專利名稱：氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法
專利說(shuō)明氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法 技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，特別是“3′-脫氧-3′-氟代-胸腺嘧啶核苷在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法”。
該方法的實(shí)質(zhì)是基于腫瘤細(xì)胞增殖周期-S階段-細(xì)胞介質(zhì)中高濃度的胸腺嘧啶核苷激酶-1(TK1)的生物化學(xué)，以3’-脫氧-3’-氟代-胸腺嘧啶核苷-5’-單磷酸衍生物(FLT-5’-MP)為例，對(duì)捕獲富集后的生存循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行的質(zhì)譜鑒定。
背景技術(shù) 原發(fā)腫瘤細(xì)胞經(jīng)自然、診療脫落后，可進(jìn)入外周血循環(huán)系統(tǒng)。部份能承受并逃脫免疫系統(tǒng)殺滅的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，侵潤(rùn)上皮組織形成最終致命的轉(zhuǎn)移灶。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲、鑒定、計(jì)數(shù)對(duì)亞健康人群的早期普查，進(jìn)行腫瘤的臨床分期，手術(shù)化療放療的個(gè)體優(yōu)化方案具有獨(dú)特不可替代的意義。但是，由于外周血循環(huán)系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞的極低濃度，即每十億正常血液細(xì)胞僅含低達(dá)數(shù)個(gè)腫瘤細(xì)胞，由此產(chǎn)生對(duì)變異腫瘤細(xì)胞捕獲、鑒定、計(jì)數(shù)過(guò)程中的假陰-陽(yáng)性問(wèn)題。消除假陰-陽(yáng)性問(wèn)題對(duì)變異腫瘤細(xì)胞捕獲、鑒定和計(jì)數(shù)的影響是一個(gè)目前尚沒有解決好的世界性難題。
循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTCs的定義1，腫瘤細(xì)胞密度小于1.077克/毫升，而血液正常細(xì)胞及粒細(xì)胞的細(xì)胞密度大于1.077克/毫升。2，細(xì)胞相對(duì)大小，腫瘤細(xì)胞的直經(jīng)一般為6至30微米，血液中最大白細(xì)胞的直徑為8至11微米。3，腫瘤細(xì)胞形態(tài)為不規(guī)則的圓形或卵圓形態(tài)。4，細(xì)胞核DAPI陽(yáng)性反應(yīng)(DAPI4’，6-diamidino-2-phenylidole)。5，細(xì)胞角蛋白8，18，19等呈陽(yáng)性，在上皮組織中成對(duì)表達(dá)，細(xì)胞角蛋白的陽(yáng)性表達(dá)在蛋白質(zhì)水平被證明是上皮源性腫瘤細(xì)胞的較敏感和較特異的標(biāo)志物。6，由于CTCs不表達(dá)白細(xì)胞共同抗原CD45，CD45檢測(cè)為陰性。
目前用于腫瘤診斷的方法可歸為三大類病理學(xué)，影像學(xué)和血清學(xué)。外周血CTCs的CellSearch檢測(cè)儀目前已是被FDA認(rèn)可的靈敏檢測(cè)手段之一。但其對(duì)捕獲富集后的CTCs鑒定法，可歸納為單克隆抗體對(duì)腫瘤表達(dá)蛋白的識(shí)別或以核酸為基礎(chǔ)的測(cè)定。CTCs質(zhì)譜鑒定法基于以下三個(gè)不同領(lǐng)域的技術(shù)支持背景。
1.捕獲富集鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞技術(shù) CTCs指自發(fā)或因診療操作進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。自1869年發(fā)現(xiàn)CTCs以來(lái)，其生物行為已漸為人們重視。腫瘤細(xì)胞有其特異的生長(zhǎng)周期。所有生存細(xì)胞或者處于休整G0態(tài)，或者處于活性階段。腫瘤細(xì)胞的增殖是由G0態(tài)進(jìn)入第一階段的G1態(tài)，在此準(zhǔn)備進(jìn)入合成階段的S態(tài)，所謂S態(tài)指細(xì)胞核DNA的合成。隨后進(jìn)入滯后期的G2階段，然后進(jìn)入完成細(xì)胞的有絲分裂的M階段。在此DNA分離為兩相同的染色單體、整個(gè)細(xì)胞一分為二。細(xì)胞分裂周期中，DNA的合成不但在細(xì)胞介質(zhì)中進(jìn)行，同時(shí)也可在線粒體中合成。兩種不同的異構(gòu)酶胸苷激酶TK1與胸腺嘧啶核苷激酶-2(TK2)，分別在細(xì)胞介質(zhì)與線粒體中對(duì)胸腺嘧啶核苷(下面簡(jiǎn)稱胸苷)的5’位羥基進(jìn)行磷酸化反應(yīng)。TK1的濃度可在G1-S轉(zhuǎn)變期增加10-20倍之多，并于G2及M階段繼續(xù)保持高濃度?；氐紾0和G1階段后，TK1則迅速降解回到正常水平。與此相反，線粒體中的TK2濃度及活性不隨細(xì)胞增殖周期的影響。由于TK1在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期的S階段特征性的激酶表達(dá)方式，TK1成為腫瘤治療的靶點(diǎn)及檢測(cè)鑒定的可靠方法，目前被公認(rèn)為表征腫瘤細(xì)胞的黃金標(biāo)準(zhǔn)。CTCs的臨床應(yīng)用近5年獲得實(shí)質(zhì)進(jìn)展，主要取決以下領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展。
(1-1)免疫細(xì)胞化學(xué) 隨著腫瘤細(xì)胞的不斷增殖，85％的上皮屬性腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)表達(dá)一種表皮細(xì)胞黏附分子的糖蛋白(EpCAM)，以增加其相互識(shí)別，擴(kuò)散能力并使之與腫瘤母體脫離，進(jìn)而破壞周邊宿主結(jié)締組織，并進(jìn)入脈管系統(tǒng)形成轉(zhuǎn)移灶。與此相反，周血循環(huán)系統(tǒng)的細(xì)胞成分無(wú)表達(dá)該表皮細(xì)胞黏附分子的生物基礎(chǔ)。由此為相應(yīng)的抗體提供了識(shí)別、捕獲周血循環(huán)系統(tǒng)CTCs的笫一選擇性。
(1-2)捕獲富集技術(shù) 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)表明，腫瘤脫離細(xì)胞的速度大致為1×10-5到3×10-6CTCs/天/克腫瘤組織。因此，測(cè)定周血循環(huán)系統(tǒng)的CTCs計(jì)數(shù)，可用于腫瘤的早期診斷，腫瘤手術(shù)、化療評(píng)估的方法。但是，CTCs的濃度極低，大約為每10億分之1，或每毫升含5-1281CTCs。因此，有效的捕獲、富集CTCs為技術(shù)關(guān)鍵。有市場(chǎng)前景的兩項(xiàng)捕獲、富集技術(shù)為免疫磁珠流體的CellSearch和由78,000個(gè)帶抗體的微型柱組成的芯片CTC-Chip。目前美國(guó)FDA唯一批準(zhǔn)的CellSearch技術(shù)，以及捕獲、富集CTCs潛力看好的美國(guó)麻省總醫(yī)院研制的芯片技術(shù)CTC-Chip都是基于識(shí)別腫瘤細(xì)胞特征EpCAM的免疫抗體。此外，聚碳酸酯膜過(guò)濾分離技術(shù)，以及采用Ficoll-Paque為介質(zhì)的離心分離技術(shù)，均可分離不同純度的CTCs。
(1-3)捕獲細(xì)胞的鑒定 CellSearch和CTC-Chip的腫瘤細(xì)胞的鑒定法基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生物標(biāo)記物分折。上皮細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性，無(wú)論免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)還是轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)都存在著一定的局限性，不能排除假陽(yáng)性。DAPI陽(yáng)性，即鑒定DNA的AT部位蘭色熒光法、以及CD45顯色計(jì)數(shù)陰性，即CK+/DAPI+/CD45-。該組合鑒定法為目前鑒定CTCs細(xì)胞水平的第二選擇性，并為FDA批準(zhǔn)。且優(yōu)于Adams所報(bào)導(dǎo)的CTCs直接從微流控捕獲后電導(dǎo)計(jì)數(shù)法。
(1-4)假陽(yáng)性問(wèn)題 鑒定捕獲細(xì)胞的假陽(yáng)性問(wèn)題可歸于以下因素免疫磁珠流體捕獲的腫瘤細(xì)胞基本為死亡細(xì)胞，目前捕獲效力達(dá)106富集度的CTC-Chip技術(shù)的生存細(xì)胞純度為50％。變異中的基因型-表現(xiàn)型無(wú)疑對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定法，以核酸為基礎(chǔ)的PCR，RT-PCR鑒定法產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。有關(guān)單克隆抗體以及熒光鍵合化學(xué)的制備、提純、應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)室之間存在校大誤差。假陽(yáng)性問(wèn)題是低濃度CTCs鑒定的首要問(wèn)題。
(1-5)外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲、富集、鑒定技術(shù)現(xiàn)況評(píng)估 鑒定外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的先決條件是捕獲后生存的CTCs。在此，本申請(qǐng)專利將以捕獲后腫瘤細(xì)胞的存活與否界定當(dāng)前該領(lǐng)域的技術(shù)效果。第一類，即捕獲后存活的腫瘤細(xì)胞技術(shù)。其代表技術(shù)為美國(guó)麻省總醫(yī)院研制，CELLective Dx公司發(fā)展的CTC-Chip，含CTCs的全血在精密控制的層流條件下，流經(jīng)芯片中78,000個(gè)帶抗體的微型柱，使得CTCs與表面化學(xué)鍵合的抗體均勻接觸，免疫識(shí)別后捕獲。CTC-Chip捕獲的生存腫瘤細(xì)胞精度為99％，純度50％。捕獲生存腫瘤細(xì)胞的意義在于提供了進(jìn)一步代謝組、蛋白質(zhì)組、基因組鑒定的基礎(chǔ)。如對(duì)肺癌的表皮細(xì)胞生長(zhǎng)蛋白受體基因突變的測(cè)定。CTC-Chip的鑒定屬于CD45-/DAPI+/CK+的螢光組合測(cè)定，即CD45-陽(yáng)性正常血液白細(xì)胞、DAPI用于DNA含量測(cè)定、CK+表皮細(xì)胞角質(zhì)蛋白陽(yáng)性。CTCs雙電泳法捕獲細(xì)胞的存活率為90％，生存細(xì)胞的鑒定基于蹤跡熒光測(cè)定。此外，還有細(xì)胞密度梯度離心分離及卵巢腫瘤高表述的葉酸鹽受體熒光測(cè)定法。上述三項(xiàng)捕獲富聚生存CTCs技術(shù)目前都還處實(shí)驗(yàn)室發(fā)展階段。第二類，即捕獲后非存活的腫瘤細(xì)胞技術(shù)。目前唯一用于臨床CellSearch技術(shù)基礎(chǔ)為識(shí)別EpCAM的免疫磁珠流體。經(jīng)一系列半自動(dòng)化的處理、分離、清洗后，捕獲為固化死亡的CTCs。其鑒定方法也與CTC-Chip相同CD45-/DAPI+/CK+的熒光組合測(cè)定。與CTC-Chip的主要區(qū)別在于捕獲方式以及CTCs的生存率。免疫磁珠流體還被用于表皮細(xì)胞角質(zhì)蛋白的識(shí)別、捕獲，配之以Ariol掃描鑒定技術(shù)，其研制公司Genetix獲得優(yōu)于CellSearch的結(jié)果。需要指出的是由Adnagen開發(fā)的以EpCAM為基礎(chǔ)的捕獲技術(shù)配之靈敏的RT-PCR檢測(cè)。目前鑒定CTCs的主要方法都局限于CTCs變異中的基因型-表現(xiàn)型，也正是現(xiàn)有捕獲方法需加以多重交叉測(cè)定，以降底CTCs假陽(yáng)性的原因。以識(shí)別表皮細(xì)胞角質(zhì)蛋白的捕獲富聚技術(shù)稱為正向富聚技術(shù)，而對(duì)紅細(xì)胞的選擇性溶血技術(shù)稱為負(fù)向富聚技術(shù)。
2.用于正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描的[18氟]代示蹤劑(PET) PET示蹤劑技術(shù)使得細(xì)胞內(nèi)生化代謝可被直接進(jìn)行觀測(cè)，但無(wú)法區(qū)分示蹤劑及其特定代謝產(chǎn)物的相對(duì)分布及相對(duì)定量用于能量代謝示蹤劑的2’-脫氧-2’-[18氟]-D葡萄糖([18氟]-FDG)、DNA代謝的3’-脫氧-3’-[18氟]代胸腺嘧啶核苷([18氟]-FLT)、抑制參與損壞RNA及DNA合成的5-[18氟]尿嘧啶(5-FU)。由于該三種示蹤劑的共同特點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞吸收后的代謝中間體的磷酸酶化反應(yīng)，帶負(fù)電荷的磷酸根則為串級(jí)質(zhì)譜測(cè)定提供了理想的分子結(jié)構(gòu)特征。本申請(qǐng)專利僅討論進(jìn)入細(xì)胞后抑制進(jìn)一步代謝的標(biāo)記物[18氟]-FDG、[18氟]-FLT及[18氟]-FU。并以FLT為例，進(jìn)行腫瘤細(xì)胞質(zhì)譜鑒定法的演示實(shí)例。作為PET用的放射性同位素18氟將以質(zhì)譜所用的穩(wěn)定同位素氟替代。
(2-1)2’-脫氧-2’-[18氟]-D葡萄糖能量代謝示蹤劑 腫瘤細(xì)胞的低效生“能”機(jī)制導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖較高需求。FDG與普通葡萄糖化學(xué)性質(zhì)相似，可在人體中產(chǎn)生有標(biāo)記的代謝物，并且在人體中存留時(shí)間較長(zhǎng)，便于測(cè)量。正常腦組織、心肌組織、腎臟及膀胱組織由于高糖代謝的需要因而對(duì)FDG攝取較多。其它一些組織如肝臟、肌肉和腸壁由于其糖代謝水平低，則對(duì)FDG的攝取量較少，顯示出的FDG活性水平也較低。作為一種葡萄糖類似物，F(xiàn)DG將為葡萄糖高利用率細(xì)胞所攝取，如腦、腎臟以及癌細(xì)胞。在此類細(xì)胞中，磷酸化過(guò)程將會(huì)阻止葡萄糖以原有的完整形式從細(xì)胞之中釋放出來(lái)。葡萄糖之中的2’位氧是隨后糖酵解所必需。因而，F(xiàn)DG與2-脫氧-D-葡萄糖類似，在細(xì)胞內(nèi)無(wú)法繼續(xù)代謝。因此，在放射性衰變之前，由六碳糖激酶作用所生成的FDG-6-磷酸將不會(huì)發(fā)生糖酵解。[18氟]-FDG的分布情況很好地反映體內(nèi)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和磷酸化的總體信息。不過(guò)，F(xiàn)DG發(fā)生放射性衰變之后，其中的18氟將轉(zhuǎn)變?yōu)?80。而且，在從環(huán)境中獲取一個(gè)H+之后，F(xiàn)DG的衰變產(chǎn)物就變成了葡萄糖-6-磷酸，而其2’位上的標(biāo)記則變?yōu)闊o(wú)害的非放射性重氧。這樣，該衰變產(chǎn)物通常就可以按照普通葡萄糖的方式進(jìn)行代謝。FDA己批準(zhǔn)[18氟]-FDG用于PET以評(píng)估其它技術(shù)持疑的腫瘤病人。[18氟]-FDG雖然靜態(tài)累積于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，但基于“能量代謝”機(jī)理的[18氟]-FDG用于低純度CTCs鑒定時(shí)將導(dǎo)致低撿出率，假陽(yáng)性。穩(wěn)定同位素FDG的代謝磷酸衍生物與相應(yīng)正常代謝磷酸衍生物之比可作腫瘤細(xì)胞的質(zhì)譜鑒定參數(shù)。
(2-2)3’-脫氧-3’-[18氟]代胸腺嘧啶核苷DNA代謝示蹤劑 [18氟]-FLT經(jīng)由細(xì)胞膜核苷輸送蛋白進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而為細(xì)胞介質(zhì)中的TK1對(duì)5’位羥基磷酸化。與[18氟]-FDG類似，3’-脫氧-3’-[18氟]代-胸腺嘧啶核苷-5’-磷酸衍生物僅累積于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，不能參與DNA的合成。需要指出的是DNA的合成涉及兩不同途經(jīng)攝取細(xì)胞外已有的胸腺嘧啶核苷衍生物，即補(bǔ)救合成途經(jīng)；或直接攝取細(xì)胞內(nèi)的尿嘧啶核苷磷酸衍生物，即從頭合成途徑。經(jīng)由細(xì)胞外攝取的[18氟]-FLT水平直接反映了TK1的生化活性。文獻(xiàn)表明，在細(xì)胞生長(zhǎng)周期的S階段，腫瘤細(xì)胞的TK1生化活性通常為正常細(xì)胞的10-20倍。這就為本申請(qǐng)專利提供了鑒定周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞生化特性的基礎(chǔ)。
(2-3)5-[18氟]尿嘧啶DNA及RNA代謝示蹤劑 自1957年以來(lái)，5-FU用于直腸癌，乳腺癌治療。其作用及代謝主要有三途徑其一、5-FU代謝中間體5-氟代-2’-脫氧尿苷-5’-單磷酸抑制胸苷酸合酶；其二、5-氟代尿苷-5’-三磷酸參與損壞RNA的合成；其三、5-氟代-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸參與抑制和損壞DNA的合成。穩(wěn)定同位素5-氟尿嘧啶的代謝磷酸衍生物，與其結(jié)構(gòu)相應(yīng)的正常代謝磷酸衍生物之比可作腫瘤細(xì)胞的質(zhì)譜鑒定參數(shù)。
3.納升電噴霧負(fù)離子源用于四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀 用于正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描的[18氟]放射性示蹤劑，即上所述[18氟]-FDG與[18氟]-FLT，其共同點(diǎn)是代謝中間體不再參與能量代謝和DNA合成。而5-[18氟]FU則抑制、損壞DNA及RNA的合成。細(xì)胞內(nèi)的磷酸化衍生物的累積，為高分辨、高靈敏的質(zhì)譜鑒定提供了有利條件。由此為質(zhì)譜鑒定提供了天然化合物與其結(jié)構(gòu)極類似的人工合成化合物的腫瘤相關(guān)信息，以及有利于質(zhì)譜測(cè)定的磷酸根負(fù)電荷。另一方面，隨蛋白質(zhì)組學(xué)的開拓，采用先進(jìn)精密質(zhì)譜儀對(duì)分折物進(jìn)行離子化，根據(jù)待分折物的分子基團(tuán)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)電場(chǎng)極性后，完成質(zhì)譜鑒定。代謝過(guò)程中產(chǎn)生的負(fù)離子分子導(dǎo)入第一級(jí)四極桿質(zhì)量過(guò)濾器，由待分折化合物的質(zhì)-荷比，選擇性地導(dǎo)入四極桿碰撞離解室，在高純充電氬氣碰撞下，被分折化合物據(jù)其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生碎片裂解。反映特定結(jié)構(gòu)的碎片離子以其攜帶的質(zhì)-荷比在第二級(jí)飛行時(shí)間單元檢測(cè)記錄。對(duì)鑒定CTCs而論，四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀Q-TOF的技術(shù)關(guān)鍵是負(fù)離子源的電離效率，以及飛行時(shí)間單元在低分子量100-500Da的范圍進(jìn)行精密校正。用于PET的[18氟]放射性示蹤劑，可以生命中不存在、抑制代謝的氟的穩(wěn)定同位素[19氟]替代。本申請(qǐng)中涉及的FLT，F(xiàn)DG，5-FU均指非放射性的穩(wěn)定氟代化合物。
一級(jí)質(zhì)譜由四極桿組成，主要起選擇離子的過(guò)濾作用，二級(jí)質(zhì)譜為飛行時(shí)間分折器，是該儀器的主要質(zhì)量分折單元。質(zhì)譜離子源及不同的串級(jí)質(zhì)譜儀還包括A.離子源的電離效率及干擾雜質(zhì)；B.串級(jí)質(zhì)譜儀的質(zhì)譜分辨率及靈敏度。這些離子源包括基質(zhì)扶助激光解吸電離源MALDI，離子噴霧電離源IonSpray，快離子轟擊電離源FIB，快原子轟擊電離源FAB。而串級(jí)質(zhì)譜儀可由以下組成串級(jí)四極桿質(zhì)譜儀，其中的Q3可為離子捕獲質(zhì)譜分折器Iontrap，串級(jí)飛行時(shí)間-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀TOF-TOF，分辨率極高的富利葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀FTICR-MS。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種不受腫瘤異變影響，基于細(xì)胞生長(zhǎng)周期，新穎的質(zhì)譜鑒定法，即腫瘤細(xì)胞增殖周期的黃金鑒定法，簡(jiǎn)稱循環(huán)腫瘤細(xì)胞的質(zhì)譜鑒定法，迄今為止尚未見采用高靈敏、精確質(zhì)譜儀鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞的報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明所提出的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，其特征在于 (1)對(duì)外周血循環(huán)系統(tǒng)中生存腫瘤細(xì)胞的捕獲，捕獲過(guò)程可分為單克隆抗體從大量紅細(xì)胞中識(shí)別極微量的腫瘤細(xì)胞的正富集過(guò)程，還可經(jīng)由降解紅細(xì)胞的負(fù)富集方法，以及過(guò)濾、離心等基于腫瘤細(xì)胞密度、大小的物理分離法； (2)在細(xì)胞培養(yǎng)條件下，迫使所捕獲的生存腫瘤細(xì)胞以補(bǔ)救合成途徑攝取氟代化合物； (3)對(duì)腫瘤細(xì)胞代謝產(chǎn)生并積累于細(xì)胞介質(zhì)中的氟代單磷酸產(chǎn)物進(jìn)行電噴霧負(fù)離子串級(jí)質(zhì)譜鑒定。
為獲得準(zhǔn)確鑒定結(jié)果，首先采用已知糖類化合物在負(fù)電離條件下對(duì)質(zhì)譜儀進(jìn)行校正，進(jìn)而獲取氟代單磷酸產(chǎn)物的分子負(fù)離子以及由此產(chǎn)生的特定負(fù)離子碎片，由該譜圖唯一地確定腫瘤細(xì)胞代謝氟代單磷酸產(chǎn)物。
氟代單磷酸代謝產(chǎn)物與正常代謝的單磷酸代謝產(chǎn)物之比值消除整個(gè)鑒定過(guò)程中的累積誤差，唯一地表征了所捕獲腫瘤細(xì)胞的惡性增殖程度。
氟代化合物，如3’-脫氧-3’-氟代-胸腺嘧啶核苷(FLT)，其磷酸化產(chǎn)物阻礙DNA合成，不參與腫瘤細(xì)胞的代謝，從而累積于細(xì)胞內(nèi)形成有利腫瘤細(xì)胞鑒定的高濃度，提高質(zhì)譜檢測(cè)可靠性，降低或消除假陽(yáng)性。
腫瘤細(xì)胞內(nèi)氟代磷酸衍生物與正常代謝相應(yīng)的磷酸衍生物，二者經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后的細(xì)胞攝取相對(duì)比值，消除測(cè)定過(guò)程中的系統(tǒng)誤差，真實(shí)地反映了細(xì)胞內(nèi)相關(guān)激酶的表達(dá)水平及活性。
串級(jí)質(zhì)譜鑒定法以四極桿-時(shí)間飛行串級(jí)質(zhì)譜儀為例。對(duì)不同檢測(cè)精度，高通量篩選，質(zhì)譜分辨率組合的串級(jí)質(zhì)譜儀還包括碳18反相高效液相色譜偶合四極桿-四極桿串級(jí)質(zhì)譜儀，飛行時(shí)間-飛行時(shí)間串級(jí)質(zhì)譜儀，四極桿-富利葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀。其中作為質(zhì)譜分折器的四極桿可由離子阱替代。
負(fù)離子質(zhì)譜測(cè)定細(xì)胞內(nèi)磷酸化代謝產(chǎn)物，除使用電噴霧負(fù)離子源外，還可由基質(zhì)扶助激光解吸電離源獲得有關(guān)負(fù)離子進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。
以D-(+)-棉子糖及其碎片產(chǎn)物負(fù)離子系列，對(duì)TOF質(zhì)譜分折器的有效飛行距離及有關(guān)磷酸衍生物實(shí)驗(yàn)測(cè)定范圍(100-550Da)進(jìn)行校正。
周血系統(tǒng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離可由精密控制的商品直經(jīng)為8微米的膜分離器進(jìn)行，所得細(xì)胞吸收FLT后，進(jìn)行串級(jí)質(zhì)譜鑒定。
周血系統(tǒng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離還可由商品Ficoll-Paque離心分離獲得，所得細(xì)胞吸收FLT后，進(jìn)行串級(jí)質(zhì)譜鑒定。
周血系統(tǒng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞芯片鑒定為經(jīng)微流控抗體富聚后，再偶合串級(jí)質(zhì)譜儀，于微流控出口引入電噴霧裝置，與串級(jí)質(zhì)譜儀離子源電極形成引導(dǎo)測(cè)定代謝磷酸衍生物的完整裝置。微流控由識(shí)別表皮細(xì)胞特征生物標(biāo)記蛋白的抗體及鉑金電極組成，作為串級(jí)質(zhì)譜儀負(fù)電離電噴霧離子源。
周血系統(tǒng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞可由簡(jiǎn)單的負(fù)向富聚技術(shù)獲取即大量的紅細(xì)胞經(jīng)商品溶劑選擇性地降解、清除。而腫瘤細(xì)胞則附著于膠原蛋白載體，經(jīng)吸收FLT后，進(jìn)行串級(jí)質(zhì)譜鑒定。
單獨(dú)或組合提取捕獲腫瘤細(xì)胞后，相關(guān)淬取磷酸衍生物的溶劑乙腈-水(50％)為最佳高通量測(cè)定溶劑。碳18反相高效液相色譜分離的最佳淬取溶劑為乙腈-水(2％)。其它乙腈替代有機(jī)溶劑，如甲醇，也可取得類似結(jié)果。
所述氟代化合物不限于DNA合成特定的FLT，還包括其它氟代化合物。包括抑制、損壞DNA及RNA合成的5-氟尿嘧啶(5-FU)以及細(xì)胞能量代謝的2’-氟代-2’-脫氧葡萄糖(FDG)。以上三種氟代化合物的單一或組合使用，均可在激酶作用下生成磷酸化代謝產(chǎn)物，遵循本專利規(guī)范的生化原理及基本操作流程，以質(zhì)譜法測(cè)定其磷酸化代謝產(chǎn)物，鑒定腫瘤細(xì)胞。
所述微流控電噴霧離子源，如權(quán)利要求十二所述溶血負(fù)向富聚技術(shù)，權(quán)利要求十四所述三種氟代合物的單一或組合的生化試劑、組合配套構(gòu)成的循環(huán)腫瘤細(xì)胞診斷測(cè)試盒，可用于鄉(xiāng)、縣級(jí)衛(wèi)生所進(jìn)行當(dāng)?shù)伢w外腫瘤普查及建立個(gè)體化腫瘤信息。捕獲腫瘤細(xì)胞由串級(jí)質(zhì)譜中心評(píng)估診斷、治療效果。
本發(fā)明提出的CTCs鑒定基于以下原理A.鑒定基礎(chǔ)為捕獲生存細(xì)胞惡性增殖程度，具體以腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中DNA的合成直接相關(guān)的激酶TK1為例詳述；B.FLT分子結(jié)構(gòu)中3’取代基氟具有穩(wěn)定分子免遭細(xì)胞內(nèi)降解，以及中止進(jìn)一步DNA的合成代謝雙重作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的累積，并由此提高質(zhì)譜鑒定的可靠性，降低CTCs的檢測(cè)假陰性。此外氟具有最小原子半經(jīng)，因此為TK1的理想非天然基質(zhì)；C.FLT-5’-MP的磷酸根所攜帶負(fù)電荷為負(fù)離子質(zhì)譜檢測(cè)提供了電離基團(tuán)及離子特征碎片；D.與天然胸苷-5’-單磷酸(胸苷-5’-MP)衍生物的細(xì)胞攝取比值，消除測(cè)定過(guò)程中的系統(tǒng)誤差，真實(shí)地反映了CTCs增殖過(guò)程中TK1的表達(dá)水平。C.負(fù)離子電噴霧源四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀的高靈敏、高分辨提供了結(jié)構(gòu)確認(rèn)的唯一性，以及對(duì)TK1活性的準(zhǔn)確質(zhì)譜定量。上述基于CTCs惡性增殖的質(zhì)譜鑒定法顯然優(yōu)于FDA認(rèn)可的細(xì)胞生物標(biāo)記物組合鑒定法，即CD45-/DAPI+/CK+的熒光組合鑒定法。
(3-2)質(zhì)譜檢測(cè)FLT-5’-MP衍生物結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì) 穩(wěn)定同位素氟置換3’位的羥基對(duì)本專利發(fā)展的質(zhì)譜測(cè)定方法有以下三點(diǎn)結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)A.防止糖單元從胸苷單元降解，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)FLT的高穩(wěn)定性；B.FLT對(duì)細(xì)胞介質(zhì)TK1的選擇優(yōu)于對(duì)線粒體內(nèi)的TK2，而只有TK1與細(xì)胞增殖期有關(guān)；C.3’-氟取代基團(tuán)阻止了DNA的合成，因此累積于細(xì)胞介質(zhì)中。
(3-3)測(cè)定CTCs的負(fù)離子電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀 所有待分折分子首先需在離子源進(jìn)行電離。對(duì)于測(cè)定CTCs的上述物質(zhì)對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)吸收比值而言，即FLT-5’-MP與相應(yīng)的胸苷-5’-MP的吸收比值。該對(duì)磷酸衍生物帶有負(fù)電荷的磷酸根，在無(wú)需任何添加物，體積比為50％乙腈-水混合液中，直接施與1,600V電壓，用穩(wěn)定的注射泵，于20-100nl/min的流量，經(jīng)由直經(jīng)為10μm的電噴霧針頭于常溫常壓下，形成穩(wěn)定的羽狀電噴霧。帶負(fù)電離子經(jīng)90度角方向的錐形離子入口，于35V電壓下引入第一級(jí)四極桿質(zhì)譜過(guò)濾器。該過(guò)程即特殊的“Z-電噴霧”。中性分子、正離子等雜質(zhì)背景信號(hào)得予改善。本文采應(yīng)同位素12C＝12.0000Da進(jìn)行具有確定元素組成負(fù)離子的m/z的單一同位素質(zhì)量計(jì)算。
(3-4)低分子量負(fù)離子質(zhì)譜儀的校正 由于磷酸化的FDG與FLT均屬于帶負(fù)電荷的小分子。飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀的測(cè)量精度隨溫度以及質(zhì)譜儀內(nèi)部元件表面化合物的沉積而發(fā)生變化。室溫變化1℃通常導(dǎo)致50mDa的測(cè)定誤差。這就要求對(duì)飛行時(shí)間分折器進(jìn)行有效飛行距離以及100-500Da低分子量的負(fù)離子動(dòng)態(tài)范圍進(jìn)行校正。本申請(qǐng)采用木棉塘的負(fù)離子分子及其負(fù)離子碎片完成上述二項(xiàng)校正。上述各型質(zhì)譜儀主要用于生物聚合物的鑒定。如蛋白質(zhì)組學(xué)中對(duì)多肽的氨基酸序列的鑒定，通常以正離子電離方式在較大的分子量范圍測(cè)定，如150-1500Da。而FLT-5’-MP與相應(yīng)的胸苷-5’-MP分子結(jié)構(gòu)及產(chǎn)物碎片負(fù)離子范圍125-323Da小分子范圍內(nèi)。此范圍存在較多的溶劑加合離子的雜質(zhì)干擾，測(cè)量精度也受室溫影響。因此對(duì)串級(jí)Q-TOF的校正極為重要。本申請(qǐng)專利以D-(+)-棉子糖及其碎片產(chǎn)物負(fù)離子糸列，對(duì)TOF的有效飛行距離及上述實(shí)驗(yàn)測(cè)定范圍以三次方程進(jìn)行校正。
本發(fā)明首次提出分離富聚后生存循環(huán)腫瘤細(xì)胞的黃金鑒定法，該方法不受腫瘤細(xì)胞體內(nèi)發(fā)展，轉(zhuǎn)移，手術(shù)，放療及化療過(guò)程中基因型-表現(xiàn)型生物標(biāo)記物變異的影響。以串級(jí)質(zhì)譜儀測(cè)定腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中特征代謝化合物，準(zhǔn)確地反映了腫瘤細(xì)胞增殖周期的惡性程度與外周血正常細(xì)胞的本質(zhì)區(qū)別。



圖1是串級(jí)質(zhì)譜測(cè)定腫瘤細(xì)胞DNA增殖原理示意圖。
圖中通過(guò)DNA補(bǔ)救合成途徑進(jìn)入細(xì)胞介質(zhì)的高濃度FLT，在胸苷激酶(TK1)作用下生成FLT-5’-MP洐生物。并進(jìn)一步與其DP洐生物，TP洐生物，且形成動(dòng)態(tài)平衡。但以MP洐生物為主要成份(70％)。由于氟在戊糖3’位取代，DNA合成由此中斷，導(dǎo)致FLT-5’-MP洐生物累積于細(xì)胞內(nèi)。而胸苷激酶在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)周期的G1/S階段合成上升可達(dá)10至20倍，作為酶基質(zhì)磷酸化的FLT-5’-MP洐生物唯一地表征腫瘤的惡性增殖程度。同時(shí)帶負(fù)電的磷酸根為負(fù)電子噴霧串級(jí)質(zhì)譜的測(cè)定提供了高靈敏結(jié)構(gòu)測(cè)定基礎(chǔ)。
圖2是腫瘤細(xì)胞鑒定的特異性結(jié)構(gòu)圖。
圖中細(xì)胞增殖周期S階段高表達(dá)胸苷激酶(TK1)對(duì)戊糖5’的磷酸化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物FLT-5’-MP相對(duì)于胸苷-5’-MP的標(biāo)準(zhǔn)化吸收比值唯一地表征了腫瘤細(xì)胞的增殖屬性。FLT-5’-MP洐生物與正常代謝的胸苷-5’-MP洐生物分子濃度標(biāo)準(zhǔn)化吸收比值消除實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差，唯一地反映腫瘤細(xì)胞增殖的生化特征。
圖3是用于校正質(zhì)譜儀的D-(+)-棉子糖及其碎片產(chǎn)物負(fù)離子系列計(jì)算值圖。
圖中分子負(fù)離子計(jì)算值，[M-H]＝503.1612，根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值用于TOF分折器的有效飛行距離的校正。并以其碎片負(fù)離子于實(shí)驗(yàn)100-550Da測(cè)定范圍內(nèi)進(jìn)行三次方程對(duì)質(zhì)譜儀進(jìn)行校正。
圖4是FLT-5’-MP的分子結(jié)構(gòu)負(fù)離子裂解機(jī)理圖。
圖中分子負(fù)離子m/z＝323.04；胸腺嘧啶負(fù)離子m/z＝125.05；3’-氟代-脫氧核糖-5’-單磷酸負(fù)離子m/z＝197.03；以及由m/z＝197.03失去中性分子HF(20Da)的脫氧核糖-5’-單磷酸負(fù)離子m/z＝177.02。
圖5是乳腺癌細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP的質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)值圖。
圖中實(shí)驗(yàn)值m/z 323.00及m/z 321.16表明質(zhì)量差為2Da表明FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP的分子負(fù)離子，此為該對(duì)分子結(jié)構(gòu)的第一判斷。帶有結(jié)構(gòu)確認(rèn)的碎片負(fù)離子3’-脫氧-3’-氟代-核糖-5’-單磷酸負(fù)離子與相應(yīng)的脫氧核糖-5’-單磷酸負(fù)離子對(duì)的實(shí)驗(yàn)測(cè)定質(zhì)分別為m/z 196.96與m/z 194.99，該對(duì)碎片負(fù)離子進(jìn)一步確定核糖-3’位上取代基的質(zhì)量差別(2Da)19氟(19Da)與羥基(17Da)。碎片負(fù)離子m/z 176.98是由3’-脫氧-3-氟代-核糖-5’-單磷酸負(fù)離子(m/z 196.96)失去中性分子HF(20Da)以及脫氧核糖-5’-單磷酸負(fù)離子失去中性分子H2O(18Da)的共同結(jié)果。碎片負(fù)離子m/z 125.02為FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP分子結(jié)構(gòu)的共同特征，即胸腺嘧啶負(fù)離子，與核糖3’取代基無(wú)關(guān)。
圖6是乳腺癌細(xì)胞與正常人體全血細(xì)胞對(duì)FLT的吸收對(duì)比示意圖。
Y軸FLT-5’-MP洐生物與正常代謝的胸苷-5’-MP洐生物分子吸收比值；X軸細(xì)胞培養(yǎng)液中FLT的濃度測(cè)定范圍。FLT的補(bǔ)救合成及代謝產(chǎn)物由TK1的表達(dá)控制，即與細(xì)胞增殖惡性程度相關(guān)。
圖7是乳腺癌細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP的吸收比值示意圖。
圖中累積于細(xì)胞內(nèi)的FLT-5’-MP相對(duì)于胸苷-5’-MP的比值達(dá)70，為正常全血細(xì)胞比值(約0.5)的上百倍。從而降低循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定的假陽(yáng)性。
圖8是單克隆抗體芯片與串級(jí)質(zhì)譜儀對(duì)接示意圖。
圖中新穎結(jié)構(gòu)部件1，孔徑0.22微米芯片出口膜過(guò)濾器、2聯(lián)接芯片鉑金電極，PicoTip噴霧發(fā)射針及芯片出口毛細(xì)管采用死體積為零的T型聚四氟乙烯三通、3，PicoTip噴霧發(fā)射針內(nèi)徑為10微米，在20-75納升/分鐘流量，室溫，1,600伏電壓條件下，乙腈-水(50％)形成羽狀電噴霧，無(wú)需氮?dú)廨o助。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果。
實(shí)施例1細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)譜定性 將ATCC獲取的乳腺癌細(xì)胞MCF-7置于含有10％的牛胎血清RPMI1640培養(yǎng)液中。培養(yǎng)箱空氣二氧化碳的含量為5％，溫度37℃。每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)液，當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)70％的單細(xì)胞融合度后，細(xì)胞培養(yǎng)更換為分別含F(xiàn)LT濃度為0.01，0.05，0.1，0.5，1，1.5mM的培養(yǎng)液。細(xì)胞于溫度37℃下攝取FLT，時(shí)間1小時(shí)。以PBS清洗細(xì)胞后，加入0.05％胰蛋白酶并保持于37℃約10分鐘。于5000g離心2分鐘回收脫落細(xì)胞，并將底部細(xì)胞小餅重懸浮于1ml的PBS中，輕微震蕩清洗后置于1.5ml的erppendorf離心管中。重復(fù)PBS清洗、5000rpm離心回收三次。加入體積比為50％乙腈-水細(xì)胞溶解液100微升于細(xì)胞小餅中，激烈震蕩5秒后，置于超聲波2分鐘。細(xì)胞經(jīng)三次-78℃深凍與4℃解凍后，于14,000rpm離心2分鐘，回收上層清洗并經(jīng)孔徑為0.22微米膜過(guò)濾。另一方面，于EDTA收集管采集的健康自愿者的全血100微升用于以上不同濃度FLT的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。經(jīng)處理的乳腺癌細(xì)胞及全血FLT攝取直接用于串級(jí)Q-TOF定性定量測(cè)定。
FLT對(duì)DNA合成過(guò)程的抑制機(jī)理參見圖-1。作為DNA合成的基本單元，胸苷-5’-MP衍生物可由細(xì)胞內(nèi)脫氧尿苷單磷酸在胸苷酸合酶作用下獲得，即細(xì)胞內(nèi)從頭合成途徑；或者攝取細(xì)胞外胸苷的補(bǔ)救合成途徑。作為磷酸基團(tuán)施主的ATP，其細(xì)胞內(nèi)具較高的mM水平的生理濃度，因此，本專利采用磷酸基團(tuán)受主濃度為1mM的FLT作為對(duì)CTCs測(cè)定。以期取得對(duì)極少量CTCs達(dá)到更靈敏的檢測(cè)極限。圖-2表明細(xì)胞增殖周期S階段高表達(dá)激酶TK1對(duì)戊糖5’的磷酸化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物FLT-5’-MP的理論計(jì)算為m/z＝323.04，胸苷-5’-MP的理論計(jì)算為m/z＝321.05。該對(duì)化合物的標(biāo)準(zhǔn)化吸收比值唯一地表征了腫瘤細(xì)胞的增殖屬性。獲得對(duì)細(xì)胞內(nèi)該對(duì)化合物的精確測(cè)定之前，需要以D-(+)-棉子糖對(duì)串級(jí)質(zhì)譜儀在小分子負(fù)離子范圍內(nèi)進(jìn)行校正。D-(+)-棉子糖的負(fù)電離碎片產(chǎn)物的單一同位素計(jì)算值參見圖-3，其中負(fù)分子離子m/z＝503.1612，碎片負(fù)離子C6H11O6m/z＝179.0556，碎片負(fù)離子C8H13O7m/z＝221.0661，碎片負(fù)離子C10H19O9m/z＝281.0873，碎片負(fù)離子C12H20O10m/z＝323.0978作為校正內(nèi)標(biāo)。當(dāng)D-(+)-棉子糖的濃度為5ng/μl時(shí)，TOF的有效飛行距離實(shí)測(cè)值為503.161+/-0.05Da。小分子實(shí)驗(yàn)測(cè)定范圍由D-(+)-棉子糖的分子負(fù)離子及電離碎片上述產(chǎn)物糸列的實(shí)測(cè)值與理論計(jì)算值之間的殘余誤差分布小于10mDa作為通過(guò)校正的標(biāo)準(zhǔn)。
經(jīng)校正的質(zhì)譜儀可實(shí)施上述相關(guān)代謝物的測(cè)定。四極桿質(zhì)譜過(guò)濾器根據(jù)負(fù)離子FLT-5’-MP與相應(yīng)的胸苷-5’-MP的質(zhì)-電荷比，導(dǎo)入四極桿碰撞單元。在此由高純氬氣于22V電壓下，與負(fù)離子m/z＝323.04及m/z＝321.05發(fā)生碰撞，形成碎片產(chǎn)物離子。碎片產(chǎn)物離子的信號(hào)強(qiáng)度由第二級(jí)飛行時(shí)間質(zhì)譜分折器準(zhǔn)確測(cè)定。FLT 5’-MP的負(fù)離子系列理論計(jì)算值參見圖-4分子負(fù)離子m/z＝323.04；胸腺嘧啶負(fù)離子m/z＝125.05；3’-氟代-脫氧核糖-5’-單磷酸負(fù)離子m/z＝197.03；以及由m/z＝197.03失去中性分子分子量為20Da的HF，即脫氧核糖-5’-單磷酸負(fù)離子m/z＝177.02。與此負(fù)離子系列相應(yīng)的胸苷-5’-MP結(jié)構(gòu)為脫氧核糖-5’-單磷酸負(fù)離子m/z＝195.03。需要指出的是3’-氟代-脫氧核糖-5’-單磷酸負(fù)離子m/z＝197.03與脫氧核糖-5’-單磷酸負(fù)離子m/z＝195.03的質(zhì)量差為2Da。此2Da的質(zhì)量差由核糖3’位質(zhì)量17Da羥基為質(zhì)量19Da氟原子取代所致。圖-5顯示FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP的質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)測(cè)定值。m/z 323.00及m/z 321.16質(zhì)譜對(duì)表明質(zhì)量差為2Da的FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP的分子負(fù)離子，此為結(jié)構(gòu)確認(rèn)的第一判斷。帶有結(jié)構(gòu)確認(rèn)的碎片負(fù)離子3’-脫氧-3’-氟代-核糖-5’-單磷酸負(fù)離子與相應(yīng)的脫氧核糖-5’-單磷酸負(fù)離子對(duì)的實(shí)驗(yàn)測(cè)定質(zhì)分別為m/z 196.96與m/z 194.99，該對(duì)碎片負(fù)離子進(jìn)一步確定核糖-3’位上取代基的質(zhì)量為2Da差別19氟(19Da)與羥基(17Da)之差。碎片負(fù)離子m/z 176.98是由3’-脫氧-3’-氟代-核糖-5’-單磷酸負(fù)離子(m/z 196.96)失去中性分子HF(20Da)以及脫氧核糖-5’-單磷酸負(fù)離子失去中性分子H2O(18Da)的共同結(jié)果。最后，碎片負(fù)離子m/z 125.02為FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP分子結(jié)構(gòu)的共同特征，即胸腺嘧啶負(fù)離子，與核糖3’取代基無(wú)關(guān)。所有觀測(cè)到的質(zhì)譜特征無(wú)疑證實(shí)FLT在腫瘤細(xì)胞中為TK1在核糖5’羥基發(fā)生磷酸化反應(yīng)。表1為FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP的Q-TOF計(jì)算值與測(cè)定值對(duì)比結(jié)果。
表1.FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP分子結(jié)構(gòu)的Q-TOF串級(jí)質(zhì)譜鑒定 FLT-5’-MP 胸苷-5’-MP 實(shí)施例2細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)譜定量 上述乳腺癌細(xì)胞MCF-7與新鮮采集的健康人體靜脈全血對(duì)FLT的攝取對(duì)比實(shí)驗(yàn)按實(shí)施例1條件進(jìn)行。鑒定CTCs對(duì)FLT的攝取條件的選擇基礎(chǔ)為A，由于ATP mM的細(xì)胞內(nèi)高濃度，因此FLT的培養(yǎng)液濃度上限設(shè)為1.5mM。B，F(xiàn)LT的代謝研究表明FLT攝取于60分鐘達(dá)峰值，并繼續(xù)保持2小時(shí)。C，F(xiàn)LT磷酸洐生物的細(xì)胞內(nèi)分布以FLT-5’-MP為主，約占70％。D，培養(yǎng)液高濃重的FLT有利于“補(bǔ)救合成途徑”，即乳腺癌細(xì)胞中高濃度的TK1。E，F(xiàn)LT-5’-MP并非脫氧核糖核酸酶的良好基質(zhì)化合物，即核糖5’位去磷酸化相對(duì)緩慢。F，F(xiàn)LT-5’-MP的磷酸根負(fù)電荷阻礙其由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外的擴(kuò)散。標(biāo)準(zhǔn)化吸收比值m/z 323.04m/z 321.05，即FLT-5’-MP胸苷-5’-MP的比值表征TK1對(duì)該對(duì)化合物的選擇性及核糖5’位羥基的磷酸化反應(yīng)。表達(dá)了二者在細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)定量關(guān)系FLT-5’-MP于細(xì)胞內(nèi)中止代謝，累積形成高濃度，而胸苷-5’-MP處于正常代謝，保持動(dòng)態(tài)低濃度。FLT的徑由補(bǔ)救合成途徑的凈吸收劑量關(guān)系，此種吸收差異完全由TK1隨腫瘤細(xì)胞的增殖而唯一確定。因此，標(biāo)準(zhǔn)化吸收比值表征了腫瘤細(xì)胞的的增殖程度。本法與FDA批準(zhǔn)的CTCs當(dāng)今流行的腫瘤細(xì)胞熒光組合鑒定法截然不同。乳腺癌細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化吸收比值隨初始劑量為0.001mM的0.6增加到1mM劑量的70，參見圖-6。即兩個(gè)數(shù)量級(jí)的增加。與此相反，新鮮抽取的健康全血細(xì)胞在同樣FLT培養(yǎng)液的條件下，其標(biāo)準(zhǔn)化吸收比值＜1。即正常全血細(xì)胞由TK1支配的補(bǔ)救合成途徑在實(shí)驗(yàn)條件下活性效果幾乎為零。圖-7表明質(zhì)譜測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化吸收比值m/z 322.99m/z 320.98即FLT-5’-MP胸苷-5’-MP的比值準(zhǔn)確靈敏地反映了腫瘤細(xì)胞的惡性程度。
實(shí)施例3循環(huán)腫瘤細(xì)胞溶血反向富聚串級(jí)質(zhì)譜鑒定法 新鮮采集一期乳腺癌病人10毫升靜脈血收集于含EDTA試管中并于8小時(shí)內(nèi)實(shí)施紅細(xì)胞溶血降解。商品氯化銨紅細(xì)胞溶血降解緩沖液組成155mM氯化銨、10mM KHCO3、0.1mM EDTA，pH＝7.4，50毫升。將溶血降解緩沖液預(yù)熱至室溫并置于100毫升離心管中，將收集的2毫升靜脈血加入，上蓋密封。于搖動(dòng)盤上輕盈溶血10分鐘左右。將離心管于室溫下，于300g離心分離5分鐘，去降上層紅色懸浮液。于離心管底部應(yīng)獲得白細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞沉降物，若仍有分層可重復(fù)上述步驟。將沉降物重溶于0.5毫升PBS/EDTA溶液，EDTA的濃度為2mM。加入內(nèi)表面涂有膠原蛋白的96孔細(xì)胞培養(yǎng)皿，于37℃過(guò)夜附著。經(jīng)PBS/EDTA洗滌后，加入含有1mM FLT的RPMI1640培養(yǎng)液0.5毫升，靜置于37℃培養(yǎng)箱1小時(shí)。經(jīng)PBS洗滌，加入體積比為50％乙腈-水細(xì)胞溶解液100微升提取相關(guān)磷酸衍生物。并遵照實(shí)施例1所述進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞串級(jí)質(zhì)譜鑒定。本法選擇性地對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行溶血降解，保留完整的白細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞，即對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行負(fù)向富聚。精密質(zhì)譜測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化吸收比值m/z 323.04m/z 321.05大于5為確診。
實(shí)施例4循環(huán)腫瘤細(xì)胞過(guò)濾分離串級(jí)質(zhì)譜鑒定法 聚碳酸酯(polycarbonate)膜過(guò)濾分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞基于精密加工的膜孔直徑。周血循環(huán)糸統(tǒng)中體積較大的表皮腫瘤細(xì)胞可與體積較小的血液正常細(xì)胞分離。新鮮采集體積為2毫升一期乳腺癌病人全血經(jīng)相同體積PBS/EDTA稀釋后，過(guò)Millipore Isopore商品膜分離器。膜直徑13毫米，孔直徑8微米，8-20％孔徑誤差。稀釋全血可于5分鐘左右通過(guò)分離器，而循環(huán)腫瘤細(xì)胞留于分離器內(nèi)。經(jīng)兩次體積為7.5毫升PBS/EDTA洗滌后，加入含有濃度為1mM FLT的RPMI 1640培養(yǎng)液1毫升，靜置于37℃培養(yǎng)箱1小時(shí)。經(jīng)PBS洗滌并離心分離后，加入1毫升體積比為50％乙腈-水，超聲波2分鐘后置于-80℃。細(xì)胞溶解液徑-80℃深凍4℃解凍后回收于eppendorf離心管，徑14,000rpm離心2分鐘，上層清洗轉(zhuǎn)入另一eppendorf離心管。置于-80℃深凍后，于室溫下Speed-Vac至干。重溶于50微升體積比為50％乙腈-水后，于Q-TOF測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化吸收比值。精密質(zhì)譜測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化吸收比值m/z 323.04m/z 321.05大于5為確診。
實(shí)施例5循環(huán)腫瘤細(xì)胞離心分離串級(jí)質(zhì)譜鑒定法 本方法基于商品化的分離CTCs的產(chǎn)品RosetteSep。將350微升RosetteSep離心液加入新鮮采集體積為7.5毫升一期乳腺癌病人全血，混勻，置于室溫20分鐘。用7.5毫升PBS稀釋后，輕勻。將稀釋后全血均勻置于Ficoll-Paque 50毫升離心管上部，仔細(xì)盡量避免兩者互混。室溫下1200g離心分離20分鐘。離心前關(guān)閉離心機(jī)止動(dòng)剎閘。在Ficoll-Paque與血清界面回收富聚后的腫瘤細(xì)胞，并以1毫升PBS于enppendorf離心管清洗兩次。加入含有濃度為1mM FLT的RPMI 1640培養(yǎng)液1毫升，靜置于37℃培養(yǎng)箱1小時(shí)。經(jīng)PBS 7.5毫升洗滌后。加入1毫升體積比為50％乙腈-水，超聲波2分鐘后置于-80℃。細(xì)胞溶解液徑-80℃深凍4℃解凍后回收于eppendorf離心管，徑14,000rpm離心2分鐘，上層清洗轉(zhuǎn)入另一eppendorf離心管。置于-80℃深凍后，于室溫下Speed-Vac至干。重溶于50微升體積比為50％乙腈-水后，于Q-TOF測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化吸收比值。精密質(zhì)譜測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化吸收比值m/z323.04m/z 321.05大于5為確診。
實(shí)施例6循環(huán)腫瘤細(xì)胞微流控富聚串級(jí)質(zhì)譜鑒定法 改進(jìn)后的微流控芯片及附帶含1mM FLT的RPMI 1640培養(yǎng)液試劑，可用于鄉(xiāng)、縣級(jí)衛(wèi)生所及醫(yī)院腫瘤檢測(cè)的方法，經(jīng)處理后的芯片郵寄至質(zhì)譜中心后，于芯片出口組裝一次性電噴霧裝置進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化吸收比值的測(cè)定。微流控芯片制作結(jié)構(gòu)為改進(jìn)的Adams裝置，優(yōu)點(diǎn)是對(duì)1毫升未經(jīng)處理的一期乳腺癌病人全血經(jīng)37分鐘后完成CTCs的捕獲，該裝置采用嵌入鉑金電極可作為質(zhì)譜儀離子源電極。圖8為識(shí)別EpCAM芯片與串級(jí)質(zhì)譜儀對(duì)接示意圖。其中改進(jìn)后的關(guān)鍵部件包括1，芯片出口孔徑為0.22微米膜過(guò)濾器、2聯(lián)接芯片外鉑金電極，PicoTip噴霧發(fā)射針及芯片出口毛細(xì)管的死體積為零的T型三通、3，PicoTip噴霧發(fā)射針口內(nèi)徑為10微米，在納升/分鐘流量室溫條件下形成羽狀電噴霧，無(wú)需氮?dú)廨o助?；厥崭痪酆蟮哪[瘤細(xì)胞，以PBS(0.5毫升)清洗兩次。通入含有1mM FLT的RPMI 16400.5毫升培養(yǎng)液1小時(shí)。經(jīng)0.5毫升的PBS洗滌后，通入0.5毫升體積比為50％乙腈-水置換PBS，芯片經(jīng)超聲波2分鐘后可進(jìn)行串級(jí)質(zhì)譜儀對(duì)接。本方法在Adams裝置的基礎(chǔ)上，在其微流控芯片出口引入一次性電噴霧裝置(PicoTip emitter，部件號(hào)FS360-20-10-D-20-C7，New Objective，Woburn，MA.USA)。電噴霧裝置為外徑20微米，發(fā)射空心針頭內(nèi)徑為10微米。微流控芯片出口由絕緣塑膠密封。鉑金電極與Q-TOF離子源電極于1,600伏電壓下，形成羽狀電噴霧，從而在高靈敏狀態(tài)下對(duì)帶負(fù)電磷酸化的-FLT-5’-MP與胸苷-5’-MP的標(biāo)準(zhǔn)化吸收比值進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定。精密質(zhì)譜測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化吸收比值m/z 323.04m/z 321.05大于5為確診。
權(quán)利要求
1.一種氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，其特征在于
(1)對(duì)外周血循環(huán)系統(tǒng)中生存腫瘤細(xì)胞的捕獲，捕獲過(guò)程分為單克隆抗體從大量紅細(xì)胞中識(shí)別極微量的腫瘤細(xì)胞的正富集過(guò)程，經(jīng)由降解紅細(xì)胞的負(fù)富集方法，以及過(guò)濾、離心等基于腫瘤細(xì)胞密度、大小的物理分離法；
(2)在細(xì)胞培養(yǎng)條件下，迫使所捕獲的生存腫瘤細(xì)胞以補(bǔ)救合成途徑攝取氟代化合物；
(3)對(duì)腫瘤細(xì)胞代謝產(chǎn)生并積累于細(xì)胞介質(zhì)中的氟代單磷酸產(chǎn)物進(jìn)行電噴霧負(fù)離子串級(jí)質(zhì)譜鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，其特征在于為獲得準(zhǔn)確鑒定結(jié)果，首先采用已知糖類化合物在負(fù)電離條件下對(duì)質(zhì)譜儀進(jìn)行校正，進(jìn)而獲取氟代單磷酸產(chǎn)物的分子負(fù)離子以及由此產(chǎn)生的特定負(fù)離子碎片，由該譜圖唯一地確定腫瘤細(xì)胞代謝氟代單磷酸產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，其特征在于氟代單磷酸代謝產(chǎn)物與正常代謝的單磷酸代謝產(chǎn)物之比值消除整個(gè)鑒定過(guò)程中的累積誤差，唯一地表征所捕獲腫瘤細(xì)胞的惡性增殖程度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，其特征在于氟代化合物，如3’-脫氧-3’-氟代-胸腺嘧啶核苷(FLT)，其磷酸化產(chǎn)物阻礙DNA合成，不參與腫瘤細(xì)胞的代謝，從而累積于細(xì)胞內(nèi)形成有利腫瘤細(xì)胞鑒定的高濃度，提高質(zhì)譜檢測(cè)可靠性，降低或消除假陽(yáng)性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，其特征在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)氟代單磷酸衍生物與正常代謝相應(yīng)的單磷酸衍生物，二者經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后的細(xì)胞攝取相對(duì)比值，消除測(cè)定過(guò)程中的系統(tǒng)誤差，反映細(xì)胞內(nèi)相關(guān)激酶的表達(dá)水平及活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，其特征在于串級(jí)質(zhì)譜鑒定法以四極桿-時(shí)間飛行串級(jí)質(zhì)譜儀為例，對(duì)不同檢測(cè)精度，高通量篩選，質(zhì)譜分辨率組合的串級(jí)質(zhì)譜儀還包括碳18反相高效液相色譜偶合四極桿-四極桿串級(jí)質(zhì)譜儀，飛行時(shí)間-飛行時(shí)間串級(jí)質(zhì)譜儀，四極桿-富利葉變換離子迴旋共振質(zhì)譜儀，其中作為質(zhì)譜分折器的四極桿可由離子阱替代。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，其特征在于負(fù)離子質(zhì)譜測(cè)定細(xì)胞內(nèi)磷酸化代謝產(chǎn)物，除使用電噴霧負(fù)離子源外，還可由基質(zhì)扶助激光解吸電離源獲得有關(guān)負(fù)離子進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，其特征在于以D-(+)-棉子糖及其碎片產(chǎn)物負(fù)離子系列，對(duì)TOF質(zhì)譜分折器的有效飛行距離及有關(guān)磷酸衍生物實(shí)驗(yàn)測(cè)定范圍(100-550Da)進(jìn)行校正。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，其特征在于周血系統(tǒng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離可由精密控制的商品直經(jīng)為8微米的膜分離器進(jìn)行，所得細(xì)胞吸收FLT后，進(jìn)行串級(jí)質(zhì)譜鑒定。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，其特征在于周血系統(tǒng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離還可由商品Ficoll-Paque離心分離獲得，所得細(xì)胞吸收FLT后，進(jìn)行串級(jí)質(zhì)譜鑒定。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，其特征在于周血系統(tǒng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞芯片鑒定為經(jīng)微流控抗體富聚后，再偶合串級(jí)質(zhì)譜儀，于微流控出口引入電噴霧裝置，與串級(jí)質(zhì)譜儀離子源電極形成引導(dǎo)測(cè)定代謝磷酸衍生物的完整裝置。微流控由識(shí)別表皮細(xì)胞特征生物標(biāo)記蛋白的抗體及鉑金電極組成，作為串級(jí)質(zhì)譜儀負(fù)電離電噴霧離子源。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，其特征在于周血系統(tǒng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞可由簡(jiǎn)單的負(fù)向富聚技術(shù)獲取即大量的紅細(xì)胞經(jīng)商品溶劑選擇性地降解、清除。而腫瘤細(xì)胞則附著于膠原蛋白載體，經(jīng)吸收FLT后，進(jìn)行串級(jí)質(zhì)譜鑒定。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，其特征在于單獨(dú)或組合提取捕獲腫瘤細(xì)胞后，相關(guān)淬取磷酸衍生物的溶劑乙腈-水(50％)為最佳高通量測(cè)定溶劑，碳18反相高效液相色譜分離的最佳淬取溶劑為乙腈-水(2％)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，其特征在于氟代化合物不限于DNA合成特定的FLT，還包括其它氟代化合物，包括抑制、損壞DNA及RNA合成的5-氟尿嘧啶(5-FU)以及細(xì)胞能量代謝的2’-氟代-2’-脫氧葡萄糖(FDG)，以上三種氟代化合物的單一或組合使用，均在激酶作用下生成磷酸化代謝產(chǎn)物，以質(zhì)譜法測(cè)定其磷酸化代謝產(chǎn)物，鑒定腫瘤細(xì)胞。
全文摘要
一種氟代化合物在鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用方法，它包括對(duì)外周血循環(huán)系統(tǒng)中生存腫瘤細(xì)胞的捕獲，捕獲過(guò)程分為單克隆抗體從大量紅細(xì)胞中識(shí)別極微量的腫瘤細(xì)胞的正富集過(guò)程，經(jīng)由降解紅細(xì)胞的負(fù)富集方法，以及過(guò)濾、離心等基于腫瘤細(xì)胞密度、大小的物理分離法；在細(xì)胞培養(yǎng)條件下，迫使所捕獲的生存腫瘤細(xì)胞以補(bǔ)救合成途徑攝取氟代化合物；對(duì)腫瘤細(xì)胞代謝產(chǎn)生并積累于細(xì)胞介質(zhì)中的氟代單磷酸產(chǎn)物進(jìn)行電噴霧負(fù)離子串級(jí)質(zhì)譜鑒定；本發(fā)明首次提出分離富聚后生存循環(huán)腫瘤細(xì)胞周期的黃金鑒定法，該方法以串級(jí)質(zhì)譜儀測(cè)定腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中特征代謝化合物，準(zhǔn)確地反映了腫瘤細(xì)胞增殖周期的惡性程度與外周血正常細(xì)胞的本質(zhì)區(qū)別。
文檔編號(hào)G01N30/72GK101769930SQ20101003913
公開日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日
發(fā)明者盧小明 申請(qǐng)人:盧小明