在植物或樹木中增強細(xì)胞壁特性的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于在植物中增強細(xì)胞壁特性的方法。該方法包括：將至少一種包含核酸分子的核苷酸構(gòu)建體引入到所述植物中，所述核酸分子與在植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)可操作性連接，其中所述核酸分子編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性的多肽；以及在允許所述核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述植物，從而增強所述植物的細(xì)胞壁特性。
【專利說明】在植物或樹木中增強細(xì)胞壁特性
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及在植物(plant)、多年生植物(perennial plant)或樹木(tree)中增強細(xì)胞壁特性。更特別地，本發(fā)明涉及在植物、多年生植物或樹木中表達(dá)具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)或GolS樣活性的酶，以在植物或樹木中增強細(xì)胞壁特性。
[0002]發(fā)明背景
[0003]對利用可再生生物質(zhì)進(jìn)行生物燃料生產(chǎn)以作為環(huán)境友好且對社會經(jīng)濟負(fù)責(zé)的燃料替代品有增加的興趣。在整個北美，與源自甘蔗的一起，谷物(如玉米)來源的淀粉產(chǎn)生了顯著量的乙醇。雖然已經(jīng)被建立，但是這種生產(chǎn)不太可能是最好的長期策略，因為目前的農(nóng)業(yè)衍生能力不足以持續(xù)生產(chǎn)大量的計劃需求。同樣重要的是，對于用于食品生產(chǎn)的土地使用存在固有的競爭。相比之下，有前途的乙醇來源是豐富的木質(zhì)纖維素原料，包括從林地和農(nóng)業(yè)用地邊緣生產(chǎn)的木材和纖維衍生生物質(zhì)?？梢砸远喾N方式獲得的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)代表了豐富、廉價并且通常在本地可得的原料。
[0004]木質(zhì)纖維素原料在化學(xué)上和結(jié)構(gòu)上比目前使用的物質(zhì)(例如源自甘蔗的可溶性糖或玉米來源的乙醇中的淀粉)更復(fù)雜。木質(zhì)纖維素原料由植物細(xì)胞壁組成，所述細(xì)胞壁包含由纖維素、木質(zhì)素和半纖維素構(gòu)成的化學(xué)連接的聚合物大分子。木質(zhì)原料的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)固有地使這些物質(zhì)抵御分解成可發(fā)酵糖，這由結(jié)晶纖維素微原纖維的緊湊結(jié)構(gòu)，缺乏物質(zhì)孔隙度和存在較高的木質(zhì)素濃度引起(Chang&Holtzapple, 2000AppliedBiochemistry and Biotechnology84-86:5-37)。
[0005]據(jù)估計大約70%的植物生物質(zhì)存在于植物細(xì)胞壁，并且目前僅使用了約2%的基于植物細(xì)胞壁的生物質(zhì)。因此，存在利用該資源作為原材料用于生物燃料生產(chǎn)和作為商業(yè)化學(xué)品的機遇。植物細(xì)胞壁給植物提供機械支持并且有助于植物生長和發(fā)育。碳水化合物、蛋白質(zhì)和酚類化合物(例如木質(zhì)素)是植物細(xì)胞壁中的主要成分，其中纖維素、半纖維素和果膠構(gòu)成了主要的多糖。
[0006]碳水化合物是植物中多種基礎(chǔ)生理事件(例如發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳轉(zhuǎn)運和貯存、細(xì)胞壁合成和脅迫保護(hù))的關(guān)鍵參與者。可轉(zhuǎn)移的可溶性碳水化合物的來源包括蔗糖，以及水溶性棉子糖家族寡糖(raffinose family oligosaccharide, RF0),棉子糖家族寡糖為鹿糖(Suc)的α-1，6半乳糖基延伸，其中最常見的種類為棉子糖(Suc-Gall)、水蘇糖(Suc-Gal2)和毛蕊花糖(Suc-Gal3)。RFO是植物界中最豐富的寡糖，并且許多產(chǎn)生RFO的植物在經(jīng)濟上是重要的。作為非還原性碳水化合物，他們是很好的貯存化合物，其可以大量積累而不影響主要代謝過程。RFO在脅迫耐受中的潛在作用已在種子中廣泛研究，主要與缺水(desiccation)耐受和在脫水狀態(tài)的壽命相關(guān)。此外，在一些植物物種中，已將RFO積累普遍地與非生物脅迫條件(如冷、熱或干旱)相關(guān)。
[0007]US2004 / 0019932 和 US7294756 描述了使用大豆(Glycine max)肌醇半乳糖苷合酶(GolS)改變豆科種子中棉子糖糖類合成，以增強豆科植物的可食用種子的營養(yǎng)品質(zhì)。US5648210公開了來自西葫蘆(zucchini)和大豆的GolS序列以及這些序列改變油菜(Brasica napus)種子中可溶性碳水化合物組成的用途。相比于野生型種子，在轉(zhuǎn)基因種子中觀察到高三倍的肌醇半乳糖苷合酶活性。盡管肌醇半乳糖苷合酶活性的量增加，但是轉(zhuǎn)化的品系中總α-半乳糖苷的含量顯著低于野生型。更特別地，轉(zhuǎn)化的植物表現(xiàn)出棉子糖糖類含量的降低和蔗糖含量的增加。
[0008]發(fā)明概述[0009]本發(fā)明涉及在植物、多年生植物或樹木中增強細(xì)胞壁特性。本發(fā)明還涉及在植物、多年生植物或樹木中改變的水平。更特別地，本發(fā)明涉及在植物、多年生植物或樹木中表達(dá)具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)或GolS樣活性的酶，以在所述植物、多年生植物或樹木中增強細(xì)胞壁特性和/或在所述植物、多年生植物或樹木中改變碳水化合物的水平。
[0010]本發(fā)明提供了用于在植物或樹木中增強細(xì)胞壁特性的方法。所述方法包括:將至少一種包含核酸分子的核苷酸構(gòu)建體引入到植物、樹木或者植物或樹木的一部分中，所述核酸分子與在植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)可操作性連接，其中所述核酸分子編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(Gois)樣活性的多肽；以及培養(yǎng)或在允許所述核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述植物，從而增強所述植物的細(xì)胞壁特性。
[0011]增強細(xì)胞壁特性可以包括增加細(xì)胞壁密度，增加木材密度，減少微原纖維角(microfibril angle),增加應(yīng)拉木(tension wood)形成,增加纖維素含量,改變細(xì)胞壁結(jié)晶度，減少木質(zhì)素含量，改造(modified)半纖維素基質(zhì)，改造果膠基質(zhì)或其組合。
[0012]可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法培養(yǎng)表現(xiàn)出一種或更多種增強的細(xì)胞壁特性和/或改變的細(xì)胞壁性質(zhì)水平和/或改變的碳水化合物水平的植物、多年生植物或樹木用作用于源自木質(zhì)纖維素原料之生物燃料生產(chǎn)的原料。此外，表現(xiàn)出一種或更多種增強的細(xì)胞壁特性和/或改變的碳水化合物水平的植物、多年生植物或樹木可以被培養(yǎng)并用于制漿木材、化學(xué)纖維素和木料生產(chǎn)。此外，具有一種或更多種增強的細(xì)胞壁特性和/或改變的碳水化合物水平的植物、多年生植物或樹木可以被培養(yǎng)并用作用于家畜的食材(foodstuff)。
[0013]此外，本發(fā)明提供了用于改變植物、多年生植物或樹木或者其部分中的碳水化合物水平的方法。所述方法包括:將至少一種包含核酸分子的核苷酸構(gòu)建體引入到植物、樹木或者植物或樹木的一部分中，所述核酸分子與在植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)可操作性連接，其中所述核酸分子編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性的多肽；以及，在允許所述核酸表達(dá)的條件下孵育或培養(yǎng)所述植物，從而改變植物中碳水化合物的水平。改變的碳水化合物水平可以包括總己糖的增加，戊糖的減少或其組合。此外，在過表達(dá)具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性的多肽的植物中，半乳糖和/或葡萄糖的水平可以增加和/或木糖的水平可以降低。
[0014]在本發(fā)明的方法中，當(dāng)與在相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物中確定的相同參數(shù)相比時，細(xì)胞壁密度可以增加約2%至約100%，其中所述在相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物未使用編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性之多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化。此外，在本發(fā)明的方法中，當(dāng)與在相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物中確定的相同參數(shù)相比時，微原纖維角可以減小約2%至約40%，其中所述在相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物未使用編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性之多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明的方法中，當(dāng)與在相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物中確定的相同參數(shù)相比時，木材密度可以增加約2 %至約100%，其中所述在相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物未使用編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性之多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化。此外，在本發(fā)明的方法中，當(dāng)與在相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物中確定的相同參數(shù)相比時，木材密度可以增加約2%至約50%，其中所述木本植物或樹木未使用編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性之多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化。此外，在本發(fā)明的方法中，當(dāng)與在相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物中確定的相同參數(shù)相比時，纖維素含量可以增加約2%至約50%，其中所述在相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物未使用編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性之多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明的方法中，當(dāng)與在相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物中確定的相同參數(shù)相比時，結(jié)晶度(crystallinity)可以改變約2%至約50其中所述在相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物未使用編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性之多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明中，當(dāng)與在相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物中確定的相同參數(shù)相比時，木質(zhì)素含量可以進(jìn)一步降低約2%至約50%，其中所述在相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物未使用編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性之多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化。
[0015]在本方法中，木質(zhì)素單體組成可以改變，從而例如可以改變丁香基(syringyl)與愈創(chuàng)木基(guaiacyl)之間的比率或?qū)αu基苯甲酸酯/鹽(p-hydroxybenzoate)組成。
[0016]在漿和紙、化學(xué)纖維素或生物燃料生產(chǎn)中使用的原料的生產(chǎn)方法包括:提供包含至少一種核苷酸構(gòu)建體的多年生植物，所述核苷酸構(gòu)建體包含與在所述多年生植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作性連接的核酸分子，其中所述核酸分子編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性的多肽；以及在允許所述核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述多年生植物，從而生產(chǎn)所述原料。
`[0017]本發(fā)明的該概述不一定描述本發(fā)明的所有特征。
[0018]附圖簡述
[0019]本發(fā)明的這些和其他特征將從以下說明(其中參照了附圖)中變得更明顯，所述附圖中:
[0020]圖1 示出 Atlg09350 的 cDNA 序列(SEQ ID N0.1)。
[0021]圖2 示出 Atlg09350 的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID N0.2)。
[0022]圖3 示出 Atlg09350 的基因組序列(SEQ ID N0.3)。
[0023]圖4A 示出擬南芥(A.thaliana)GolS2 的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID N0.4)。
[0024]圖4B 示出擬南芥 GolS2 的 mRNA 序列(SEQ ID N0.5)。
[0025]圖5A示出擬南芥GolSl的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID N0.6)。
[0026]圖5B 示出擬南芥 GolSlmRNA 序列(SEQ ID N0.7)。
[0027]圖6A示出AY126715.1 (大豆肌醇半乳糖苷合酶mRNA) (SEQ ID N0.12)。6B示出AY379783.1 (西葫蘆(Cucurbita pepo)肌醇半乳糖苷合酶(GASl)基因(SEQ ID N0.13)。6C示出 AtGolS3(SEQ ID N0.1)、大豆 AY126715 (SEQ ID N0.12)和西葫蘆 AY379783 (SEQ IDN0.13)的 CLUSTAL ff(l.81)多序列比對。6D 示出 3AtGolS3 (SEQ ID N0.2)。6E 示出大豆GolS (SEQ ID N08)。6F 示出西葫蘆序列(SEQ ID N0.9)。6G 示出 AtGo I S3 (SEQ ID N0.2)、大豆 AY126715(SEQ ID N0.8)和西葫蘆 AY379783 (SEQ ID N0.9)的 CLUSTAL ff(l.81)多序列比對。
[0028]圖7A示出GolS3肌醇半乳糖苷合酶3。7B示出Atlg09350(SEQ ID N0.1)的BLAST檢索。[0029]圖8示出在植物中生物合成肌醇半乳糖苷、棉子糖和水蘇糖的示意圖。
[0030]圖9示出AtGolS3在雜交楊樹韌皮部中的相對表達(dá)2~ (-ACt)的圖。
[0031]圖1OA和IOB示出AtGol53在雜交楊樹四個中組織內(nèi)的相對表達(dá)2~ (-ACt)的圖。在五月齡溫室培養(yǎng)的雜交楊樹的組織中擬南芥肌醇半乳糖苷合酶3基因(AtGolS3)的轉(zhuǎn)錄本量使用式2~(-ACt)表示為相對轉(zhuǎn)錄起始因子5A(TIF5A=參照基因)的表達(dá)。
[0032]圖1IA和Ilb示出在五月齡溫室培養(yǎng)的野生型野生型和AtGolS3轉(zhuǎn)基因雜交楊樹的所選組織中，相比于野生型野生型楊樹，肌醇半乳糖苷合酶過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因楊樹中可溶性肌醇半乳糖苷的圖。示出在五月齡溫室培養(yǎng)的野生型野生型和AtGolS3轉(zhuǎn)基因雜交楊樹的所選組織中肌醇半乳糖苷的濃度。
[0033]圖12A和12B示出在五月齡溫室培養(yǎng)的野生型野生型和AtGolS3轉(zhuǎn)基因雜交楊樹的所選組織中，相比于野生型野生型楊樹，肌醇半乳糖苷合酶過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因楊樹中可溶性myo-肌醇(myo-1nosi tol)的圖。示出在五月齡溫室培養(yǎng)的野生型野生型和AtGolS3轉(zhuǎn)基因雜交楊樹的所選組織中myo-肌醇的濃度。
[0034]圖13A和13B示出在五月齡溫室培養(yǎng)的野生型野生型和AtGolS3轉(zhuǎn)基因雜交楊樹的所選組織中，相比于野生型野生型楊樹，肌醇半乳糖苷合酶過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因楊樹中可溶性棉子糖的圖。示出在五月齡溫室培養(yǎng)的野生型野生型和AtGolS3轉(zhuǎn)基因雜交楊樹的所選組織中棉子糖的濃度。
[0035]圖14A和14B示出在五月齡溫室培養(yǎng)的野生型野生型和AtGolS3轉(zhuǎn)基因雜交楊樹的所選組織中，相比于野生型野生型楊樹，肌醇半乳糖苷合酶過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因楊樹中可溶性蔗糖的圖。示出在五月齡溫室培養(yǎng)的野生型野生型和AtGolS3轉(zhuǎn)基因雜交楊樹的所選組織中蔗糖的濃度。
[0036]圖15示出使用已證實的和推定的肌醇半乳糖苷合酶的預(yù)測氨基酸序列構(gòu)建的鄰接樹。15A)和15C)來自楊屬(Populus)的GolS被分為四個進(jìn)化枝a、b、c和d,以及15B)和15D)來自不同植物物種的GolS。對毛果楊(P.trichocarpa)GolS基因提供Phytozome登錄號，對剩下的植物提供GenBank登錄號。系統(tǒng)發(fā)生分析揭示了雜交楊樹酶在生物或非生物脅迫期間的推定作用。
[0037]圖16A-16U 示出 SEQ ID N0.16-37 的序列。
[0038]圖17示出五月齡溫室培養(yǎng)的表達(dá)擬南芥肌醇半乳糖苷合酶3基因(AtGolS3)的轉(zhuǎn)基因楊樹和野生型野生型。
[0039]圖18示出三月齡溫室培養(yǎng)的雜交楊樹的從莖基部到頂點的高度，以及在距莖基部20cm處的直徑的圖。
[0040]圖19示出野生型(A、D)，AtGolS3轉(zhuǎn)基因品系6(B、E)和轉(zhuǎn)基因品系11 (C、F)雜交楊樹的自發(fā)突光(auto-florescence) (A-C)和卡爾科弗盧爾(calcofluor) (D-F)染色。轉(zhuǎn)基因品系顯示用卡爾科弗盧爾染色的纖維素的增加(比例尺:70μπι)。
[0041]圖20示出來自野生型野生型(么、0和6)，AtGolS3轉(zhuǎn)基因品系6(Β、Ε和H)和AtGolS3轉(zhuǎn)基因品系11(C、F和I)雜交楊樹的木質(zhì)部組織的免疫熒光標(biāo)記。組織用抗木聚糖LMlO抗體(A-C)，抗RGI CCRCM7抗體(D-F)和抗甘露聚糖抗體(G-1)標(biāo)記。
[0042]圖21示出溫室培養(yǎng)的野生型野生型和AtGolS3轉(zhuǎn)基因雜交楊樹的細(xì)胞壁木質(zhì)素的 HSQC2D-NMR。[0043]圖22示出溫室培養(yǎng)的野生型野生型和AtGolS3轉(zhuǎn)基因雜交楊樹的細(xì)胞壁多糖異頭區(qū)(Polysaccharide anomeric region)的 HSQC2D-NMR。
[0044]圖23示出五月齡溫室培養(yǎng)的野生型野生型和AtGolS3轉(zhuǎn)基因雜交楊樹的纖維長度和寬度。
[0045]圖24示出來自擬南芥的已知GolS蛋白質(zhì)(AtGolSl和_5)、匍匐筋骨草(Ajugareptans) (ArGolSl 和-2)、水稻(Oryza sativa) (OsGoISI)、甜瓜(Cucumis melo)(CmGolSl)和從銀白楊X大齒楊(P.albaX grandidentata)雜交楊樹分離的兩個GolS蛋白質(zhì)(PaXgGolSI和PaXgGolSII)的推導(dǎo)的氨基酸序列比對。所預(yù)測的兩個同工型(PaXgGolSI和PaXgGolSII)的蛋白質(zhì)序列示出來自其他物種的肌醇半乳糖苷合酶的特征，包括在274位的絲氨酸磷酸化位點和五肽疏水結(jié)構(gòu)域ASAAP。
[0046]發(fā)明詳述
[0047]本發(fā)明涉及在植物或樹木中增強細(xì)胞壁特性。更特別地，本發(fā)明涉及在植物或樹木中表達(dá)具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)或GolS樣活性的酶以在植物或樹木中增強細(xì)胞壁特性。
[0048]本發(fā)明提供了組合物和方法，其通過操控棉子糖寡糖家族(RFO)的產(chǎn)生在植物組織或細(xì)胞(例如木本被子植物和裸子植物)中增強細(xì)胞壁特性。如下更詳細(xì)的描述，在植物或樹木或者其部分中過表達(dá)編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)或GolS樣活性之酶的多核苷酸序列增強植物或樹木的一種或更多種細(xì)胞壁特性?？赏ㄟ^異位表達(dá)GolS增強的一種或更多種細(xì)胞壁特性的實例包括但不限于，與其中不過表達(dá)GolS之植物或樹木的相同或類似細(xì)胞、組織、器官相比時，植物或樹木的細(xì)胞、組織、器官的細(xì)胞壁密度增加，比重(specific gravity)增加，微原纖維角減小，應(yīng)拉木形成增加，纖維素含量增加，纖維素結(jié)晶度改變，木質(zhì)素含量降低，木質(zhì)素單體組成改變例如丁香基與愈創(chuàng)木基比值改變，半纖維素和果膠基質(zhì)改造或其組合。
[0049]肌醇半乳糖苷合酶(Galactinol synthase, G0LS)也被稱為肌醇(inositol) 3- a t_半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，UDP-D-半乳糖:肌醇半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；UDP_半乳糖:myo-肌醇1- a -D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；UDP半乳糖:myo-肌醇1- a -D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；肌醇半乳糖苷合酶；肌醇-α-半乳糖基轉(zhuǎn)移；和尿苷二磷酸半乳糖-肌醇半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(酶數(shù)據(jù)庫編號EC2.4.1.123)。Go IS通過從UDP-D-半乳糖和myo-肌醇可逆地合成肌醇半乳糖苷來催化RFO生物合成的第一步(例如，參見圖8)。肌醇半乳糖苷是更大可溶性寡糖(例如棉子糖，水蘇糖(stachyose)和毛蕊花糖(verbascose))形成的底物。
[0050]當(dāng)多肽具有一個或更多個天然蛋白質(zhì)的性質(zhì)(例如，從UDP-D-半乳糖和myo-肌醇合成肌醇半乳糖苷)時稱其有GolS樣活性。測定從多種來源獲得的蛋白質(zhì)的活性以確定蛋白質(zhì)的性質(zhì)是否相同在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。在這樣做時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用任意多種已知測定，包括例如生物化學(xué)測定。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地產(chǎn)生用GolS多肽變體轉(zhuǎn)化的植物并且測定在該植物材料中天然GolS蛋白質(zhì)的性質(zhì)以確定具體的GolS性質(zhì)是否被所述變體保留。
[0051]因此，本發(fā)明涉及方法和組合物，其用于通過改造GolS或GolS樣酶的活性在植物組織或細(xì)胞或者樹木組織或細(xì)胞(例如木本被子植物和裸子植物細(xì)胞)中增強細(xì)胞壁特性。所述方法涉及將編碼GolS或顯示GolS樣活性之酶的核酸序列引入植物或樹木細(xì)胞或者完整植物或樹木，并且在植物或樹木細(xì)胞中表達(dá)所述核酸序列，從而增強植物或樹木的細(xì)胞壁特性。
[0052]本發(fā)明還提供了在漿和紙、化學(xué)纖維素、實木料(solid lumber)或生物燃料生產(chǎn)中使用的原料的生產(chǎn)方法，其包括，提供包含至少一種核苷酸構(gòu)建體的多年生植物，所述核苷酸構(gòu)建體包含與在所述多年生植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作性連接的核酸分子，其中所述核酸分子編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性的多肽；以及在允許所述核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述多年生植物，從而生產(chǎn)所述原料。
[0053]本發(fā)明還涉及包含核酸分子和由其編碼之多肽的組合物，所述核酸分子包含編碼植物GolS或GolS樣的序列。這些序列可以單獨使用或與其他序列組合，所述其他序列例如但不限于鹿糖合酶(Coleman等,2009, PNAS)和木質(zhì)素生物合成基因或調(diào)節(jié)木質(zhì)化的轉(zhuǎn)錄因子例如阿魏酸 _5_ 輕化酶(ferulate-5-hydroxylase) (Humphreys, Hemm 和 Chappie,2006PNAS ;Franke等，2000Plant Journal ；Huntley et al.,2003Journal of Agricultureand Food Chemistry),其可用于增強細(xì)胞壁特性。本發(fā)明還包括核酸,表達(dá)盒以及包含GolS或GolS樣核苷酸序列的轉(zhuǎn)化載體。所述轉(zhuǎn)化載體可以用于轉(zhuǎn)化植物并表達(dá)增強所轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞壁特性的多肽。還提供了經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以及再生的轉(zhuǎn)基因植物、樹木或其部分以及包含并表達(dá)GolS或GolS樣DNA序列和蛋白質(zhì)產(chǎn)物的種子。
[0054]獲得了從擬南芥分離的編碼GolS的核酸序列(SEQ ID N0:l、5和7)。相應(yīng)的氨基酸序列提供為SEQ ID N0:2、4和6。此外，從楊樹分離了 GolS核酸序列(SEQ ID NO:26-37)。相應(yīng)的氨基酸序列提供為SEQ ID NO:16-25。
[0055]因此，所述核酸可以包含與在植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)可操作連接的核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性的多肽，其中所述多肽由例如SEQ ID NO:2、4、6、16-25、38-45 的序列編碼。
[0056]基于序列比對，可認(rèn)為本發(fā)明涉及的一些特定序列與特定序列相似。當(dāng)序列的至少約 70%或 70-100%或其間任意量(例如 70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100%或其間任意量)的核苷酸在限定核苷酸序列長度上匹配并且編碼顯示GolS活性(從UDP-D-半乳糖和myo-肌醇合成肌醇半乳糖苷)的產(chǎn)物時，序列是相似的。這樣的序列相似性可以使用核苷酸序列比較程序例如DNASIS中提供的程序(使用例如但不限于下列參數(shù):空位罰分5、頂對角線數(shù)5、固定空位罰分10，k元組(k-tuple)2、浮動空位10和窗口大小5)確定。然而，用于比較的其他序列比對方法在本領(lǐng)域是熟知的，例如Smith&ffaterman (1981, Adv.App1.Math.2:482)、Needleman&ffunsch (J.Mol.Biol.48:443,1970)、Pearson&Lipman (1988, Proc.Nat' 1.Acad.Sc1.USA85:2444)的算法，以及通過這些算法的計算機實現(xiàn)形式(GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST，可通過NIH獲得)，或者通過手動比對和目視檢查(參見例如 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等編，1995增刊),或者在嚴(yán)格條件下使用Southern或Northern雜交(參見Maniatis等，Molecular Cloning中(A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory,1982)。優(yōu)選地，基本同源的序列在分子限定長度上顯示至少約80%和最優(yōu)選至少約90%的序列相似性。
[0057]在嚴(yán)格雜交條件下與編碼GolS的核苷酸序列的互補物雜交的核苷酸序列也可被認(rèn)為是相似的，前提是所述序列編碼顯示GolS活性(從UDP-D-半乳糖和myo-肌醇合成肌醇半乳糖苷)的產(chǎn)物。嚴(yán)格雜交條件下雜交在本領(lǐng)域是已知的(參見例如CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel 等編，1995 以及增刊；Maniatis 等，MolecularCloning(A Laboratory Manual)中，Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 ;Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 中，第三版2001 ;各自通過引用并入本文)。這樣的嚴(yán)格雜交條件的一個實例可以為，于4X SSC中在65°C雜交約16-20小時，隨后于0.1X SSC中在65°C洗滌一小時，或于0.1X SSC中在65°C洗滌兩次，每次20或30分鐘?？商娲兀粋€示例性嚴(yán)格雜交條件可以為，于50%甲酰胺、4X SSC中在42°C過夜(16-20小時)，隨后于0.1X SSC中在65°C洗滌一小時，或于0.1X SSC中在65°C洗滌兩次，每次20或30分鐘，或者過夜(16-20小時)，或者在Church水性磷酸鹽緩沖液(7% SDS, 0.5M NaPO4緩沖液pH7.2 ；10mM EDTA)中于65°C雜交，并且在0.1X SSC,0.1 % SDS中于50°C洗滌兩次，每次20或30分鐘，或者于2X SSC,0.1% SDS中在65V洗滌兩次，每次20或30分鐘。
[0058]使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的BLAST算法通過將隨機植物cDNA序列與含有核酸和蛋白質(zhì)序列的公共數(shù)據(jù)庫比較，可以分離和鑒定編碼幾種GolS的至少一部分的核酸片段。本發(fā)明的所述核酸片段可以用于從相同或其它植物物種中分離編碼同源蛋白質(zhì)的cDNA和序列。使用序列依賴性方法分離同源序列在本領(lǐng)域中是公知的。序列依賴性方法的實例包括但不限于核酸雜交法，以及DNA和RNA擴增法，如核酸擴增技術(shù)的多種用途(例如，聚合酶鏈反應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng))。
[0059]編碼其他GolS的核酸序列(無論為cDNA或基因組DNA序列)可以通過使用本文描述的全部或部分核酸片段直接分離。本文所述的核酸序列可以用作雜交探針以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法篩選來自任意期望植物或樹木的文庫。可通過本領(lǐng)域已知的方法設(shè)計并合成基于核酸序列的特異性寡核苷酸探針(Maniatis等，Molecular Cloning (ALaboratory Manual)中)。此外,完整的序列可以通過技術(shù)人員已知的方法(例如隨機引物DNA標(biāo)記、切口平移( nick translation)、末端標(biāo)記技術(shù))直接用于合成DNA探針,或使用體外轉(zhuǎn)錄體系可得的RNA探針。此外，特異性引物可以被設(shè)計并用于擴增本序列的部分或全部。所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物可以在擴增反應(yīng)期間直接標(biāo)記或在擴增反應(yīng)后標(biāo)記，并用作探針在適當(dāng)嚴(yán)格性的條件下分離全長cDNA或基因組片段。
[0060]可以適用于本發(fā)明的核酸或氨基酸序列的非限制性實例列于表1中和序列表中。例如在美國專利7294756和7476778(其整體通過參考并入本文)中也描述了 GolS的同源物。
[0061]
【權(quán)利要求】
1.用于在多年生植物或多年生植物部分中增強細(xì)胞壁特性的方法，其包括 (a)將至少一種核苷酸構(gòu)建體引入所述多年生植物或所述多年生植物部分中，所述核苷酸構(gòu)建體包含與在所述多年生植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作性連接的核酸分子，其中所述核酸分子編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性的多肽； (b)在允許所述核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述多年生植物或所述多年生植物部分，從而增強所述多年生植物或所述多年生植物部分的細(xì)胞壁特性。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞壁特性增強包括細(xì)胞壁密度增加，微原纖維角減小，木材密度增加，纖維素結(jié)晶度改變，應(yīng)拉木形成增加，纖維素含量增加，木質(zhì)素含量減少，木質(zhì)素單體組成改變，半纖維素基質(zhì)改造，果膠基質(zhì)改造或其組合。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述培養(yǎng)步驟后，培養(yǎng)包含所述增強的細(xì)胞壁特性的多年生植物。
4.用于在多年生植物或多年生植物部分中增強細(xì)胞壁特性的方法，其包括: (a)提供包含至少一種核苷酸構(gòu)建體的多年生植物或多年生植物部分，所述核苷酸構(gòu)建體包含與在所述植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作性連接的核酸分子，其中所述核酸分子編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性的多肽； (b)在允許所述核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述多年生植物或所述多年生植物部分，從而增強所述多年生植物或所述多年生植物部分的細(xì)胞壁特性。
5.用于在多年生植物或多年生植物部分中改變碳水化合物水平的方法，其包括 (a)將至少一種核苷酸構(gòu)建體引入所述植物或所述植物部分中，所述核苷酸構(gòu)建體包含與在所述植物中有活性 之調(diào)節(jié)區(qū)可操作性連接的核酸分子，其中所述核酸分子編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性的多肽； (b)在允許所述核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述植物或所述植物部分，從而改變所述植物或所述植物部分中的碳水化合物水平。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中當(dāng)與相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物或植物部分中確定的相同參數(shù)相比時，總己糖水平增加和戊糖水平降低或其組合，其中所述相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物或植物部分未使用編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性之多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化。
7.權(quán)利要求5所述的方法，其中當(dāng)與相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物或植物部分中確定的相同參數(shù)相比時，半乳糖和/或葡萄糖水平增加和/或木糖水平降低，其中所述相同條件下培養(yǎng)的相同物種的植物或植物部分未使用編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性之多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化。
8.通過權(quán)利要求1、4和5中任一項所述的方法產(chǎn)生的多年生植物。
9.權(quán)利要求8所述的植物，其中所述多年生植物是樹木。
10.多年生植物、多年生植物部分或植物細(xì)胞，其包含核酸，所述核酸包含與在植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作性連接的核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性的多肽。
11.權(quán)利要求10所述的多年生植物、植物部分或植物細(xì)胞，其中所述多肽由選自SEQID NO:2、4、6、16-25 和 38-45 的任一序列編碼。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多肽由選自SEQID NO:2、4、6、16-25和38-45的任一序列編碼。
13.原料或食材，其包含權(quán)利要求8或10所述多年生植物、植物部分或植物細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13所述的原料，其用于實木、漿和紙、溶解漿工業(yè)、生物燃料工業(yè)或其組口 O
15.核酸，其包含與在植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作性連接的核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性的多肽，其中所述多肽由選自SEQ ID NO:16-25、38和45的任一序列編碼。
16.用于漿和紙或生物燃料生產(chǎn)的原料的生產(chǎn)方法，其包括， (a提供包含至少一種核苷酸構(gòu)建體的多年生植物，所述核苷酸構(gòu)建體包含與在所述多年生植物中有活性之調(diào)節(jié)區(qū)可操作性連接的核酸分子，其中所述核酸分子編碼具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)樣活性的多肽；以及 (b)在允許所述核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述多年生植物，從而生產(chǎn)所述原料。
【文檔編號】C10G3/00GK103748225SQ201280040984
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月29日
【發(fā)明者】肖恩·D·曼斯菲爾德, 法里德·G·溫達(dá) 申請人:不列顛哥倫比亞大學(xué)