條件中。與微生物相似的，步驟(iii)中的藻類可以進(jìn)化改良(使用上述自然選擇技術(shù))， 從而用作脂肪酸、生物燃料、生物柴油和其它碳水化合物產(chǎn)品的改良的來源。在這方面，藻類可以培養(yǎng)用作一種生物燃料、生物柴油或基于碳?xì)浠衔锏漠a(chǎn)品。大多數(shù)藻類需要一定量的光照、二氧化碳和水。因此，藻類通常在開放的池塘和湖泊中培養(yǎng)。然而，當(dāng)在這樣一個(gè)“開放的”系統(tǒng)中培養(yǎng)藻類時(shí)，該系統(tǒng)容易受到其它藻類和細(xì)菌的污染。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明可以利用異養(yǎng)藻類(Stanier等，Microbial World, Fifth Edition, Prentice-Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1986，引入本文以作參考)，其可以在密閉的反應(yīng)器中生長。雖然可以使用許多藻類種類，天然含有大量脂類的藻類是優(yōu)選的，例如以藻類干重計(jì)包含約15-90%、約30-80%、約40-60%或約25-60%的脂類。在本發(fā)明的工作之前， 認(rèn)為天然包含高含量脂類和高含量生物碳?xì)浠衔锏脑孱惥哂械蜕L速率。可以根據(jù)本發(fā)明制備進(jìn)化改良的藻類株系，其顯示出提高的生長速率。藻類生長的條件可以用于對藻類改良。例如，有值得考慮的證據(jù)表明，脂類的積累作為培養(yǎng)基中氮供應(yīng)枯竭的響應(yīng)而在藻類中發(fā)生。研究已經(jīng)分析了培養(yǎng)基中除去氮的樣品，并且觀察到在這種條件下藻類的蛋白質(zhì)含量降低，碳水化合物含量增加，然后接著是脂類含量增加(Richardson 等，EFFECTS OF NITROGEN LIMITATION ON THE GROWTH OF ALGAE ON THE GROWTH AND COMPOSITION OF A UNICELLULAR ALGAE IN CONTINUOUS CULTURE CONDITIONS, Applied Microbiology，1969，第 18 卷，2245-2250 頁，1969，引入本文以作參考)。藻類可以通過多種技術(shù)進(jìn)化改良，包括例如，連續(xù)移植、連續(xù)稀釋、遺傳工程、連續(xù)培養(yǎng)和恒化培養(yǎng)。任一這些技術(shù)可以用于改良藻類。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，藻類可以通過連續(xù)培養(yǎng)而進(jìn)化改良，如PCT申請PCT/US05/05616，或美國專利申請US11/508，286中所公開的，均引入本文作為參考。通過上述方式，藻類可以以多種方法進(jìn)化改良，使得它們的生長速率、成活力以及作為生物燃料或其它碳?xì)浠衔锂a(chǎn)品的實(shí)用性可以得到提高。相應(yīng)地，藻類可以進(jìn)化改良從而增強(qiáng)它們在特定底物上生長的能力。進(jìn)化改良藻類的參數(shù)選擇。通過例示的方式，步驟(iii)中的藻類可以通過例如連續(xù)培養(yǎng)的自然選擇技術(shù)進(jìn)化改良，從而通過進(jìn)化，藻類進(jìn)化成可以適合于使用特定選擇的碳源。這包括通過適用所使用的自然技術(shù)來鑒別并且選擇最快地生長的變種的藻類，所述藻類在特定碳源上比野生型生長更快。這還包括，例如，選擇使用乙酸作為碳源的對木質(zhì)素、糠醛和鹽具有提高的耐受的藻類。需要注意的是，通過使用這些參數(shù)，任一自然選擇技術(shù)可以在本發(fā)明中使用，從而將本發(fā)明中的藻類進(jìn)化改良。在本發(fā)明中，在一定條件下這些進(jìn)化改良的藻類代謝一種或多種選自葡萄糖、纖維二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纖維素糖和/或廢甘油的化合物，并且該藻類使用乙酸作為碳源，使得所述至少一種藻類株系(algae strain)產(chǎn)生一種或多種脂肪酸。這些進(jìn)化改良的藻類還可以在一種或多種選自有氧、缺氧、光養(yǎng)和異養(yǎng)條件的條件下生長。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，當(dāng)本發(fā)明的步驟(iii)在有氧和缺氧條件下實(shí)施時(shí)，藻類采用呼吸作用。在步驟(iii)中，與產(chǎn)生發(fā)酵作用副產(chǎn)物生產(chǎn)者的生物體使用相同量的碳源的藻^ (thealgae using the same amount of carbon source as an organism producing fermentation by-product producer)將只產(chǎn)生至多10%的二氧化碳。在這點(diǎn)上，與轉(zhuǎn)化成二氧化碳的糖相比，更多的糖由藻類用于生長。任選地，微生物或藻類可以是不使用發(fā)酵作用的，并且因此在呼吸作用中產(chǎn)生更少副產(chǎn)物二氧化碳。同時(shí)，步驟(iii)中至少一種藻類株系優(yōu)選地幾乎不或不產(chǎn)生用于所述藻類生長抑制作用的抑制性副產(chǎn)物。本發(fā)明中可以使用的藻類類型是選自綠藻、紅藻、藍(lán)綠藻、藍(lán)細(xì)菌和硅藻的一種或多種。需要注意的是，本發(fā)明可以使用任何在一定條件下代謝葡萄糖、纖維二糖、木糖或其它半纖維素糖的一種或多種的藻類株系，使得藻類株系產(chǎn)生一種或多種脂肪酸。通過例示的方式，步驟(iii)中的使用的藻類可以來自以下藻類分類(1)綠藻門(Division Chlorophyta)(綠藻)；(2)藍(lán)藻門(Division Cyanophyta)(藍(lán)藻)；(3)硅藻門(Division Bacillariophyta)(硅藻)；(4)金藻門(Division Chrysophyta)；(5) Hign (Division Xanthophyta)；(6)隱藻門(Division Cryptophyta)；(7)裸藻門(Division Euglenophyta)；(8) Iiign (Division Ochrophyta)；(9)定鞭藻門(Division Haptophyta)；和(10)甲藻門(Division Dinophyta)。更特別地，藻類可以來自以下藻類物種，其包括在上述分類內(nèi)(括號(hào)內(nèi)的數(shù)字與分類相應(yīng))盒形藻屬(Biddulphia)(8)；油球藻屬(Pinguiococcus) (8)；骨條藻屬(Skeletonema) (8)；球石藻屬(Emiliania)(9)；三毛金藻屬(Prymnesium)(9)；隱定藻(Crypthecodinium) (10)；JplHJpiHig (Anabaenopsis circularis) (2)；^ ^ ^Μ (Ankistrodesmus braunii) (1)；鐮形纖維藻(A.falcatus) (1)；擬氣球藻(Botrydiopsis intercedens) (5)；(Bracteacoccus cinnabarinus)(1)；B. engadiensis(l)；B. minor (Chodat)Petrova(1)；B. terrestris(l)；片球藻(Bracteacoccus sp. ) (1)；片球藻(Bracteacoccus sp. ) (1)；
Bumilleriopsis brevis(5)；^M^MMM (Chilomonas Paramecium) (6)；Chlamydobotrys sp. (1)；Chlamydomonas agloeformis (1)；C. dysosmos(l)；C. mundana Mojave strain Boron strain (1)；萊哈衣藻(-)株(C.reinhardi(-) strain) (1)；橢圓小球藻(Chlorellaellipsoidea) (1)；原始小球藻(C. protothecoides) (1)；蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa) (1)；蛋白核小球藻ATCC 7516 (C. pyrenoidosa ATCC 7516) (1)；蛋白核小球藻C-37-2 (C. pyrenoidosa C-37-2) (1)；蛋白核小球藻 Emerson (C. pyrenoidosa Emerson) (1)；蛋白核小球藻7-11-05 (C. pyrenoidosa 7-11-05) (1)；小球藻(C. vulgaris) (1)；小球藻ATCC 9765 (C. vulgaris ATCC 9765) (1)；小球藻 Emerson (C. vulgaris Emerson) (1)；Pratt-Trealease (C. vulgaris Pratt-Trealease) (1)；小球藻 viridis 變禾中(C. vulgaris var. viridis) (1)；Chlorellidium tetrabotrys(5)；Chlorocloster engadinensis(5)；Chlorococcum macrοstigmatum(1)；綠球藻(Chlorococcum sp. ) (1)；弗氏綠膠藻(Chlorogloeafritschii) (2)；長綠梭藻(Chlorogonium elongatum) (1)；(Coccomyxa elongata)(1)；小環(huán)藻(Cyclotella sp. ) (3)；(Dictyochloris fragrans)(1)；纖細(xì)裸藻(Euglenagracilis) (7)；纖細(xì)裸藻 Vischer (E. gracilis Vischer) (7)；纖細(xì)裸藻 bacillaris 變禾中(E. gracilis var. bacillaris) (7)；纖細(xì)裸藻 saccharophila 變禾中(E. gracilis var. saccharophila) (7)；雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis) (1)；Navicula incerta Grun. (3)；N. pelliculosa(3)；Neochloris alveolaris (1)；N. aquatica Starr (1)；N. gelatinosa Herndon (1)；N. pseudo alveolaris Deason (1)；
新綠藻(Neochloris sp. ) (1)；有棱菱形藻相似變種(Nitzschia angularis var. affinis(3) (Grun.)perag.)；N. chlosterium (Ehr. ) (3)；N. curvilineata Hust. (3)；絲狀菱形藻(N.filiformis) (3)；碎片菱形藻(N. frustulum (Kurtz. )) (3)；N. Iaevis Hust. (3)；灰色念珠藻(Nostoc muscorum) (2)；馬含棕鞭藻(Ochromonas malhamensis) (4)；短棘盤星藻(Pediastrum boryanum) (1)；二角盤星藻(P. duplex) (1)；Polytoma obtusum(l)；眼點(diǎn)素衣藻(P.ocellatum) (1)；素衣藻(P.uvella)(1)；Polytomella caeca(or coeca)(1)；Prototheca zopfii (1)；圓頭柵藻(Scenedesmus acuminatus) (1)；(S. acutiformis) (1)；S. costulatus Chod, var. chlorelloides (1)；二形柵藻(S. dimorphus) (1)；斜生柵藻(S.obliquus) (1)；四尾柵藻(S.quadricauda) (1)；Spongiochloris excentrica(1)；S. Iamellata Deason (1)；S. spongi osus(l)；Spongi ochl ori s sp. (1)；Spongiococcum alabamense (1)；S. excentricum(l)；S. excentricum Deason et Bold(I)；S. multinucleatum(l)；(Stichococcus bacillaris) (1)；軟克里藻(S.subtilis) (1)；Tolypothrix tenuis (2)；Tribonema aequale(5)；和小型黃絲藻(T. minus) (5)。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，藻類可以來自綠藻門(小球藻屬和原壁菌屬 (Protocheca))、鞭藻門(杜氏藻屬(Dunaliella))、硅藻門(舟形藻屬和菱形藻屬)、褐藻門(棕鞭藻屬)、甲藻門(螺溝藻屬(Gyrodinium))和眼蟲門(Euglenozoa)(裸藻屬)。 更優(yōu)選地，藻類是選自單腸藻(Monalanthus Salina)；叢粒藻(Botryococcus Braunii)； 原始小球藻(Chlorella prototecoides) ；Outirococcus sp.；斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)；微綠球藻(Nannochloris sp.)；巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)(鹽生杜氏藻 D. Salina)；舟形藻(Navicula pelliculosa) ；Radiosphaera negevensis ；長耳盒形藻(Biddulphia aurita)；普通小球藻(Chlorella vulgaris)；谷皮菱形藻(Nitzschia palea) ；；^ !(Ochromonas dannica)亥^、王求· (Chrorella pyrenoidosa)； 腰帶多甲藻(Peridinium cinctum) ；Neochloris oleabundans ；多形卵囊藻(Oocystis polymorpha)；金色藻(Chrysochromulina spp.)；彎曲ft藻(Scenedesmus acutus) ；ft藻 (Scenedesmus spp.)；微小小球藻(Chlorella minutissima)；小定鞭金藻(Prymnesium parvum)；舟形藻(Navicula pelliculosa) ；二形柵藻(Scenedesmus dimorphus)；螺翼藻(Scotiella sp.)；小球藻(Chorella spp.)；纖細(xì)裸藻(Euglena gracilis)；和紫球藻 (Porphyridium cruentum)的一禾中。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，藻類株系是原始小球藻(Chlorella protothecoides)，并且已經(jīng)使用上述的技術(shù)和操作通過連續(xù)培養(yǎng)進(jìn)化改良。藍(lán)細(xì)菌也可以用于本發(fā)明中。藍(lán)細(xì)菌是常常稱之為“藍(lán)綠藻”的原核生物(單細(xì)胞生物)。雖然大多數(shù)藻類是真核的，是藍(lán)細(xì)菌是最常見的例外。藍(lán)細(xì)菌通常是單細(xì)胞的， 但是可以觀察到菌落形式或絲狀體形式，他們中的一些區(qū)分成為不同角色。出于所主張的發(fā)明的目的，藍(lán)細(xì)菌是考慮使用的藻類。原始小球藻(Chlorellaprotothecoides)和鹽生杜氏藻(Dunaliella Sal ina) 是已經(jīng)進(jìn)化改良的、培養(yǎng)并且收獲用于生物柴油制備的物種。以下涉及培育不同類型的藻類，然后收獲藻類用于制備生物柴油的目的的公開內(nèi)容引入本文以作參考-Xu 等，HIGH QUALITY BIODESEL PRODUCTION FROM A MICROALGA CHLORELLA PROTHECOIDES BY HETEROTROPHIC GROWTH IN FERMENTERS,Journal of Biotechnology，第 126 卷，499-507，2006，-Kessler, Erich, PHYSIOLOGICAL AND BIOCHEMICAL CONTRIBUTIONS TO THE TAXONOMY OF THE GENUS PROTOTHECA，III. UTILIZATION OF ORGANIC CARBON AND NITROGEN COMPOUNDS, Arch Microbiol，第 132 卷，103-106，1982，-Johnson D，1987， OVERVIEW OF THE DOE/SERI AQUATIC SPECIES PROGRAM FY 1986 SOLAR ENERGY INSTITUTE,-Pratt 等，PRODUCTION OF PROTEIN AND LIPID BY CHLORELLA VULGARIS AND CHLORELLA PYRENOIDOSA, Journal of Pharmaceutical Sciences,第 52 卷，第 10 期， 979-9842006，和-Sorokin, MAXIMUM GROWTH RATES OF CHLORELLA IN STEADY-STATE AND IN SYNCHRONIZED CULTURES, Proc. N. A. S，第 45 卷，1740-1743，1959.-J. Ε. Zajic 禾口 Y. S. Chiu，HETEROTROPHIC CULTURE OF ALGAE, Biochemical Engineering, Faculty of Engineering Science, University of Western Ontario, London.通過使用本發(fā)明的方法，將混合物使用步驟(iii)中至少一種藻類株系接種導(dǎo)致藻類在一定條件下代謝葡萄糖、纖維二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纖維糖的至少一種，使得所述至少一種藻類株系產(chǎn)生一種或多種包括脂肪酸的化合物。特別地，本發(fā)明步驟(iii)中包括為了一種或多種例如脂肪酸、碳?xì)浠衔?、蛋白質(zhì)、色素、 例如多糖和單糖的糖和甘油的化合物的細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)，培養(yǎng)進(jìn)化改良的藻類并使其生長。所得的脂肪酸、碳?xì)浠衔?、蛋白質(zhì)、色素、例如多糖和單糖的糖、和甘油可以用于生物燃料、化妝品、食物、機(jī)械潤滑脂、著色和醫(yī)藥用生產(chǎn)。在步驟(iv)中，脂肪酸、碳?xì)浠衔铩⒌鞍踪|(zhì)、色素、例如多糖和單糖的糖和甘油可以從藻類中回收?；厥詹襟E可以通過常規(guī)技術(shù)和其它技術(shù)完成，所述常規(guī)技術(shù)包括培養(yǎng)物中藻類的一次或多次分級(jí)從而獲得含有化合物的成分，所述其它技術(shù)包括所述至少一種含有脂肪酸的藻類株系的過濾-離心分離、絮凝、溶劑萃取、酸堿萃取、超聲波處理、微波、 壓榨、蒸餾、熱蒸發(fā)、均質(zhì)、加氫裂解(流化催化裂化)和干燥。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，步驟(iv)中回收所得的上清液可以再使用。此外，可以任選地將回收的脂肪酸分離和化學(xué)處理(例如，通過酯基轉(zhuǎn)移作用)， 并從而制成可以摻入發(fā)動(dòng)機(jī)燃料的生物燃料(生物柴油)。在這發(fā)明，本發(fā)明的藻類株系可以產(chǎn)生可以用作油脂精煉中加氫裂解原料的烴鏈，以制備一種或多種選自辛烷、汽油、石油溶劑油、火油、柴油和其它作為溶劑、塑料、油類、油脂和纖維的石油產(chǎn)品的化合物。直接酯基轉(zhuǎn)移作用可以在藻類株系的細(xì)胞上完成，以制備用于生物柴油燃料的脂肪酸。直接酯基轉(zhuǎn)移作用的方法是熟知的，包括破碎藻類細(xì)胞、釋放脂肪酸并通過用甲醇或乙醇的堿或酸法的酯基轉(zhuǎn)移作用以制得生物柴油燃料。本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是藻類株系可以適用于使用通過酯基轉(zhuǎn)移作用產(chǎn)生的廢甘油作為碳源而不需預(yù)處理或精煉，以制備用于生物柴油生產(chǎn)的脂肪酸。粗甘油是酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的副產(chǎn)物，其包括甘油和雜質(zhì)，例如脂肪酸成分、油性成分、酸性成分、堿性成分、皂成分、醇成分(例如甲醇和乙醇)、溶劑(N-己烷)、鹽和/或二醇。由于存在于粗甘油中雜質(zhì)的數(shù)量和類型，微生物在粗甘油上表現(xiàn)為基本不生長到不生長。然而，可以使微生物(例如，藻類或細(xì)菌)進(jìn)化改良從而利用粗甘油作為主要碳源。確定特定類型的微生物是否可以在粗甘油存在中生長的初期試驗(yàn)是精煉甘油試驗(yàn)。精煉甘油試驗(yàn)包括在含有精煉甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。精煉甘油試驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基可以具有或不具有例如葡萄糖的碳源。然而，精煉甘油試驗(yàn)中的培養(yǎng)基必須含有足夠量的甘油，從而可以確定微生物表現(xiàn)出微生物的最小代謝能力。優(yōu)選地，每升培養(yǎng)基含有 10ml-50ml精煉甘油、0. Iml-IOOml精煉甘油和anl-15ml精煉甘油。如果精煉甘油試驗(yàn)獲得陽性結(jié)果(即，微生物在培養(yǎng)基中生長)，那么可以將微生物進(jìn)化改良從而在含有粗甘油的培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)基優(yōu)選含有例如10-100%作為碳源的粗甘油、20-90%作為碳源的粗甘油、30-75%作為碳源的粗甘油、40-75%作為碳源的粗甘油或50. 01-55%作為碳源的粗甘油。的確，一些微生物菌株已經(jīng)進(jìn)化改良從而可以生長在含有100%粗甘油的培養(yǎng)基中。使用預(yù)處理的生物質(zhì)混合物中的特定碳源，根據(jù)本發(fā)明獲得的產(chǎn)生細(xì)胞外和/ 或細(xì)胞內(nèi)纖維素酶、半纖維素酶和漆酶的進(jìn)化改良的微生物可以具有最大生長速率，其比未進(jìn)化改性的同種微生物的生長速率大至少5 %、優(yōu)選地10 %、15 %、25 %、50 %、75 %、 100%,200%,25% -100%,25% -100%,50% -150%、25_200%、大于 200%、大于 300%或大于400%。使用預(yù)處理的生物質(zhì)混合物中的步驟(i)中釋放的多糖和單糖作為碳源，根據(jù)本發(fā)明獲得的進(jìn)化改良的藻類可以具有最大生長速率，其比未進(jìn)化改良的同種的藻類的生長速率大至少 5%、優(yōu)選地 10%、15%、25%、50%、75%、100%、200%、25% -100%, 25% -100%,50% -150%、25-200%、大于 200%、大于 300%或大于 400%。雖然可以想像的是，培養(yǎng)自生物柴油制備副產(chǎn)品的微生物的最重要商業(yè)用途將是使用微生物本身以制備例如生物燃料、生物柴油、“生物”-碳?xì)浠衔锂a(chǎn)物、可再生碳?xì)浠衔锂a(chǎn)物和基于脂肪酸的產(chǎn)品，本發(fā)明不僅限與該實(shí)施方式。例如，如果微生物是藻類，那么可使該藻類可以從生物燃料制品的副產(chǎn)品生長并且收獲用作食品、藥品和營養(yǎng)補(bǔ)充物。本發(fā)明獲得的生物燃料可以直接使用或作為用于某些產(chǎn)品的石油的替代物。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的生物燃料(例如，生物柴油)可以作為與其它石油產(chǎn)品或石油替代物的摻混物使用，從而獲得例如發(fā)動(dòng)機(jī)汽油和餾出燃油組合物的燃料；例如溶劑和潤滑油的精制非燃料產(chǎn)品；和例如石腦油和各種精煉氣體的石油化工業(yè)的原料。例如，上述生物燃料可以直接用于，或與其它基于石油的產(chǎn)品摻混從而制備溶劑； 涂料；漆；和印刷油墨；潤滑油；用于汽車內(nèi)燃機(jī)和其它機(jī)械的油脂；用于糖果制備。包裝、 蠟燭、火柴和擦亮劑中的蠟；石油凝膠；浙青；石油焦炭；和石油原料，其用作主要用于化學(xué)試劑、合成橡膠和各種塑料的得自石油的化學(xué)原料。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，根據(jù)本發(fā)明制備的生物柴油可以用于柴油發(fā)動(dòng)機(jī)中，或與基于石油的餾出燃油成分以一定比例摻混，從而所得石油替代物的量可以是總組分重量的約5-95 %、15-85 %、20-80 %、25-75 %、50-75 %和75-95 %。這些成分可以以任何合適的方式混合。給壓縮點(diǎn)火內(nèi)燃機(jī)提供燃料的方法包括將空氣吸入壓縮點(diǎn)火內(nèi)燃機(jī)的汽缸；通過汽缸中活塞的壓縮行程壓縮空氣；在逼近壓縮行程末端時(shí)將含有生物柴油的燃料注射到壓縮空氣中；和通過壓縮點(diǎn)火內(nèi)燃機(jī)運(yùn)作期間的汽缸中壓縮熱將燃料點(diǎn)燃。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，生物柴油可以用作潤滑劑或用于給壓縮點(diǎn)火內(nèi)燃機(jī)提供燃料的方法中?？蛇x地，生物燃料可以被進(jìn)一步處理從而獲得其它在石油中發(fā)現(xiàn)的碳?xì)浠衔铮?例如鏈烷烴(例如，甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、異丁烷、戊烷和己烷)、芳香族化合物(例如，苯和萘)、環(huán)烷烴(例如，環(huán)己烷和甲基環(huán)戊烷)、烯烴(例如，乙烯、丁烯和異丁烯)、炔(例如，乙炔和丁二烯)。然后，所得碳?xì)浠衔锟梢砸来斡糜诨谑偷漠a(chǎn)品，例如溶劑；涂料；漆；和印刷油墨；潤滑油；用于汽車內(nèi)燃機(jī)和其它機(jī)械的油脂；用于糖果制備。包裝、蠟燭、火柴和擦亮劑中的蠟；石油凝膠；浙青；石油焦炭；和石油原料，其用作主要用于化學(xué)試劑、合成橡膠和各種塑料的得自石油的化學(xué)原料。下面的實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行了舉例說明。明顯的是，可以做出各種變化和改進(jìn)而不脫離如權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
本發(fā)明方法的一個(gè)示例性實(shí)施方式可參見附圖4，并且詳述如下。在該實(shí)施例中，切碎的柳枝稷的植物生物質(zhì)材料經(jīng)過酸水解的預(yù)處理(硫酸 0. 5-2. 0% )和熱處理(120°C -2000C )。該預(yù)處理過程產(chǎn)生了用于上述步驟(i)的混合物。該混合物包含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、糠醛和乙酸。在步驟(i)中，(原位的酶制備)將該混合物在以下條件下用具有以下特性的進(jìn)化改良微生物菌株——里氏木霉(Trichoderma Reesei)——接種·使改良的里氏木霉(Trichoderma Reesei)進(jìn)化，從而更有效地代謝預(yù)處理的柳枝稷，并且更好地耐受糠醛和乙酸(命名為EVG22030)。 所述菌株產(chǎn)生對柳枝稷特異性的外部纖維素酶。·在需氧環(huán)境中里氏木霉EVG22030的接種和生長?！の⒕Юw維素水解成葡萄糖、纖維二糖?！に馕唇?jīng)預(yù)處理有效處理的半纖維素糖。在培養(yǎng)和酶制備階段后，通過50°C下的熱激終止里氏木霉(Trichoderma Reesei) EVG22030的生長。在步驟(iii)中，將來自步驟(ii)的混合物在以下條件下用具有以下特性的進(jìn)化改良的藻類株系——原始小球藻(Chlorella protothecoides)——接種·在異養(yǎng)環(huán)境中使原始小球藻(Chlorella protothecoides)進(jìn)化，從而使用從預(yù)處理的柳枝稷釋放的碳源(通過EVG22030酶)，并且命名為EVG15018。 在異養(yǎng)環(huán)境中原始小球藻(Chlorella Protothecoides)EVG15018的接種和生長?！?EVG15018代謝葡萄糖、纖維二糖、木糖和其它半纖維素糖、廢甘油，并且使用乙酸作為碳源?！つ举|(zhì)素、糠醛和鹽的存在不抑制生長。· EVG15018產(chǎn)生40%或更多的脂肪酸(細(xì)胞干重)。·然后使藻類在一定條件下生長，并且產(chǎn)生產(chǎn)物脂肪酸。然后將藻類細(xì)胞和脂肪酸通過過濾和細(xì)胞干燥回收。然后，在干細(xì)胞上實(shí)施直接酯基轉(zhuǎn)移作用(超聲波處理，通過甲醇或乙醇的堿法或酸法)以制備生物柴油燃料。還將廢甘油回收和循環(huán)。所得生物柴油燃料可以直接用于任何汽車、火車、發(fā)電機(jī)、船等等的柴油發(fā)動(dòng)機(jī)。雖然已參照本發(fā)明的操作性的實(shí)施方式具體地說明并且指出了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在不脫離本發(fā)明精神的前提下，可以做出各種變化、改進(jìn)、替換和省略。因此，本發(fā)明包括那些所付權(quán)利要求范圍內(nèi)的等價(jià)物。表1——產(chǎn)生細(xì)胞外和/細(xì)胞內(nèi)纖維素酶的微生物生物體的實(shí)例
權(quán)利要求
1.一種制備脂肪酸的方法，該方法包括(i)在一定條件下將纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的至少一種的混合物用至少一種產(chǎn)生一種或多種纖維素酶、半纖維素酶和漆酶的微生物菌株接種，以制備葡萄糖、纖維二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纖維素糖的至少一種，所述纖維素酶、半纖維素酶和漆酶水解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的至少一種；( )抑制所述至少一種微生物菌株的生長；和(iii)在一定條件下將步驟(ii)的混合物用代謝所述葡萄糖、纖維二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纖維素糖的至少一種的藻類株系接種，使得所述至少一種藻類株系產(chǎn)生一種或多種脂肪酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(i)中的混合物還包含糠醛、酚類化合物和乙酸的至少一種。
3.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(i)中的混合物得自生物質(zhì)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述生物質(zhì)包括植物生物質(zhì)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述生物質(zhì)得自植物廢物或動(dòng)物廢物。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述植物生物質(zhì)經(jīng)過通過酸水解和熱處理的預(yù)處理，以制備在步驟(i)中接種的所述混合物。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述植物生物質(zhì)包含10-35%木質(zhì)素；15-35%半纖維素；和30-60%纖維素。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述植物生物質(zhì)得自選自柳枝稷、玉米秸稈和植物混合廢物的至少一種。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種微生物菌株是細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)纖維素酶、 半纖維素酶和漆酶生產(chǎn)者微生物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)纖維素酶生產(chǎn)者微生物選自原核生物、細(xì)菌、古菌和真核生物和真菌。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)纖維素酶生產(chǎn)者微生物是真菌或細(xì)菌，其選自腐質(zhì)霉屬(Humicola)、木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)、 瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、桿菌屬(Bacillus)、噬纖維菌屬(Cytophaga)和生孢噬纖維菌屬(Sporocytophaga)、灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、木素木霉(Trichoderma lignorum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、撫抱青霉(Penicillium verruculosum)、白色瘤胃球菌(ruminococcus albus)、枯草芽抱桿菌 (Bacillus subtilis)、熱葡糖昔酶芽胞桿菌(Bacillus thermoglucosidasius)、噬纖維菌 (Cytophaga spp.)禾口Ur包 Μ 千(Sporocytophaga spp.)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述至少一種微生物菌種是真菌。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述至少一種微生物菌株是里氏木霉(紅褐肉座菌 Hypocrea jecorina)。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種微生物菌株耐受生物質(zhì)預(yù)處理產(chǎn)生的一種或多種化合物，其中所述一種或多種化合物選自糠醛、乙酸和其它雜質(zhì)。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種微生物菌株已進(jìn)化改良，從而與未改良的微生物野生型形式相比，更有效地代謝作為目標(biāo)的經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)，并且更好地耐受糠醛、 酚類化合物和乙酸。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述至少一種進(jìn)化改良的微生物菌株產(chǎn)生一種或多種纖維素酶、半纖維素酶和/或漆酶，從而與未改良的微生物野生型形式相比，所述進(jìn)化改良的微生物菌株具有更大的代謝具有木質(zhì)素的纖維素和半纖維素的能力。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種微生物菌株已經(jīng)通過選自連續(xù)移植、連續(xù)稀釋、遺傳工程、連續(xù)培養(yǎng)和恒化培養(yǎng)的至少一種方法進(jìn)化改良。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述方法是連續(xù)培養(yǎng)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述至少一種進(jìn)化改良的微生物菌株是需氧真菌。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述至少一種微生物菌株是里氏木霉(紅褐肉座菌)，并且已經(jīng)通過連續(xù)培養(yǎng)進(jìn)化改良。
21.權(quán)利要求1的方法，其中已經(jīng)將所述至少一種微生物菌株對特定生物質(zhì)植物進(jìn)化改良。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種或多種纖維素酶是選自內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β -葡萄糖苷酶、和半纖維素酶和任選的漆酶的至少一種。
23.權(quán)利要求1的方法，還包括測量步驟(i)中的纖維素酶和/或半纖維素酶的活性， 并且根據(jù)酶的活性來進(jìn)行至步驟(ii)。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述抑制步驟(ii)通過選自熱激、UV照射、射線照射、氣體注射、均質(zhì)和步驟(i)之前的所述至少一種微生物的遺傳改良的一種或多種方法實(shí)施， 使得當(dāng)溫度升高到45°C時(shí)，所述至少一種遺傳改良的微生物的生長受到抑制。
25.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(iii)中的所述至少一種藻類株系選自綠藻、紅藻、藍(lán)綠藻、藍(lán)細(xì)菌和硅藻。
26.權(quán)利要求25的方法，其中步驟(iii)中的所述至少一種藻類株系選自單腸藻(Monalanthus Salina)；叢粒藻(Botryococcus Braunii)；原始小球藻(Chlorella prototecoides) ；Outirococcus sp.；斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)；微綠球藻 (Nannochloris sp.)；巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)(鹽生杜氏藻 D. Salina)；舟形藻(Navicula pelliculosa) ；Radiosphaera negevensis ；長耳盒形藻(Biddulphia aurita)；普通小球藻(Chlorella vulgaris)；谷皮菱形藻(Nitzschia palea)；丹麥掠鞭藻(Ochromonas dannica)；蛋白核小球藻(Chrorella pyrenoidosa)；腰帶多甲藻 (Peridinium cinctum) ；Neochloris οIeabundans ；多形卵囊藻(Oocystis polymorpha)； 金色藻(Chrysochromulina spp.)；彎曲柵藻(Scenedesmus acutus)；柵藻(Scenedesmus spp.)；微小小球藻(Chlorella minutissima)；小定鞭金藻(Prymnesium parvum)；舟形藻(Navicula pelliculosa) ；二形柵藻(Scenedesmus dimorphus)；螺翼藻(Scotiella sp.)；小球藻(Chorella spp.)；纖細(xì)裸藻(Euglena gracilis)；禾口紫球藻(Porphyridium cruentum)。
27.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(iii)中的至少一種藻類株系的生長不因?yàn)槟举|(zhì)素、 糠醛、酚類化合物、鹽和纖維素酶和/或半纖維素酶和/或漆酶的存在而被抑制。
28.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(iii)中的所述至少一種藻類株系可以在選自需要、缺氧、光養(yǎng)和異養(yǎng)的一種或多種條件中生長。
29.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(iii)中的所述至少一種或多種藻類株系通過選自連續(xù)移植、連續(xù)稀釋、遺傳工程、連續(xù)培養(yǎng)和恒化培養(yǎng)的至少一種方法進(jìn)化改良。
30.權(quán)利要求四的方法，其中所述方法是連續(xù)培養(yǎng)。
31.權(quán)利要求四的方法，其中所述至少一種藻類株系是已通過連續(xù)培養(yǎng)方法進(jìn)化改良的原始小球藻。
32.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(iii)中的所述至少一種藻類株系代謝所述葡萄糖、 纖維二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纖維素糖和廢甘油的至少一種。
33.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(iii)中的所述至少一種藻類株系使用乙酸作為碳源。
34.權(quán)利要求1的方法，其中當(dāng)步驟(iii)處于乙酸和異養(yǎng)條件下時(shí)，所述至少一種藻類株系使用呼吸作用。
35.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(iii)中，當(dāng)藻類與產(chǎn)生發(fā)酵副產(chǎn)物生產(chǎn)者的生物體使用相同量的碳源時(shí)，該方法產(chǎn)生至多10%的二氧化碳。
36.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(iii)中的所述至少一種藻類株系不產(chǎn)生抑制所述藻類生長的抑制性副產(chǎn)物。
37.權(quán)利要求1的方法，還包括(iv)回收來自所述至少一種藻類株系的一種或多種脂肪酸。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述回收步驟(iv)包括選自所述至少一種含有脂肪酸的藻類菌株的過濾-離心分離、絮凝、溶劑萃取、酸提取、堿提取、均質(zhì)、超聲處理、微波、壓榨、 蒸餾、熱蒸發(fā)、氫化裂解(流體催化裂化)和干燥的至少一種。
39.權(quán)利要求37的方法，其中步驟(iv)中回收的上清液可以再使用。
40.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(iii)還包括為了選自脂肪酸、碳?xì)浠衔?、蛋白質(zhì)、 色素、例如多糖和單糖的糖、和甘油的至少一種化合物的細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)，在一定條件下培養(yǎng)所述至少一種藻類并使其生長。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述至少一種化合物可以用于柴油、化妝品、食品、機(jī)械潤滑脂、著色和醫(yī)藥用途的制備。
42.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種藻類株系產(chǎn)生烴鏈，其可以用作油精煉廠中氫化裂化的原料，以制備選自辛烷、汽油、石油溶劑油、柴油和其它作為溶劑、塑料、油、潤滑脂和纖維的石油產(chǎn)品的一種或多種化合物。
43.權(quán)利要37的方法，還包括在步驟(iv)之后，所述至少一種藻類株系細(xì)胞的直接酯基轉(zhuǎn)移作用，以制備用于生物柴油燃料的脂肪酸。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述直接酯基轉(zhuǎn)移作用包括破裂藻類細(xì)胞、釋放脂肪酸和通過使用甲醇或乙醇的堿法或酸法的酯基轉(zhuǎn)移作用，以制備生物柴油燃料。
45.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種藻類株系適用于使用廢甘油作為碳源，以制備用于生物柴油燃料的脂肪酸，所述廢甘油是通過未經(jīng)預(yù)處理或精煉的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)而產(chǎn)生的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備脂肪酸的方法，通過(i)在一定條件下將纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的至少一種的混合物用至少一種產(chǎn)生一種或多種纖維素酶、半纖維素酶和漆酶的微生物菌株接種，以制備葡萄糖、纖維二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纖維素糖的至少一種，所述纖維素酶、半纖維素酶和漆酶水解至少纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的至少一種；(ii)抑制所述至少一種微生物菌株的生長；(iii)在一定條件下將步驟(ii)的混合物用至少一種代謝所述葡萄糖、纖維二糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或其它半纖維素糖的至少一種的藻類株系接種，使得所述至少一種藻類株系產(chǎn)生一種或多種脂肪酸；和任選地(iv)從所述至少一種藻類株系回收所述一種或多種脂肪酸。
文檔編號(hào)C10L1/02GK102203229SQ200980131063
公開日2011年9月28日 申請日期2009年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月2日
發(fā)明者尤德斯·德克雷西 申請人:尤德斯·德克雷西